大豆蛋白和蛋白粉对冻鱼丸（Chirocentrus dorab）在冻融循环过程中的稳定性影响

《Food Production, Processing and Nutrition》：Influence of soy protein and egg white powders on the stability of frozen fish balls (Chirocentrus dorab) during freeze–thaw cycles

　　摘要：在冷冻储存和运输过程中，反复的冻融（FT）循环是常见的现象，这些循环会降低基于鱼糜的产品的结构完整性、持水能力和感官质量。因此，人们提出使用功能性蛋白质粘合剂作为减轻冻融引起的质量损失的有效策略。本研究调查了添加粘合剂对经过五次反复冻融循环的冷冻鱼丸物理化学和感官质量的影响。结果表明，冷冻绞碎的鱼比新鲜鱼的凝胶强度更高（p ≤ 0.05），而亮度（L*）和白度（W）没有显著变化（p > 0.05），这支持了使用冷冻原材料的合理性。添加2%、4%和6%的大豆蛋白（SP）和蛋清（EW）粉末可以减少解冻、离心和烹饪过程中的损失，同时保持弹性、凝聚性和咀嚼性等质地属性。在所有冻融循环中，4%至6%的大豆蛋白都能提高凝胶强度（p ≤ 0.05），尽管6%的大豆蛋白略微降低了L*和W值。2%至4%的蛋清能更好地保持亮度，而6%的两种粘合剂都会增加b*值，表明颜色变黄（p ≤ 0.05）。扫描电子显微镜（SEM）分析显示，反复的冻融循环破坏了含有大豆蛋白或蛋清的鱼丸的内部微观结构，增加了孔隙率和孔径，反映了水分流失和蛋白质基质的分解。总体而言，根据仪器测定的质地评估，4%的大豆蛋白和蛋清粘合剂量被认为是最佳水平，且不会对颜色属性产生不利影响。与大豆蛋白相比，蛋清配方还提高了持水能力，并延缓了总挥发性碱性氮（TVB-N）的积累（p ≤ 0.05）。感官评估证实，经过一次冻融循环后含有4%蛋清的鱼丸获得了最高的偏好分数、消费者接受度（90.74%）和购买意向（79.63%），凸显了蛋清作为提高冷冻鱼丸产品稳定性和市场性的有效粘合剂的实际潜力。

引言：鱼类是许多亚洲国家重要的蛋白质来源，特别是在东南亚地区（Chung等人，1994；Tee & Siow，2017）。许多人喜欢加工鱼类产品，如鱼丸，因为它们方便且营养价值高，同时也会食用新鲜鱼类。然而，鱼丸中的高蛋白质和水分含量使它们容易受到微生物变质以及蛋白质和脂质氧化的影响（Chang等人，2023）。冷冻常用于延长这些产品的保质期，从而缓解质量下降的问题（Li等人，2021；Zhang等人，2024a，b）。不过，冷链物流中的限制可能导致运输、储存和零售过程中的温度波动，从而引发多次冻融循环（Li等人，2019，2022；Olatunde & Benjakul，2018）。冰晶的反复结晶过程会破坏鱼丸的肌肉结构，导致水分流失加剧和微生物繁殖增加。研究表明，冻融循环通过引起肌肉收缩、膜损伤和结构降解来降低产品质量（Ma等人，2021；Sun等人，2023），从而导致水分保持能力、凝胶稳定性和外观吸引力的显著下降（Chen等人，2018；Zhang等人，2017）。此外，冰晶间隙可能会加速基于鱼糜的产品中的有害代谢反应，包括脂质氧化和蛋白质降解（Shi等人，2023；Wu等人，2022；Yang等人，2024）。为了减轻冻融循环造成的损害，食品科学家研究了粘合剂的应用，即添加到鱼糜系统中的蛋白质或多糖基成分，以改善凝胶网络的形成、持水能力和质地稳定性，从而提高鱼丸的质量。研究表明，某些淀粉，如小麦淀粉、土豆淀粉和木薯淀粉，可以增强鱼糜产品的凝胶形成（Tee & Siow，2017）。淀粉在加热过程中施加压缩应力，使膨胀的淀粉颗粒嵌入蛋白质凝胶基质中，从而增强凝胶稳定性（Zhang等人，2023）。在基于鱼的系统中，特别是鱼丸和鱼糜产品中，木薯淀粉已被报道可以在冷冻储存和加工过程中提高持水能力和质地特性（Tee & Siow，2017）。除了多糖粘合剂外，基于蛋白质的粘合剂也受到了越来越多的关注，因为它们能够直接与肌纤维蛋白相互作用并增强凝胶网络。基于大豆蛋白的成分，尤其是大豆蛋白分离物，由于含有高蛋白质、强持水能力和在加热和冷冻储存过程中与鱼肌纤维蛋白形成分子间相互作用的能力，被广泛用于鱼类和肉类产品中。先前的研究表明，大豆蛋白可以增强凝胶强度、提高持水能力，并在寒冷和冻融条件下稳定蛋白质-蛋白质相互作用，从而提高基于鱼糜产品的质地完整性（Zhang等人，2024a，b）。蛋清粉末也被广泛用作功能性粘合剂，主要是因为卵白蛋白和卵黏蛋白在加热时能形成弹性且凝聚的凝胶网络（Li等人，2013；Tong等人，2025）。尽管取得了这些进展，现有研究主要集中在单一粘合剂、有限的浓度范围或孤立的冻融条件下，尚未系统地比较不同蛋白质粘合剂在多次冻融应力下的效果。因此，本研究系统地研究了三种浓度水平（2%、4%和6%）的大豆蛋白（SP）和蛋清（EW）粉末，并评估了它们对经过最多五次冻融循环的冷冻鱼丸质量的影响。这种综合方法提供了关于特定粘合剂机制的新见解，并确定了提高冷冻鱼丸产品冻融稳定性和消费者接受度的最佳配方。

