PDL-1表达在宫颈癌患者中的临床意义及预后作用

《Archives of Gynecology and Obstetrics》：Clinical relevance and prognostic role of PDL-1 expression in cervical cancer patients

　　引言
2020年，宫颈癌新增病例604,000例，死亡病例342,000例，在全球范围内按发病率和死亡率计算，宫颈癌是女性中第四大常见恶性肿瘤，在发展中国家发病率最高。在这些地区，预防和筛查计划的推广受到限制，而发达国家在近几十年间宫颈癌的发病率显著下降，目前平均每10万名女性中不到10例[1]。根据2018年FIGO标准[2]确定的诊断分期，宫颈癌的标准治疗方法通常包括手术、化疗和放疗的组合。特别是对于局部晚期疾病（FIGO分期IB3-IVA），标准治疗通常是同步化疗和放疗，或者先进行铂基新辅助化疗，然后再进行根治性手术[3, 4]。然而，许多患者对现有疗法的反应并不理想，且大多数肿瘤在晚期才被诊断出来。免疫疗法的引入改变了多种实体瘤的治疗模式，在宫颈癌中也显示出巨大潜力。PD-1/PD-L1轴通常作为免疫检查点，在感染和炎症反应中调节免疫反应，但肿瘤经常利用这一机制来逃避抗肿瘤免疫反应。这一点在宫颈癌中尤为突出，因为宫颈癌主要与HPV感染相关。在这种情况下，PD-1/PD-L1通路的激活似乎会促进病毒复制，从而促进肿瘤生长。PD-L1的表达在不同恶性肿瘤中差异很大，并与多种预后和临床病理特征相关。此外，它是预测对免疫检查点抑制剂治疗反应的重要标志物，最近的临床试验显示这类抑制剂在宫颈癌中具有良好前景[7]。本研究旨在探讨宫颈癌患者肿瘤细胞和炎症细胞中PD-L1表达与临床病理因素之间的相关性，并研究PD-L1在预测对新辅助化疗（NACT）反应中的作用。

材料与方法
这项回顾性研究纳入了在罗马Umberto I医院妇产科接受治疗的宫颈癌患者。纳入标准包括：
- 组织学确诊的宫颈癌；
- 局部晚期疾病（FIGO分期>IB3）；
- 无新辅助化疗加根治性手术的医学禁忌症；
- 签署知情同意书。
所有患者都接受了全面的临床和影像学评估：妇科检查、治疗前宫颈活检/锥切术、经阴道盆腔超声、腹部盆腔MRI和胸部CT扫描。临床分期按照2018年FIGO分类进行。

治疗前活检样本的苏木精-伊红染色切片由两位经验丰富的病理学家分析，以评估组织类型、分级、炎症浸润的存在及其组成，并通过免疫组化方法量化肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的数量以及PD-L1的表达。TILs的数量以肿瘤基质中单核淋巴细胞所占的百分比表示[8]。特别关注了肿瘤基质中嗜酸性粒细胞的识别。PD-L1的免疫组化分析使用SP263 PD-L1抗体进行，检测在Ventana平台上完成。根据当前指南，宫颈癌中的PD-L1表达通过联合阳性评分（CPS）确定，阳性阈值≥1。此外，我们确定了PD-L1是表达在肿瘤细胞上、免疫细胞上还是同时表达在两者上，并量化了阳性扩展范围。对于肿瘤细胞，任何膜染色（完全或不完全、线性或颗粒状）均视为阳性。对于炎症细胞，任何可检测到的染色都视为阳性。根据CPS结果，患者被分为以下几组：PD-L1阴性（CPS<1）、CPS≥1≤20、CPS>20<70和CPS≥70。评分方法详见表2。根据肿瘤分期，患者接受新辅助化疗加根治性手术（RS，包括根治性子宫切除术和盆腔淋巴结切除术[9]）或化疗放疗（CRT）或姑息性化疗（CT）。

手术后对新辅助化疗的病理反应根据手术标本的病理报告进行评估。病理反应分为：
- 病理完全反应（pCR）：肿瘤细胞完全消失，无论是否有原位癌残余（ypT0/is, ypN0）；
- 病理部分反应（pPR）：肿瘤体积减小，但仍有残留肿瘤细胞；
- 疾病进展（PoD）：肿瘤体积增大和/或出现新的淋巴结转移；
- 稳定疾病（SD）：肿瘤体积相对于治疗前无显著变化。

