超越复杂层面：肌苷（inosine）驱动了肌苷普拉诺贝克斯（inosine pranobex）的抗病毒及表观遗传效应

《Journal of Applied Genetics》：Beyond the complex: inosine drives the antiviral and epigenetic effects of inosine pranobex

　　摘要

Inosine pranobex（IP）是一种长期使用的抗病毒药物，其作用机制尚未完全明了。然而，其分子效应主要归因于免疫调节作用。有数据表明，IP的细胞活性源自其主要成分肌苷，肌苷在嘌呤代谢、RNA修饰和翻译调控中具有多种作用。我们研究了IP是作为稳定复合物存在，还是其成分的混合物，并比较了肌苷本身和IP在体外的生物学效应。通过成分分析和显微技术研究了IP的结构组成。使用MTT试验、菌落形成法和标记后检测法分别评估了A549和HeLa细胞系中对柯萨奇病毒B3（CVB-3）的细胞毒性、抗病毒活性以及整体DNA甲基化变化。我们发现IP在物理上是异质的，表现为成分的混合物而不是稳定的复合物。在基于细胞的实验中，肌苷表现出比IP更强的抗病毒活性，尤其是在预处理条件下，它能更有效地抵抗CVB-3引起的细胞病变。两种化合物在测试浓度范围内均未显示出显著的细胞毒性。肌苷和IP都影响了整体DNA甲基化水平，但肌苷引起的变化更为明显且依赖于浓度。与IP相比，肌苷在抗病毒和表观遗传活性上的优势表明肌苷是IP生物学效应的主要活性成分。虽然本研究没有评估IP的免疫调节功能，但我们的发现强烈表明肌苷对其抗病毒效果有显著贡献。需要进一步的研究，包括体内模型，以明确这些观察结果背后的表观遗传机制。

引言

Inosine pranobex（IP）是一种长期使用的抗病毒药物，其作用机制尚未完全了解。其分子效应主要归因于免疫调节作用。有数据表明，IP的细胞活性源自其主要成分肌苷，肌苷在嘌呤代谢、RNA修饰和翻译调控中具有多种作用。我们研究了IP是作为稳定复合物存在，还是其成分的混合物，并比较了肌苷本身和IP在体外的生物学效应。通过成分分析和显微技术研究了IP的结构组成。使用MTT试验、菌落形成法和标记后检测法分别评估了A549和HeLa细胞系中对柯萨奇病毒B3（CVB-3）的细胞毒性、抗病毒活性以及整体DNA甲基化变化。我们发现IP在物理上是异质的，表现为成分的混合物而不是稳定的复合物。在基于细胞的实验中，肌苷表现出比IP更强的抗病毒活性，尤其是在预处理条件下，它能更有效地抵抗CVB-3引起的细胞病变。两种化合物在测试浓度范围内均未显示出显著的细胞毒性。肌苷和IP都影响了整体DNA甲基化水平，但肌苷引起的变化更为明显且依赖于浓度。与IP相比，肌苷在抗病毒和表观遗传活性上的优势表明肌苷是IP生物学效应的主要活性成分。虽然本研究没有评估IP的免疫调节功能，但我们的发现强烈表明肌苷对其抗病毒效果有显著贡献。需要进一步的研究，包括体内模型，以明确这些观察结果背后的表观遗传机制。

引言

Inosine pranobex（IP）是一种长期使用的抗病毒药物，其作用机制尚未完全了解。其分子效应主要归因于免疫调节作用。有数据表明，IP的细胞活性源自其主要成分肌苷，肌苷在嘌呤代谢、RNA修饰和翻译调控中具有多种作用。我们研究了IP是作为稳定复合物存在，还是其成分的混合物，并比较了肌苷本身和IP在体外的生物学效应。通过成分分析和显微技术研究了IP的结构组成。使用MTT试验、菌落形成法和标记后检测法分别评估了A549和HeLa细胞系中对柯萨奇病毒B3（CVB-3）的细胞毒性、抗病毒活性以及整体DNA甲基化变化。我们发现IP在物理上是异质的，表现为成分的混合物而不是稳定的复合物。在基于细胞的实验中，肌苷表现出比IP更强的抗病毒活性，尤其是在预处理条件下，它能更有效地抵抗CVB-3引起的细胞病变。两种化合物在测试浓度范围内均未显示出显著的细胞毒性。肌苷和IP都影响了整体DNA甲基化水平，但肌苷引起的变化更为明显且依赖于浓度。与IP相比，肌苷在抗病毒和表观遗传活性上的优势表明肌苷是IP生物学效应的主要活性成分。虽然本研究没有评估IP的免疫调节功能，但我们的发现强烈表明肌苷对其抗病毒效果有显著贡献。需要进一步的研究，包括体内模型，以明确这些观察结果背后的表观遗传机制。