材料与方法：
从泰国曼谷的常规市场购买了新鲜的Dorab狼鲱鱼（Chirocentrus dorab）。配方中使用的转谷氨酰胺酶是一种微生物来源的转谷氨酰胺酶（MTGase），来自Chanjao Longevity有限公司（泰国），声明活性为100 U/g，并以食品级形式提供。精制氯化钠购自Thai Refined Salt有限公司（泰国）。本研究选用了两种蛋白质粘合剂：含有约90%蛋白质的大豆蛋白分离物（SP），来自Krungthepchemi有限公司（泰国）；以及蛋白含量约为82%的蛋清粉末（EW），由Lana Grow Chemical有限公司（泰国）提供。所有试剂和成分均符合食品级规格，并符合加工鱼类产品开发所需的安全标准。
在本研究中，绞碎的鱼指的是用作原材料的机械加工鱼肉。鱼凝胶是指从绞碎的鱼中制备的热诱导凝胶，用于在受控条件下评估基本的凝胶形成特性和蛋白质凝胶化行为。相比之下，鱼丸是含有蛋白质粘合剂的最终配方产品，经过反复冻融循环以进行全面的产品级质量评估。这两种系统旨在解决不同的研究目标，并不打算直接进行交叉比较。

新鲜和冷冻绞碎鱼的鱼凝胶制备：
鱼片在运输过程中保持在冰上，并在到达实验室前维持在4±2°C的温度。到达后，立即使用肉磨机（Bos Mall，TK-42，中国）将其磨碎成均匀的肉末。然后将500克的肉末装入聚乙烯袋中并在真空条件下密封（Spring Green Evolution，VC-ECO Gen2，中国）。这些样本被归类为新鲜绞碎的鱼，在绞碎后2小时内处理并在4±2°C下保存而不冷冻。为了模拟标准冷链操作，部分绞碎的鱼在-20±2°C下冷冻24小时，然后在4±2°C下解冻18小时。这些样本被指定为冷冻绞碎的鱼。这种预绞碎冷冻方法是有意选择的，以模拟小规模和中规模的加工条件，在这些条件下，由于操作限制，鱼肉通常在冷冻储存前被绞碎。
为了制备凝胶，使用了新鲜和冷冻绞碎的鱼。每种鱼分别与3%的氯化钠（NaCl）混合，使用标准搅拌机（Sokany，SK-06020，中国）搅拌三分钟。得到的混合物必须均匀且具有粘性。准备就绪后，将其填充到直径约25毫米的塑料胶囊中。烹饪分为两个阶段：第一阶段在45±2°C下进行20分钟，之后温度升高到90±2°C并继续加热20分钟。然后将凝胶转移到冷却水中（4±2°C）中迅速冷却。之后，样本在4°C的冰箱中储存24小时。在进行测试之前，将凝胶在室温（25°C）下放置约一个小时以稳定。

