GET3通过MCL1的尾锚定调节细胞凋亡

《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》：GET3 regulates apoptosis via tail-anchoring of MCL1

　　

摘要：BCL2样蛋白MCL1在细胞凋亡和非凋亡功能中起着关键作用。尽管许多BCL2家族成员被预测为尾锚定（tail-anchored, TA）蛋白，但MCL1通过尾锚定蛋白膜插入主要途径——GET通路（guided entry of tail-anchored proteins pathway）进行膜定位的直接证据一直缺乏。研究人员在人类细胞系中使用降解决定子介导的GET3（ASNA1/TRC40）耗竭，揭示了GET3在调节细胞凋亡中的作用。耗竭GET3导致HeLa细胞和非癌性RPE1细胞的细胞周期减慢。然而，GET3缺陷在HeLa细胞中诱导了更显著的毒性，其特征是细胞凋亡增强和克隆形成存活率降低。值得注意的是，MCL1的表达在GET3耗竭时减少，而在GET3过表达时增加，这表明MCL1可能是GET3的TA蛋白货物。此外，研究人员通过C端疏水尾观察到了GET3与MCL1之间的直接相互作用。在功能上，GET3耗竭增强了由MCL1药物抑制触发的细胞凋亡。此外，GET3缺陷促进了MCL1的下调，并加速了长期有丝分裂阻滞期间的细胞凋亡。这些发现强调了GET通路在调节细胞凋亡和MCL1尾锚定中的重要性。

一、 研究背景

破坏微管动力学的药物，如紫杉烷类和长春花生物碱，是传统癌症治疗的基石。这些药物的一个共同特征是诱导长期的有丝分裂阻滞。在有丝分裂阻滞期间或异常有丝分裂退出后发生的后续细胞死亡，对于抗微管药物的有效性至关重要。然而，对长期有丝分裂阻滞的反应在同一细胞系内的细胞之间可能存在显著差异，细胞可能以“有丝分裂滑移”的方式提前退出有丝分裂，也可能在有丝分裂阻滞期间被诱导凋亡。BCL2蛋白家族在有丝分裂细胞死亡背景下特别令人关注，其成员在有丝分裂期间会发生翻译后修饰。其中，抗凋亡蛋白MCL1在有丝分裂阻滞期间的不稳定化可能会将凋亡信号平衡转向利于凋亡的方向。尽管生物信息学预测包括MCL1在内的多个BCL2家族成员是尾锚定蛋白，它们通过C端跨膜结构域锚定在膜上，但缺乏关于MCL1通过GET通路进行膜定位的直接实验证据。此外，由于GET通路在细胞中的不可或缺性，其在细胞凋亡中的参与仍不确定。GET3基因敲除会导致小鼠胚胎致死，这限制了对其功能的深入研究。

二、 研究目的与意义

本研究旨在克服上述局限性，通过结合转录和降解决定子控制的稳健耗竭系统，研究GET3在细胞凋亡中的作用，特别是探究其是否参与调控MCL1的膜定位和稳定性，并阐明这一调控在细胞间期和有丝分裂阻滞期间对细胞命运决定的意义。此项研究揭示了GET通路在凋亡调控中的新作用，为理解MCL1的翻译后调控机制提供了新视角，并可能为靶向癌症细胞存活通路提供新的思路。本论文发表在《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》期刊。

三、 主要技术方法概述

研究人员建立了可诱导的双重基因沉默系统，用于急性、严格地沉默GET3。具体方法是利用CRISPR-Cas9破坏内源性GET3基因，同时通过Sleeping Beauty转座子将受Tet-Off启动子控制的mAID（mini auxin-induced degron）标签GET3 cDNA整合到基因组中以进行功能挽救。通过添加强力霉素（Dox）关闭转录，并使用吲哚-3-乙酸（IAA）将残留蛋白靶向降解，从而实现GET3的条件性耗竭。利用该系统，研究人员分别在HeLa细胞（宫颈癌细胞）和hTERT-永生化的人视网膜色素上皮RPE1细胞（非癌性细胞模型）中建立了单克隆来源的^mAIDGET3^KO细胞系。研究中还运用了免疫印迹、免疫共沉淀、细胞分选、线粒体分离、活细胞成像追踪、流式细胞术、克隆形成实验以及利用MCL1抑制剂（UMI-77、S63845、AZD-5991）进行药物敏感性分析等多种技术手段。细胞周期同步化采用了双胸腺嘧啶阻断法。