Inosine pranobex（IP）是一种长期使用的抗病毒药物，其作用机制尚未完全了解。然而，其分子效应主要归因于免疫调节作用。有数据表明，IP的细胞活性源自其主要成分肌苷，肌苷在嘌呤代谢、RNA修饰和翻译调控中具有多种作用。我们研究了IP是作为稳定复合物存在，还是其成分的混合物，并比较了肌苷本身和IP在体外的生物学效应。通过成分分析和显微技术研究了IP的结构组成。使用MTT试验、菌落形成法和标记后检测法分别评估了A549和HeLa细胞系中对柯萨奇病毒B3（CVB-3）的细胞毒性、抗病毒活性以及整体DNA甲基化变化。我们发现IP在物理上是异质的，表现为成分的混合物而不是稳定的复合物。在基于细胞的实验中，肌苷表现出比IP更强的抗病毒活性，尤其是在预处理条件下，它能更有效地抵抗CVB-3引起的细胞病变。两种化合物在测试浓度范围内均未显示出显著的细胞毒性。肌苷和IP都影响了整体DNA甲基化水平，但肌苷引起的变化更为明显且依赖于浓度。与IP相比，肌苷在抗病毒和表观遗传活性上的优势表明肌苷是IP生物学效应的主要活性成分。虽然本研究没有评估IP的免疫调节功能，但我们的发现强烈表明肌苷对其抗病毒效果有显著贡献。需要进一步的研究，包括体内模型，以明确这些观察结果背后的表观遗传机制。

Inosine pranobex（IP）是一种长期使用的抗病毒药物，其作用机制尚未完全了解。然而，其分子效应主要归因于免疫调节作用。有数据表明，IP的细胞活性源自其主要成分肌苷，肌苷在嘌呤代谢、RNA修饰和翻译调控中具有多种作用。我们研究了IP是作为稳定复合物存在，还是其成分的混合物，并比较了肌苷本身和IP在体外的生物学效应。通过成分分析和显微技术研究了IP的结构组成。使用MTT试验、菌落形成法和标记后检测法分别评估了A549和HeLa细胞系中对柯萨奇病毒B3（CVB-3）的细胞毒性、抗病毒活性以及整体DNA甲基化变化。我们发现IP在物理上是异质的，表现为成分的混合物而不是稳定的复合物。在基于细胞的实验中，肌苷表现出比IP更强的抗病毒活性，尤其是在预处理条件下，它能更有效地抵抗CVB-3引起的细胞病变。两种化合物在测试浓度范围内均未显示出显著的细胞毒性。肌苷和IP都影响了整体DNA甲基化水平，但肌苷引起的变化更为明显且依赖于浓度。与IP相比，肌苷在抗病毒和表观遗传活性上的优势表明肌苷是IP生物学效应的主要活性成分。虽然本研究没有评估IP的免疫调节功能，但我们的发现强烈表明肌苷对其抗病毒效果有显著贡献。需要进一步的研究，包括体内模型，以明确这些观察结果背后的表观遗传机制。有趣的是，与肌苷共培养24小时但不共培养48小时的A549细胞展现出比对照组更高的存活率。图3。这张图片的替代文本可能是由AI生成的。全尺寸图片。

肌苷普拉诺贝克斯（A）和肌苷（B）对A549细胞存活率的影响在处理后24小时和48小时（平均值±标准差；n=3）。存活率通过MTT测定法确定。肌苷普拉诺贝克斯或肌苷引起与对照组显著不同效果的浓度通过单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计量化，随后进行Bonferroni事后检验（不显著：p>0.05；* p≤0.05；** p≤0.01；*** p≤0.001；**** p≤0.0001）。C - 对照组。