凝胶强度（GS）测量：
在测试前，将凝胶样本切成大约25毫米长的段。使用一种纹理分析仪（TA.XT Plus，Stable Micro Systems Ltd.，英国）通过带有5毫米直径的球形探针进行穿刺测试来评估凝胶强度。测量参数设置为测试速度为1毫米/秒，压缩距离为样本高度的60%（Cortez-Vega等人，2013）。测试过程中的最大力记录为破坏强度（g），而探针移动的距离记录为变形（cm）。凝胶强度通过以下公式确定：
$$\mathrm{Gel\;strength}\left(\mathrm{g}\cdot\mathrm{cm}\right) = \mathrm{Breaking\;force\;(g)} \times \mathrm{Deformation\;(cm)}$$

折叠测试：
为了评估凝胶的弹性，从样本中切出大约5毫米厚、25毫米直径的片状样品。然后使用海洋渔业研究部（MFRD，1987）报告的方法进行折叠测试。每片样本用手轻轻折叠并保持折叠位置约5秒，然后记录其反应——它是裂开还是保持完整。样本根据五个类别进行视觉评分：当折叠成四部分时没有裂纹（AA），折叠成四部分后有轻微裂纹（A），折叠成两半后出现轻微裂纹（B），折叠成两半时完全裂开（C），以及折叠成两半时完全裂开（D）。

颜色测量：
将凝胶样本切割成一致的25毫米厚度，并使用分光光度计（Hunter Lab，Colorflex-45–2，美国）在CIELAB颜色空间（L*、a*和b*）中评估颜色参数。L*值表示从0（暗）到100（亮或白）的亮度范围。a*值表示红绿色轴，正值表示红色，负值表示绿色。b*值表示黄蓝色轴，正值表示黄色，负值表示蓝色。白度（W）指数和ΔE*是根据以下公式（CIE，1976；Liu等人，2019）确定的：$$\text{白度指数（W）= 100 - }\sqrt{{\left(\text{100} - {{L}}^\text{*}\right)}^{2}+ {{a}}^\text{*2}+ {{b}}^\text{*2}}$$ (2) $$\Delta{\text{E}}^{* }= \text{ } \sqrt{{\text{(}\Delta{{L}}^\text{*}\text{)}}^{2}\text{+}{\text{(}\Delta{{a}}^\text{*}\text{)}}^{2}\text{+}{\text{(}\Delta{{b}}^\text{*}\text{)}}^{2}}$$ (3) 其中ΔL*、Δa*和Δb*表示样品与对照色调在明度、红绿色和黄蓝色轴上的差异。

样品的近似成分分析，包括水分、脂肪、蛋白质、灰分和粗纤维，是使用AOAC（2002）标准技术确定的。碳水化合物含量是通过从100中减去上述各项的总和来计算的。

微生物质量
总菌落计数（TPC）以及大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌属和霍乱弧菌的存在是根据AOAC（2002）标准进行评估的。简要地说，样品在无菌稀释剂中无菌匀浆，然后进行系列稀释，并接种在适当的选择性培养基上。TPC通过在35±2°C下培养48小时后使用菌落计数琼脂来计数，而特定病原体则是使用它们各自的选择性和确认培养基来检测的。

实验获得的物理质量数据来自三次重复测定（n=3），并表示为平均值±标准偏差。进行了95%置信水平（p≤0.05）的独立样本t检验，以确定新鲜和冷冻鱼糜样品之间的显著差异。所有统计分析都是使用SPSS软件18.0版（SPSS Thailand Co., Ltd., 曼谷, 泰国）进行的。

