山羊CSRP3基因对成肌细胞分化的功能研究

　　

摘要：

【目的】骨骼肌的生长发育是影响羊肉品质的重要因素之一。通过克隆山羊CSRP3（cysteine and glycine rich protein 3）的编码区（coding sequence, CDS）序列，并进行生物信息学分析；探究CSRP3在山羊不同组织、成肌细胞不同分化阶段的表达规律；明确其对成肌细胞分化的调控作用。【方法】采集山羊心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、背最长肌组织，Trizol法提取组织总 RNA 并反转录为 cDNA；以背最长肌组织cDNA为模板，利用RT-PCR扩增CSRP3的CDS序列，运用在线软件进行生物信息学分析；分别以山羊不同组织、不同分化阶段的成肌细胞的cDNA为模板，通过实时荧光定量PCR（qPCR）检测山羊CSRP3基因的mRNA相对表达量；通过过表达载体构建、siRNA 合成和细胞转染试验，利用 qPCR、免疫荧光染色（immunofluorescence，IF）检测过表达和干扰山羊CSRP3后成肌细胞分化标志基因的mRNA相对表达量及肌管的形成情况。【结果】山羊CSRP3全长1 103 bp，CDS序列长 585 bp，系统进化树结果显示，山羊CSRP3与绵羊、牛的亲缘关系最近，提示该基因在近缘物种间具有较高的保守性；山羊CSRP3编码194个氨基酸，其编码的蛋白为亲水性、稳定的碱性蛋白；蛋白互作关系分析表明，山羊CSRP3可能通过与肌肉功能相关蛋白互作参与肌肉生长发育；CSRP3在山羊背最长肌和心肌中的mRNA相对表达量显著高于其他组织（P < 0.05），在成肌细胞分化初期表达量较低，随着分化时间增加mRNA相对表达量逐渐增加，在分化第3天达到峰值（P< 0.01）后下降，呈现出先升高后下降的动态变化，提示山羊CSRP3可能在成肌细胞由增殖向分化的转变中发挥重要调控作用；过表达山羊CSRP3显著提高成肌细胞分化标志基因的mRNA相对表达量和肌管形成，促进成肌细胞分化；反之，干扰山羊CSRP3则显著降低成肌细胞分化标志基因的mRNA相对表达量和肌管形成，抑制成肌细胞的分化能力。【结论】成功克隆山羊CSRP3的CDS序列（克隆序列长603 bp，其中CDS区长度为585 bp），明确其序列特征与理化性质；成功绘制了山羊CSRP3的组织表达谱和时序表达谱；明确了CSRP3对山羊成肌细胞分化具有正向调控作用。初步表明，CSRP3对肉用山羊肌肉生长发育中具有重要生物学功能。