我们还使用菌落形成测定法评估了所研究化合物的慢性细胞毒性（图4）。我们没有观察到在24至192 μg/ml的肌苷浓度范围内或100至800 μg/ml的肌苷普拉诺贝克斯浓度范围内，肌苷或肌苷普拉诺贝克斯对A549细胞系的菌落形成有显著影响。因此，在所研究的浓度范围内，肌苷和肌苷普拉诺贝克斯没有表现出慢性细胞毒性。图4。这张图片的替代文本可能是由AI生成的。全尺寸图片。

肌苷普拉诺贝克斯（A）和肌苷（B）对A549细胞7天后菌落形成的影响（平均值±标准差；n=3）。肌苷普拉诺贝克斯或肌苷引起与对照组显著不同效果的浓度通过单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计量化，随后进行Bonferroni事后检验（不显著：p>0.05；* p≤0.05；** p≤0.01；*** p≤0.001；**** p≤0.0001）。C – 对照组。

为了评估抗病毒活性，我们用肌苷或IP处理了感染了柯萨奇病毒B3（CVB-3，Nancy株）的HeLa细胞，并随后评估了细胞存活率。在治疗前模式下（即细胞在感染前暴露于化合物），观察到两种化合物之间存在显著差异。在这种情况下，肌苷表现出比IP明显更高的保护效果（图5A和6A）。在感染复数（m.o.i.）为0.01时，肌苷将细胞存活率提高到大约60%（图5A），而在m.o.i.为0.025时提高到约50%（图6A），而IP在相同浓度下的相应保护效果仅为10-20%。最大保护效果（平台期）在80 μg/ml的肌苷浓度下观察到（图6A）。

在治疗后模式下（图5B和6B），即在感染后给予化合物时，肌苷和IP显示出相当的保护水平，将细胞存活率分别提高到m.o.i.为0.01时的大约50%（图5B）和m.o.i.为0.025时的30%（图6B）。这种效果的平台期在IP的200 μg/ml浓度和肌苷的48 μg/ml浓度下达到。在非常高的浓度（IP为800 μg/ml，肌苷为192 μg/ml）下，观察到细胞存活率下降，这很可能是由于化合物引起的细胞毒性（图6B）。

重要的是，尽管效果中等，但肌苷和IP在斑块减少测定中都显示出可测量的抗病毒活性。192 μg/ml的肌苷的最大病毒滴度降低幅度约为32.3%，600 μg/ml的IP为63.5%（图7）。尽管如此，肌苷在各种实验条件下始终表现出更强的保护性和抗病毒效果，这支持了肌苷是传统上归因于肌苷普拉诺贝克斯的抗病毒活性的主要活性成分的观点。图5。这张图片的替代文本可能是由AI生成的。全尺寸图片。

肌苷普拉诺贝克斯和肌苷的保护效果。HeLa细胞在接种CVB-3后48小时的存活率（平均值±标准差；n=3）。细胞按照指示与800 μg/ml的肌苷普拉诺贝克斯或192 μg/ml的肌苷共培养24小时，（A）在接种前和接种后，或仅在（B）接种后。肌苷普拉诺贝克斯或肌苷引起与对照组显著不同效果的浓度通过单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计量化，随后进行Bonferroni事后检验（不显著：p>0.05；* p≤0.05；** p≤0.01；*** p≤0.001；**** p≤0.0001）。图6。这张图片的替代文本可能是由AI生成的。全尺寸图片。

HeLa细胞在接种CVB-3后48小时的存活率（平均值±标准差；n=3）。细胞按照指示用逐渐增加浓度的肌苷普拉诺贝克斯和肌苷进行预处理和/或仅后处理（A）。肌苷普拉诺贝克斯或肌苷引起与对照组显著不同效果的浓度通过单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计量化，随后进行Bonferroni事后检验（不显著：p>0.05；* p≤0.05；** p≤0.01；*** p≤0.001；**** p≤0.0001）。C – 对照组。图7。这张图片的替代文本可能是由AI生成的。全尺寸图片。

infected with CVB-3并预先用肌苷普拉诺贝克斯（A）和肌苷（B）处理的HeLa细胞的斑块减少测定。细胞按照指示在接种前24小时与200、400、600和800 μg/ml的肌苷普拉诺贝克斯或48、96、144和192 μg/ml的肌苷共培养（平均值±标准差；n=3）。CVB-3的滴度以斑块形成单位（p.f.u）/ml的相对减少百分比 [%] 表示。肌苷普拉诺贝克斯或肌苷引起与对照组显著不同效果的浓度通过单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计量化，随后进行Bonferroni事后检验（不显著：p>0.05；* p≤0.05；** p≤0.01；*** p≤0.001；**** p≤0.0001）。C – 对照组。