粘合剂对重复冷冻-解冻周期中冷冻鱼丸质量的影响
用于生产冷冻鱼丸的鱼糜是由新鲜鱼制备并在受控冷冻储存条件下保存的。研究了两种类型的粘合剂——大豆蛋白（SP）和蛋清粉（EW）——每种粘合剂都在三个浓度水平（2%、4%和6%，以湿基总鱼糜重量的百分比表示（w/w）进行了测试。还加入了一种不含额外粘合剂的对照配方进行比较分析。生产过程首先将鱼糜（78.24%）与适当的粘合剂结合使用切割搅拌器混合3分钟，使SP或EW充分水合并与肌肉蛋白质相互作用，从而在盐诱导的肌原纤维蛋白溶解之前促进均匀分散并减少后续凝胶网络形成过程中的不均匀性。随后加入盐（2.35%）和所需冰量的一半（9.39%），然后再混合一分钟。接着加入转谷氨酰胺酶（0.63%），并继续混合一分钟，直到加入剩余的冰量（9.39%）。选择转谷氨酰胺酶（0.63%）的浓度是基于初步实验，以确保足够的蛋白质交联而不会导致凝胶过度硬化或对质地产生不良影响。该混合物经过额外处理2分钟，以保证所有成分的均匀分布。得到的乳液被制成直径约2厘米的球体。初次煮沸在40±2°C下进行30分钟，以促进鱼丸基质中的转谷氨酰胺酶介导的蛋白质交联，然后在90±2°C下进行二次煮沸15分钟，以确保蛋白质完全变性并且产品安全，同时不导致质地过度硬化。煮沸后，样品在冷水中浸泡10分钟，沥干5分钟，然后真空密封在每个含有100克产品的聚乙烯袋中。密封的包装放入冷冻室中，在-20±2°C下储存（图1）。

图1
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冷冻鱼丸的生产过程

冷冻-解冻（FT）循环
冷冻-解冻循环涉及将样品在-20°C下冷冻24小时，然后在室温下的水浴（25±2°C）中解冻一小时，每10分钟补充一次水（Tee & Siow, 2017）。这个循环重复了五次，因为多次FT循环已被报道能有效反映在不当冷链处理过程中的质量累积恶化（Li等人，2019；Olatunde & Benjakul, 2018）。对照样品（周期0）没有进行冷冻。在周期1、3和5后进行了质量评估，作为代表点来反映反复冷冻-解冻循环中的渐进质量变化。

凝胶强度
冷冻鱼丸的凝胶强度（GS）是通过使用质地分析仪（TA.XT Plus, Stable Micro Systems Ltd., 英国）根据第2.2.2节中概述的方法确定的，预先进行了刺穿测试，作为评估样品凝胶强度和结构完整性的标准化方法，随后使用质地分析（TPA）来表征详细的质地属性。

质地分析
质地分析（TPA）是在切割成均匀的15×15×15毫米立方体的冷冻鱼丸样品上进行的。分析使用了质地分析仪（TA.XT Plus, Stable Micro Systems Ltd., 英国）和50毫米的圆柱形探针。测试设置如下：预测试速度为3毫米/秒，测试速度为1毫米/秒，后测试速度为3毫米/秒，压缩至原始样品高度的60%。每种配方的所有测量都进行了三次重复。获得的力-时间曲线用于测量基本质地特性，如弹性、凝聚性和咀嚼性（g），如Tee和Siow（2017）所述。

颜色测量
整个冷冻鱼丸样品的颜色特性是使用光谱仪（Hunter Lab, Colorflex-45–2, 美国）在CIELAB颜色空间框架内进行的。该设备测量了每个样本的L*（明度）、a*（红绿色）和b*（黄蓝色）值。随后使用这些测量值计算白度（W）指数，如公式（2）中所概述的。