四、 研究结果与结论

1. GET3是HeLa细胞增殖所必需的

研究人员建立了高效的^mAIDGET3^KOHeLa细胞系，证实DI处理可在3-9小时内有效耗竭GET3。活细胞成像显示，GET3耗竭在长达72小时内不影响有丝分裂指数、进入时间、持续时间及细胞周期分布，但会导致细胞周期逐渐减慢、细胞死亡持续增加，并最终显著降低长期克隆形成存活率。这表明GET3耗竭会诱导细胞周期逐渐减慢、增加细胞死亡并减弱长期存活能力。

2. GET3耗竭在非癌性RPE1细胞中仅微弱抑制细胞增殖

与HeLa细胞相比，GET3耗竭在RPE1细胞中导致的克隆形成能力下降较轻，且不诱导明显的细胞凋亡（无切割的PARP1和caspase-3）。RPE1细胞表达更高水平的BCL-X_L，但下调BCL-X_L并未使RPE1细胞对GET3耗竭敏感。这些结果表明，GET3耗竭在HeLa细胞中比在RPE1细胞中更具毒性，暗示靶向GET3在非癌细胞中可能具有较低的毒性。

3. MCL1的表达受GET3调控

GET3耗竭导致MCL1蛋白水平特异性降低（约40%），而其他BCL2样蛋白（BCL2、BCL-X_L）不受影响。蛋白酶体抑制剂MG132可稳定MCL1。线粒体组分分析显示，GET3存在于胞质和线粒体组分中，且GET3耗竭后线粒体MCL1减少。外源性表达的MCL1在GET3耗竭时也减少，而过表达GET3可促进MCL1积累并延长其半衰期。这些发现表明MCL1可能是GET通路的TA蛋白货物。同时，其他潜在的GET3货物（如Golgin-84、STX5、UBE2J1）水平也下降。

4. MCL1的C端尾部是与GET3相互作用所必需的

免疫共沉淀实验证实了GET3与MCL1之间存在特异性物理相互作用，而与其他BCL2样蛋白（BCL-W、BCL-X_L、BCL-B、A1）无此相互作用。该相互作用依赖于MCL1的C端跨膜结构域，截去该结构域的MCL1?TM突变体无法与GET3结合。GET3的ATP酶活性对此相互作用非必需，因为野生型和ATP酶失活突变体D74E均能结合MCL1。

5. GET3缺陷增强了由MCL1抑制诱导的凋亡敏感性

在^mAIDGET3^KO细胞中，GET3失活增强了MCL1抑制剂（UMI-77、S63845、AZD-5991）诱导的细胞凋亡，表现为切割的PARP1积累和亚G₁期细胞比例增加。过表达FLAG-MCL1可减弱UMI-77和GET3耗竭共同触发的凋亡。活细胞成像显示，GET3耗竭显著加速了UMI-77诱导的细胞死亡。与单独耗竭MCL1相比，同时耗竭GET3和MCL1导致更高水平的PARP1切割。这些结果表明GET3参与了MCL1依赖的凋亡调控，其耗竭增强了由MCL1抑制或耗竭诱导的凋亡。

6. GET3缺陷促进有丝分裂凋亡

MCL1水平在有丝分裂阻滞期间逐渐下降，而GET3水平相对稳定。同步化实验显示，在长期有丝分裂阻滞期间，GET3缺陷的细胞中MCL1水平更低，PARP1切割更显著，表明凋亡增强。活细胞成像进一步证实，GET3缺陷显著加速了有丝分裂阻滞期间的细胞死亡。这些结果表明，GET3缺陷通过促进MCL1降解，加速了长期有丝分裂阻滞期间的细胞凋亡。

五、 讨论与总结

本研究为GET3通路调控MCL1抗凋亡功能提供了有力证据。首先，与其他GET3的TA蛋白底物类似，GET3耗竭导致MCL1表达降低，而过表达GET3可稳定MCL1，这与GET通路作为TA蛋白分子伴侣的功能一致。其次，MCL1与GET3存在物理相互作用，且该作用依赖于MCL1的C端跨膜区。再者，GET3缺陷促进了细胞凋亡，包括增强了对MCL1抑制剂的敏感性以及加速了有丝分裂阻滞期间的死亡。虽然GET3耗竭在HeLa细胞中导致活力下降，但其细胞周期延迟效应在72小时后才显现，可能是由于现有TA蛋白相对稳定，或存在替代途径进行补偿。有趣的是，GET3耗竭在RPE1非癌细胞中未引起明显的细胞毒性，这与其在全基因组CRISPR筛查中被归类为多数癌细胞系的“常见必需”基因但在RPE1中非必需的结果一致。其潜在机制可能涉及TA蛋白插入的替代途径（如SND途径）的冗余，或癌细胞对GET通路依赖性的差异。

结论：总之，这些发现强调了GET通路在调节细胞凋亡和MCL1尾锚定中的重要性。本研究揭示了GET3在控制MCL1稳态以及间期和有丝分裂阻滞期间凋亡中的主要作用。