在分析的下一阶段，我们比较了肌苷和肌苷普拉诺贝克斯调节DNA甲基化的能力。我们在用100至800 μg/ml浓度处理24和48小时的A549细胞中量化了5-甲基胞嘧啶（m5C）的全球水平。处理24小时后，100至600 μg/ml浓度的肌苷导致DNA甲基化增加，而在700和800 μg/ml浓度下则减少。相比之下，处理48小时后，肌苷处理在整个浓度范围内导致m5C水平几乎线性下降（图8A）。

IP观察到了类似但不那么明显的模式。处理24小时后，在100–400 μg/ml浓度下检测到DNA甲基化增加，而在较高浓度（500–800 μg/ml）下减少。处理48小时后，IP在100–300 μg/ml浓度下导致DNA甲基化适度上升，然后在高于400 μg/ml的浓度下逐渐下降（图8B）。总体而言，与同等剂量的IP相比，肌苷在DNA甲基化方面的改变更强且更依赖于浓度，这表明肌苷是与肌苷普拉诺贝克斯相关的表观遗传活性的主要成分。这些发现意味着肌苷不仅可以通过代谢或翻译途径影响宿主的抗病毒防御，还可以通过调节病毒感染期间基因表达的表观遗传调控来发挥作用。图8。这张图片的替代文本可能是由AI生成的。全尺寸图片。

肌苷（A）和肌苷普拉诺贝克斯（B）对A549细胞24小时和48小时DNA中5-甲基胞嘧啶（m5C）含量的影响（平均值±标准差；n=3）。肌苷普拉诺贝克斯或肌苷引起与对照组显著不同效果的浓度通过单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计量化，随后进行Bonferroni事后检验（不显著：p>0.05；* p≤0.05；** p≤0.01；*** p≤0.001；**** p≤0.0001）。C – 对照组。

尽管肌苷普拉诺贝克斯（IP）作为抗病毒药物已经广泛使用了半个多世纪，但其确切的作用机制仍未完全阐明。目前的假设主要将其抗病毒特性归因于免疫调节作用，包括刺激细胞因子产生、T淋巴细胞分化和自然杀伤（NK）细胞的激活（C等人，2022年）。然而，也有几项研究表明，IP及其成分可能影响转录和翻译，从而在分子水平上调节病毒复制（Kovachev，2021年）。肌苷是IP的关键成分，已知参与嘌呤生物合成、转录后RNA修饰和翻译过程。体内将腺苷转化为肌苷的酶（脱氨酶）也可以修饰病毒RNA，这在某些情况下已被证明可以减弱病毒的致病性（Srinivasan等人，2021年）。肌苷的广泛生物活性引发了这样一个问题：IP的抗病毒效果有多少可以直接归因于肌苷本身。

我们的物理化学分析揭示了从原材料桶的不同区域以及中间产品（如颗粒和片剂混合物）中提取的IP成分比例存在微小但一致的差异。这种变异性，加上微观证据显示颗粒形态的异质性和溶解度的差异，表明IP更像是一种物理混合物，而不是一个复杂的化合物。这一观察结果支持了IP的生物活性归因于肌苷的假设。体外实验证实，与IP相比，肌苷表现出更强的抗病毒效果。当用肌苷或IP处理感染了柯萨奇病毒B3（CVB-3）的HeLa细胞时，肌苷始终提供了更强的抗病毒保护，特别是在治疗前条件下。在治疗后条件下，两种物质观察到的抗病毒效果相似，这可能表明IP的额外成分可能在病毒进入后影响肌苷的药效行为，从而可能促进其在细胞内的可用性或活性。然而，肌苷在显著较低的浓度（48 μg/ml）下就达到了抗病毒效果的平台期，而IP则需要200 μg/ml的浓度，这强烈支持了肌苷是主要生物活性成分的结论。此外，治疗前和处理后条件之间的观察到的差异与抗病毒研究中的一个公认现象一致，即化合物在感染前存在于细胞中时往往表现出更高的效果，而不是在病毒进入后给药时。这种效应在体外和体内都可以观察到，通常归因于化合物在感染早期阶段就已经存在时，细胞反应更快、更有效（Du等人，2020年；Goncalves等人，2020年）。这些结果与斑块减少测定结果一致，其中肌苷显示出了更明显的病毒传播抑制作用。两种化合物在测试的浓度范围内都表现出低细胞毒性，这一点通过MTT和菌落形成测定得到证实，表明它们的抗病毒活性不是由于非特异性细胞毒性。