物理保水性能
解冻损失是根据Chang等人（2023）的方法评估的。记录每个样品在解冻前的质量（M1；克）和解冻后的质量（M2；克）。解冻损失的百分比使用以下公式计算：$$\text{解冻损失 }\left(\text{\%}\right) \, = \text{ } \frac{{\text{M}}_{1}\text{- }{\text{M}}_{2}}{{\text{M}}_{1}}\text{ x 100}$$ (4) 取2克解冻的冷冻鱼丸样品，将其包裹在一层滤纸中，放入10毫升的离心管中。样品在4°C的受控温度下以5,000转/分钟的速度离心10分钟。离心前的鱼丸质量记录为M3（克），离心后的质量记录为M4（克）（Chang等人，2023）。离心损失的百分比使用以下公式确定：$$\text{离心损失 }\left(\text{\%}\right) \, = \text{ } \frac{{\text{M}}_{3}\text{- }{\text{M}}_{4}}{{\text{M}}_{3}}\text{ x 100}$$ (5) 解冻程序后，每个鱼丸被称重并记录为M5（克）。随后将样品密封在耐热烹饪级袋中，并放入维持在85°C的水浴中。加热持续到鱼丸的中心温度达到75°C。煮沸完成后，用滤纸仔细去除多余的表面水分，然后重新称重（M6；克）（Chang等人，2023）。烹饪损失的百分比随后使用以下公式计算：$$\text{烹饪损失 }\left(\text{\%}\right) \, = \text{ } \frac{{\text{M}}_{5}\text{- }{\text{M}}_{6}}{{\text{M}}_{5}}\text{ x 100}$$ (6) 保水能力是使用基于Tee和Siow（2017）方法的改进方法评估的。每个鱼丸样品被放在两层Whatman No. 1滤纸之间（每侧两层）。对样品均匀施加5公斤的压力持续2分钟。在压缩前后分别称重样品（W7；克和W8；克），然后使用以下公式计算保水能力（%）：$$\text{保水能力（WHC; \%）= 100 - [}\frac{{\text{M}}_{7}\text{- }{\text{M}}_{8}}{{\text{M}}_{7}}\text{ x 100]}$$ (7) 微观结构分析是使用扫描电子显微镜（SEM）（Hitachi Inc., 日本）进行的，遵循Chang等人（2023）所述的方法，并进行了一些修改。使用双刃刀片将冷冻鱼丸的中心切成0.5×0.5×0.5立方厘米的小块。然后将样品固定在2.5%戊二醛和0.1摩尔/升磷酸盐缓冲液（pH 7.2）中过夜，在4°C下。固定的样品随后用相同的磷酸盐缓冲液冲洗两次，然后用蒸馏水冲洗一次，每个步骤持续15分钟。脱水使用逐渐增加的乙醇系列（30%、50%、70%、95%和100%，毫升/体积）进行15分钟。随后使用绝对乙醇（100%体积/体积）进行两个额外的脱水步骤。脱水样品使用临界点干燥器（Leica EM CPD 300，奥地利）进行2.5小时的干燥。干燥后，样品用双面胶带固定在铝棒上，然后使用溅射镀膜机（Balzer SCD 040，德国）进行金溅射涂层。之后使用扫描电子显微镜（SEM）在200倍放大下进行分析。

近似分析
冷冻鱼丸的化学成分——即水分、脂质和蛋白质含量——是按照AOAC（2002）规定的标准化分析协议进行的。所有分析都进行了三次重复，结果以相对于湿重的百分比表示。

总挥发性碱性氮（TVB-N）
总挥发性碱性氮（TVB-N）是使用Chang等人（2023）建立的方法评估的。取10克冷冻鱼丸样品，仔细研磨并与100毫升蒸馏水混合，然后在4°C下摇晃30分钟，随后过滤。取5毫升滤液与等体积的10克/升氧化镁（MgO）混合，并在Kjeldahl氮测试设备上蒸馏5分钟。蒸馏液用0.01摩尔/升的标准盐酸滴定，终点由黄橙色标记。TVB-N使用以下公式计算：$$\text{TVB-N (mg/100 g) = }\frac{\text{(}{\text{V}}_{1}\text{- }{\text{V}}_{2}\text{) x c x 14}}{\text{m x }{}^{{5}}\!\left/ \!{}_{{100}}\right.}\text{ x 100}$$ (8) 其中V1是用于滴定样品的标准盐酸体积（毫升），V2是用于对照的体积（毫升），c是标准盐酸的摩尔浓度（摩尔/升），m是样品的质量（克）。