当地伦理委员会批准了一项名为“局部晚期宫颈癌新辅助化疗临床-病理-放射学参数与反应的相关性：一项回顾性观察研究”的研究（方案0330/2024，参考编号7350）。本文将展示来自一项更大规模临床研究中的宫颈癌患者的小型队列的数据。临床和病理数据被回顾性地收集并进行了统计分析，确定了相关性。治疗前的病理数据与新辅助化疗反应和临床结果进行了相关性分析。统计分析使用SPSS软件（版本27）进行。应用了卡方检验、Fisher精确检验和T检验。显著性水平设为p<0.05。

结果
分析了2017年5月至2022年3月在我们医院治疗的59名患者的数据。研究患者的临床和病理特征总结在表1和表2中。
- 诊断时的平均年龄为54.8岁（范围29–77岁）。组织学分析显示49例（83%）为鳞状细胞癌（SCC），10例（17%）为腺癌（ADC）。
- 36例（61%）的肿瘤基质中检测到TILs，4例（7%）观察到嗜酸性粒细胞。
- 根据免疫组化染色结果，45例（76%）被归类为PD-L1阳性，14例（24%）为阴性。在PD-L1阳性的患者中，19例（42%）的PD-L1主要表达在肿瘤细胞上，26例（58%）表达在免疫细胞上。PD-L1主要表达在肿瘤细胞上的患者平均CPS值较高（平均30.3），而表达在免疫细胞上的患者平均CPS值较低（平均5.28）（p<0.001）。
- PD-L1阳性与患者年龄超过60岁（p=0.036）和妊娠次数较多（p<0.001）显著相关。
- PD-L1阳性与组织学亚型相关：在49例SCC患者中，41例（84%）表达PD-L1，而在10例ADC患者中，6例（60%）表达PD-L1阴性（图1）。此外，较高的CPS值（≥10）与诊断时的高级别（G3）相关（p=0.004）。

PD-L1表达还与治疗前活检样本中TILs的存在显著相关（p<0.001，图2A）。即使根据表2中的评分系统进行分层，这种相关性仍然显著（p<0.001，图2B）。PD-L1表达与治疗前活检样本中TILs的存在也显著相关（p<0.001，图2C）。在PD-L1阳性的患者中，所有对新辅助化疗无反应的患者（SD/PoD）的PD-L1主要表达在炎症细胞上，而PD-L1主要表达在肿瘤细胞上的患者都实现了部分或完全反应（pPR/pCR，图2C）。PD-L1表达与坏死的存在也有关系：免疫细胞中的PD-L1定位与无坏死相关，而肿瘤细胞中的PD-L1定位与坏死相关。无论是否存在坏死，当肿瘤细胞中缺乏PD-L1表达时，总是观察到治疗无反应（SD, PoD，图2D）。

仅PD-L1阳性的患者中观察到嗜酸性粒细胞的存在，尤其是在CPS值显著较高的患者中（p<0.001，图3）。
- 42例（71%）患者接受了基于顺铂和帕克拉替赛的NACT+S治疗，17例（29%）仅分析了主要的临床-病理关联，未探讨PD-L1对新辅助化疗反应的作用。这些患者的主要特征总结在表3中。
- NACT后，31/42患者（74%）实现了部分反应（pPR），3例（7%）实现完全反应（pCR），3例（7%）病情稳定（SD），5例（12%）疾病进展（PoD）。9例（21%）患者淋巴结阳性。
- 在PD-L1状态方面，31例（74%）患者PD-L1阳性，11例（26%）PD-L1阴性。PD-L1表达与治疗后手术标本中TILs的存在显著相关。32例（76%）患者检测到TILs，其中26例（81%）PD-L1阳性。相反，在TILs阴性的患者中，只有4例（40%）表达PD-L1，6例（60%）PD-L1阴性（p=0.012）。
- PD-L1表达与肿瘤浸润深度、淋巴血管间隙侵袭（LVSI）或神经周围侵袭（Pn1）无直接相关性。尽管PD-L1表达与新辅助化疗反应无直接相关性，但不同细胞类型（肿瘤细胞 vs 炎症细胞）上PD-L1表达模式与新辅助化疗反应之间存在显著关联。患者根据病理反应分为有反应（部分或完全反应；pPR/pCR）和无反应（病情稳定或疾病进展；SD/PoD）两组。在31例PD-L1阳性患者中，13例（42%）的PD-L1主要表达在肿瘤细胞上，这些患者都实现了病理反应。其余18例（58%）的PD-L1主要表达在炎症细胞上；其中5例无反应，13例实现了部分或完全反应（pPR/pCR）。因此，所有PD-L1阳性无反应的患者都属于炎症细胞优先表达的亚组，这表明PD-L1在炎症细胞中的定位与新辅助化疗反应较差有关（p=0.039，图2B）。组织学分析进一步显示，大多数PD-L1主要表达在免疫细胞上的患者没有坏死迹象，而在PD-L1表达在肿瘤细胞上的患者中常见坏死（p=0.023，图2C），这也与新辅助化疗反应相关（p=0.025，图2D）。