这些观察结果的一个可能解释涉及由腺苷脱氨酶（ADARs）介导的腺苷到肌苷（A-to-I）RNA编辑。ADARs对真核RNA的A-to-I编辑是一种普遍的修饰方式，它影响核输出、剪接和翻译准确性（Srinivasan等人，2021年）。虽然已经在某些病毒RNA中观察到与ADAR脱氨酶引起的A-to-I编辑一致的改变，例如麻疹病毒（Cattaneo等人，1988年）、丙型肝炎病毒（Taylor等人，2005年）、淋巴细胞性脑膜炎病毒（Zahn等人，2007年）、副流感病毒（Murphy等人，1991年）、水泡性口炎病毒（O’Hara等人，1984年）和多瘤病毒（Kumar和Carmichael，1997年），但ADARs在病毒感染中的确切作用在大多数情况下仍不清楚。然而，众所周知，ADARs可以根据病毒类型的不同而具有促进或抑制病毒的作用（Samuel，2011年）。鉴于肌苷碱基对是鸟苷而不是腺苷，A-to-I编辑可能通过多种机制影响病毒感染细胞的基因表达和功能，包括mRNA翻译、前mRNA剪接、RNA稳定性、病毒基因组的遗传稳定性以及依赖于RNA结构的活性，如microRNA的产生、靶向或dsRNA与蛋白质的相互作用（Samuel，2011年）。外部给予的肌苷诱导ADAR介导的A-to-I编辑的效果的有效性尚不确定。尽管如此，它暗示了我们研究中观察到的直接抗病毒活性。值得注意的是，游离的脱氧腺苷（dA）可以在体内转化为脱氧肌苷（dI），后者随后可以代谢为 hypoxanthine（Hx）（Grunebaum等人，2013年）。Hx可以进一步转化为脱氧肌苷一磷酸（dIMP），然后通过目前尚未确定的途径转化为脱氧肌苷三磷酸（dITP）（Sakumi等人，2010年）。此外，dATP的自发脱氨是产生dITP的另一种方法。为了防止dITP掺入DNA和RNA，细胞内的dITP浓度通常维持在较低水平（Alseth等人，2014年；Dierick等人，1993年；Myrnes等人，1982年；Sakumi等人，2010年）。尽管ADAR介导的修饰具有高度特异性，但肌苷替代鸟苷掺入病毒DNA和RNA可能产生的改变可能更具损害性。

除了这些转录和翻译效应之外，我们的发现还揭示了表观遗传层面的调节：肌苷和IP都显著影响了A549细胞的整体DNA甲基化水平。肌苷引起的5-甲基胞嘧啶（m5C）水平的变化比IP更强烈且更依赖于浓度，表明它可能是主要的表观遗传活性成分。观察到的双相模式——在中等浓度下初始增加甲基化，然后在较高剂量下减少——表明肌苷可能同时影响DNA甲基转移酶的活性和甲基基团的可用性。因为DNA甲基化是调控抗病毒基因表达和免疫信号通路的关键因素（Morales-Nebreda等人，2019年），这些表观遗传效应可能代表了肌苷调节宿主-病毒相互作用的其他机制。同时，应当考虑到在高浓度下观察到的甲基化减少可能部分反映了早期的细胞应激反应，而不仅仅是特定的调节效应。然而，一些观察结果表明这种效应不能完全归因于细胞毒性应激，因为在治疗范围内，所测试的浓度并未在MTT或菌落形成实验中引起显著的细胞毒性，肌苷引起的甲基化变化遵循一个明确的浓度依赖性模式，而且即使在不会损害细胞活力的浓度下也能检测到这些效应。尽管如此，仍需要进一步的机制研究来确定观察到的表观遗传变化是否反映了特定的调节通路或更广泛的应激相关反应。虽然我们的研究仅限于体外实验，并未包括对免疫调节活性的评估，但这些发现提供了有力的证据，表明肌苷可能在肌苷普拉诺贝克斯（inosine pranobex）的抗病毒和表观遗传作用中起主导作用。未来的体内研究有必要评估肌苷单独使用是否能够在完整的免疫系统背景下复制IP的治疗效果。此外，使用单一的上皮细胞模型也是本研究的另一个局限性，因为它未能充分捕捉到免疫介导的抗病毒反应的复杂性。特别是，淋巴细胞系或原始免疫细胞可以提供关于该化合物免疫调节特性的更多见解，这被认为是其作用机制的重要方面。因此，将这些研究扩展到与免疫相关的细胞系统中是未来研究的一个重要方向。总的来说，这些结果扩展了我们对肌苷普拉诺贝克斯生物学的理解，表明其药理活性源于直接的抗病毒、表观遗传和免疫调节效应的结合。然而，这些结论基于体外观察结果，将其转化为体内条件时应谨慎对待。特别是，细胞培养中使用的浓度可能不反映临床可实现的水平，而且实验模型未能完全捕捉到系统性免疫反应或药代动力学过程（如代谢和组织分布）的复杂性。在更具生理相关性的系统中阐明这些机制之间的相互作用，可能有助于合理设计具有优化抗病毒和免疫调节特性的新型嘌呤基治疗药物。

结论
我们的研究结果表明，肌苷普拉诺贝克斯（IP）很可能是其各个成分的物理混合物，而不是化合物的复杂合物。这一观察促使我们假设传统上归因于IP的抗病毒活性主要来自其肌苷成分。在体外实验中，肌苷显示出了比IP更高的抗病毒活性，支持了这一假设。尽管如此，IP的抗病毒效果通常归因于其免疫调节特性，包括在病毒感染期间刺激细胞因子产生和T细胞活性。除了直接的抗病毒效应外，肌苷和IP都被发现会影响DNA甲基化，这表明它们的作用机制可能涉及基因表达的表观遗传调节。特别是，肌苷引起的5-甲基胞嘧啶水平的变化比IP更强且更依赖于浓度，表明它可能是与该药物相关的表观遗传活性的主要成分。鉴于DNA甲基化在控制抗病毒基因表达、染色质可及性和免疫反应通路中的核心作用，这些发现提出了肌苷可能通过表观遗传机制调节宿主-病毒相互作用的可能性。总的来说，我们的结果为肌苷普拉诺贝克斯的生物活性提供了新的见解，表明肌苷本身可能在其中起主导作用。虽然IP复合物的免疫调节贡献仍有待阐明，但这些发现需要在体内模型中进行进一步研究，以确定肌苷单独使用是否可以复制肌苷普拉诺贝克斯的治疗效果。阐明肌苷的代谢、抗病毒和表观遗传活性之间的相互作用，最终可能有助于开发出更具针对性和高效性的基于嘌呤衍生物的抗病毒策略。

材料与方法
细胞系和培养条件
HeLa（宫颈癌）和A549（肺癌）细胞系购自ATCC（美国组织培养集，马里兰州罗克维尔）。HeLa细胞在DMEM培养基中培养，A549细胞在F-12培养基中培养。每种培养基都添加了10%的胎牛血清（FBS）和10 mg/ml的抗生素（青霉素和链霉素）。细胞在37°C和5% CO2的湿润空气中培养。细胞培养基和其他化学品购自Sigma-Aldrich Chemie GmbH（德国施泰因海姆）和ATCC。细胞培养浓度调整以允许指数生长。
选择A549和HeLa细胞系作为互补的体外模型，以在受控和可复制的条件下评估抗病毒活性。A549细胞来源于人肺泡基底上皮细胞，代表了具有生理相关性的呼吸上皮模型，并因其保留的上皮特性和对感染的反应性而被广泛用于研究病毒感染（Giard等人，1973年；Lieber等人，1976年）。相比之下，HeLa细胞来源于人宫颈上皮癌，是病毒学中的一个经典模型，其特征是生长旺盛、对病毒感染高度敏感以及明确定义的细胞病变反应（Masters，2002年；Scherer等人，1953年）。重要的是，这两种细胞系都允许柯萨奇病毒B3感染，并已被广泛用于研究肠道病毒复制和抗病毒药物筛选（Racaniello，2007年）。使用两种不同的上皮来源细胞系可以在保持实验一致性的同时，验证不同细胞背景下的观察结果。同时，选择这些特征明确且广泛使用的模型可以直接比较肌苷和肌苷普拉诺贝克斯的物理化学和生物学效应，减少变异性并便于解释抗病毒活性。