讨论
近年来，随着免疫疗法在各种癌症治疗中的引入，研究重点转向了PD-1/PD-L1轴，将其确定为宫颈癌治疗中的一个重要靶点。鉴于PD-L1的重要预后和预测价值，评估其在宫颈癌中的作用至关重要，因为它有助于更好地理解肿瘤的生物学行为和治疗管理。
根据文献，本研究表明，宫颈癌中的PD-L1表达与鳞状细胞亚型强烈相关[10]。此外，较高的PD-L1值（定义为CPS≥10，在我们的队列中）与较高的组织学分级（G3对比G1或G2）相关，多项研究已证实这一点[11, 12]。同样，较高的平均CPS值也与年龄较大（>60岁）显著相关[12]。
先前的研究[13]表明，妊娠可能改变女性的免疫状态，尤其是在子宫微环境中，包括宫颈。妊娠期间，包括PD-1/PD-L1轴在内的多种负面免疫调节途径可能被激活，这可能导致宫颈中PD-L1的过度表达。
在我们的研究人群中，PD-L1表达与治疗前活检样本中TILs的存在显著相关。最新研究支持这种关联，并进一步指出TILs的存在可能预示对新辅助治疗的更好反应[14]。值得注意的是，所有对新辅助化疗实现完全病理反应的患者在活检样本中都检测到TILs。

关于肿瘤相关的炎症浸润，主要由T淋巴细胞和巨噬细胞组成。然而，在5%至40%的病例中，炎症浸润还包括嗜酸性粒细胞。这种细胞群的存在可能表明免疫反应不足，原因是Th-2细胞相对于Th-1细胞的数量失衡，导致嗜酸性粒细胞的趋化作用过度增强。Th-1细胞数量的减少也意味着细胞毒性淋巴细胞减少，从而削弱了抗肿瘤反应的效果[15]。在我们的患者中，有7%的人在术前活检样本中表现出富含嗜酸性粒细胞的炎症浸润。令人惊讶的是，这与我们的假设一致，这些患者中没有一个人获得了完全的病理学缓解。此外，所有肿瘤基质中含有嗜酸性粒细胞的患者的PD-L1表达水平（CPS）都很高（平均CPS为43.75）。这些发现表明，即使在新辅助治疗（NACT）的情况下，嗜酸性粒细胞丰富的患者也可能从免疫治疗中受益，尤其是考虑到这一群体对NACT的反应不佳。研究还关注了PD-L1在肿瘤细胞或免疫细胞（巨噬细胞、树突状细胞、T细胞和B细胞）上的分布情况。一个最有趣的发现是基于不同细胞类型中PD-L1分布模式对NACT反应的差异。观察到NACT的病理学反应与免疫细胞中PD-L1表达之间存在负相关，而那些肿瘤细胞中PD-L1表达占主导地位的患者至少部分地对治疗产生了反应。这一发现还得到了进一步的支持：那些免疫细胞中PD-L1表达占主导的患者在NACT后的手术标本中显示出最小的坏死——这是治疗反应的组织病理学标志[16]。我们的结果似乎表明，尽管PD-L1已被认为是这种情况下一个重要的预后和预测生物标志物，但其有效性可能仅取决于CPS值。因此，在评估PD-L1的状态时，不仅需要考虑该生物标志物的表达情况，还需要考虑它在肿瘤细胞或免疫细胞中的定位，因为这似乎与不同的预后结果相关。我们的数据还可能提供有关免疫治疗剂作用的信息；正如文献所示，当PD-L1主要在炎症细胞上表达时，免疫治疗可能效果较差；这一现象的一个潜在解释可能是PD-L1对免疫细胞而非肿瘤细胞的抑制作用[17]。进一步的研究对于验证我们的发现、了解PD-L1在该疾病中的作用、增进我们对疾病消退和进展的生物学机制的理解以及为宫颈癌患者制定更加个性化的治疗方案至关重要。

结论：在本研究中，我们确认了PD-L1在宫颈癌中的重要预后和预测作用，并将其表达与临床参数进行了关联。此外，我们发现了一组嗜酸性粒细胞数量和CPS值较高的病例，这些病例对新辅助化疗的反应较差。最后，我们观察到通过检测不同类型细胞（肿瘤细胞与免疫细胞）中的PD-L1表达可以更好地理解疾病的生物学行为，从而推测某些患者可能对免疫检查点抑制剂有更好或更差的反应，这有助于开发更加个性化的治疗方案。