细胞增殖测定
细胞增殖通过使用3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四唑溴化物（MTT，Xavier等人，2011年）的染色方法进行评估。单层细胞培养物被胰蛋白酶处理并计数。向96孔板的每个孔中加入100μL稀释后的细胞悬液（1×10^4个细胞）。24小时后，当形成部分单层时，向细胞中加入100 μl含有不同化合物浓度的新鲜培养基（肌苷：12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192 μg/ml；肌苷普拉诺贝克斯：50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 μg/ml）。48小时后，冲洗上清液，并向每个孔中加入100 μl含MTT溶液（最终浓度0.5 mg/ml）2小时。孵育时间结束后，通过吸除未反应的染料。将甲酚蓝晶体溶解在100 μl/dwell DMSO中，并在多孔Synergy2板读数器（BioTek Instruments，美国）上以492 nm的测试波长和690 nm的参考波长进行光谱测量。

菌落形成测定
菌落形成测定是一种基于单个细胞生长菌落能力的体外细胞生存测定（Crowley等人，2016年）。定义菌落至少包含50个细胞。该测定本质上测试了种群中每个细胞进行无限分裂的能力。克隆形成测定是确定细胞在接受电离辐射后的复制死亡的方法，但也可用于确定其他细胞毒性剂的有效性。只有部分接种的细胞保留产生菌落的能力。在我们的研究中，A549细胞以每孔500个细胞的密度接种在6孔组织培养板中，并在处理前允许其粘附24小时。细胞用不同浓度的化合物处理（肌苷：12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192 μg/ml；肌苷普拉诺贝克斯：50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 μg/ml）7天。每次处理使用三个重复样本。24小时后，含有处理的培养基被替换为无药物培养基。平板用milliQ水冲洗，菌落用甲醇固定并用1%龙胆紫染色，并在光镜下计数克隆数。

斑块减少和细胞活力测定
斑块减少和细胞活力测定按照标准程序进行（Dutkiewicz等人，2008年）。简而言之，HeLa细胞（人宫颈癌）在DMEM培养基中以单层形式培养。细胞在37°C和5% CO2的湿润气氛中培养。细胞在感染前24小时传代，并在含有相应浓度的肌苷普拉诺贝克斯或肌苷的培养基中孵育（肌苷：12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192 μg/ml；肌苷普拉诺贝克斯：50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 μg/ml）。细胞用CVB-3（Nancy，ATCC编号VR-30）感染，pfu = 4.5×10^7，m.o.i. = 0.025（在大多数实验中）或m.o.i. = 0.005, 0.010, 0.050, 0.100（在依赖于病毒数量的实验中）。对于细胞活力测定，一组细胞样本在感染前后用肌苷普拉诺贝克斯或肌苷处理（预处理模式）。第二组样本在感染后仅用肌苷普拉诺贝克斯或肌苷处理（后处理模式）。使用10% MTT溶液（5 μg/ml）在感染后48小时测定细胞活力，使用多功能板读数器Victor X4（PerkinElmer）。对于斑块减少测定，细胞在感染前用定义浓度的肌苷普拉诺贝克斯或肌苷孵育24小时。感染后立即用三种不同浓度的病毒覆盖细胞。细胞用含有完整生长培养基的0.3%琼脂糖覆盖。细胞用10% MTT溶液（5 μg/ml）染色，并在37°C孵育3天后计数斑块数量。

DNA分离
组织样本中的DNA使用Genomic Mini试剂盒（A&A Biotechnology，波兰格但斯克）分离。首先将组织样本与蛋白酶K孵育，然后与RNase A孵育。离心（15000 rpm，3分钟）后，将上清液施加到迷你柱子上，与柱子结合的DNA用Tris缓冲液pH 8.5洗脱，并在-20°C下储存以供进一步分析。

肌苷和肌苷普拉诺贝克斯处理后的DNA甲基化分析
肌苷和肌苷普拉诺贝克斯新鲜溶解在H2O中，浓度为1 mg/ml。这个贮备液直接加入培养基中（细胞密度为90–95%）。细胞以每孔5×10^5个细胞的密度接种在含有2 ml培养基的6孔板中。24小时后，细胞用PBS洗涤，放入新鲜培养基中，并用不同浓度的肌苷和肌苷普拉诺贝克斯处理（肌苷：12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192 μg/ml；肌苷普拉诺贝克斯：50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 μg/ml）24和48小时。作为对照，细胞仅用H2O处理。化合物处理24–48小时后，细胞用PBS洗涤，用胰蛋白酶处理并通过12,000 rpm离心10分钟收集细胞沉淀物。细胞沉淀物迅速冷冻并在-20°C下储存以用于DNA分离。

DNA甲基化分析
DNA（干燥，1 μg）溶解在含有10 mM CaCl2的琥珀酸缓冲液（pH 6.0）中，并用0.001单位的脾脏磷酸二酯酶II和0.02单位的微球菌核酸酶在3.5 μl总体积中在37°C下消化5小时。0.17 μg的DNA消化产物用1 μCi [γ-32P]ATP（6000 Ci/mmol，Hartmann Analytic GmbH）和1.5单位的T4多核苷酸 kinase（USB，英国）在3 μl含有10 mM MgCl2、10 mM DTT和1 mM spermidine的10 mM bicine-NaOH pH 9.7缓冲液中消化5小时。在37°C下放置0.5小时后，加入3 μl apyrase（10单位/ml）并在同一缓冲液中再孵育0.5小时。3’核苷酸磷酸通过0.2 μg RNase P1在500 mM醋酸铵缓冲液（pH 4.5）中切割。[γ-32P]m5dC的鉴定使用二维薄层色谱（TLC）在纤维素板上进行（Merck，德国达姆施塔特），第一维使用溶剂系统：异丁酸：NH4OH：H2O（66:1:17 v/v），第二维使用0.2 M磷酸钠（pH 6.8）-硫酸铵-正丙醇（100 ml/60 g/2 ml）。随后使用Fluoro Image Analyzer FLA-5100和Multi Gauge 3.0软件（FujiFilm）在492 nm的测试波长和690 nm的参考波长下测量放射性。每次分析重复四次（图9）。为了精确计算，我们不仅评估了m5dC，还评估了其降解产物dC（胞嘧啶）和dT（胸腺嘧啶）。m5C的量计算为R = [(m5dC/m5dC + dC + dT) × 100（Barciszewska等人，2007年；Zukiel等人，2004年）。
使用后标记和TLC方法获得的数据与ELISA测定获得的数据相同（Lewandowska-Gnatowska等人，2014年）。

图9
这张图像的替代文本可能是使用AI生成的。

全尺寸图像
分析基因组DNA中的m5C含量。分离的DNA被水解为3’单核苷酸。此外，这些样本还被标记上了[γ-32P]，其3’端的磷酸基被去磷酸化，并通过二维薄层色谱（TLC）进行分离。色谱图使用富士胶片FLA-5100荧光成像仪进行检测。从未经处理的A549细胞中分离出纯DNA，并将其与肌苷（inosine）和肌苷普拉诺贝克斯（inosine pranobex）共同处理72小时。

**统计分析**
研究结果以平均值加或减标准差（mean ± SD）的形式呈现，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）来评估两个组之间的差异。所有计算和图表均使用Prism 9.0.1软件（GraphPad公司，美国加利福尼亚州拉霍亚市）生成。统计显著性用以下符号表示：无显著性（p > 0.05）；* p ≤ 0.05；** p ≤ 0.01；*** p ≤ 0.001；**** p ≤ 0.0001。