冷冻鱼丸产品的感官评估
将冷冻鱼丸样品储存在4±2°C的冷藏温度下，然后通过在90±2°C的热水中浸泡3分钟进行重新加热。共有54名未受培训的评估员（15名男性和39名女性）参与了在泰国Ramkhamhaeng大学和Thammasat大学进行的中心位置测试（CLT），以评估产品的接受度。评估使用了9点愉悦度量表来确定消费者在五个感官维度上的喜好：颜色、风味、味道、质地和整体可接受性（Meilgaard等人，2007）。除了感官属性外，参与者还被问及他们接受和购买产品的意愿。

微生物质量评估
冷冻鱼丸样品的微生物完整性是通过计数总活微生物（总菌落计数；TPC）和鉴定食源性疾病如沙门氏菌属、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌、大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌来评估的。所有分析都是按照AOAC（2002）规定的标准进行的。

统计分析
物理化学数据被分析以获得描述性统计量，包括平均值和标准偏差。使用完全随机设计（CRD）进行单因素方差分析（ANOVA），以评估不同粘合剂及其浓度在多次冷冻-解冻循环中对冷冻鱼丸质量属性的影响。对于感官评估，应用了随机完全区组设计（RCBD）来控制评估员之间的变异性。当在95%置信水平（p≤0.05）观察到统计显著差异时，使用Duncan的新多重范围测试（DMRT）进行均值比较。所有统计计算都是使用SPSS软件18.0版（SPSS Thailand Co., Ltd., 曼谷, 泰国）进行的。

结果与讨论
储存条件对鱼糜质量属性的影响
新鲜制备的Chirocentrus dorab鱼糜表现出细腻、均匀的质地，没有变色或异味。这些初始属性反映了原材料的高新鲜度和质量。相反，冷冻样品在视觉检查中没有明显的宏观缺陷，如表面裂纹或过多的滴落损失；然而，视觉观察仅限于外观，并不旨在直接评估肌肉纤维的微观冰晶损伤。评估重点是在表1中显示的储存温度对凝胶形成能力、质地、颜色的影响，以及化学和微生物质量。表1 由新鲜和冷冻绞肉鱼样品制备的凝胶的物理性质
表1显示，由冷冻绞肉鱼制备的凝胶强度显著高于新鲜样品（p ≤ 0.05）。这种增加可以理解为冷冻过程中水分重新分布的结果，这可能会减少自由水并提高凝胶化前的相对蛋白质浓度。除了浓度效应外，冷冻还可能在随后的加热过程中促进肌原纤维蛋白质的重新排列，有助于增强三维凝胶网络的形成。这种现象可能是由于冷冻过程中部分形成了冰晶，从而在绞碎后促进了肌原纤维蛋白质的重新排列，而不是保持了完整的肌肉纤维。具体来说，适度的冷冻可能会在热诱导的凝胶化过程中使蛋白质二级结构的平衡向β-折叠转变（Wac?awska等人，2019年）。这种重新排列增加了巯基集团的暴露，使得二硫键的形成成为可能，并增强了蛋白质分子之间的疏水相互作用（Li等人，2023a，b）。这些相互作用对于构建能够有效保持水分并表现出强质地特性的稳定凝胶基质至关重要（Zhang等人，2023年）。此外，水分子与蛋白质侧链之间增强的氢键进一步稳定了凝胶网络（Wei等人，2024年）。然而，这种有益的效果仅在适度条件下才能实现。过量的冰晶形成会破坏蛋白质-蛋白质相互作用，并产生大冰晶，从而机械性地损伤肌肉结构。这导致凝胶质地粗糙，并增加了固定水的比例，从而降低了凝胶的韧性和强度（Chen等人，2021年）。除了温度诱导的效果外，类似的蛋白质重新排列现象也在经过其他加工干预的鱼凝胶系统中被报道，例如高压处理和优化的凝固条件，这些方法同样调节了低盐系统中的蛋白质-蛋白质相互作用和凝胶网络的形成（Truong等人，2025a，b）。这些发现表明，盐浓度并不是凝胶网络发展的唯一决定因素；通过适当的加工策略，也可以有效地实现蛋白质结构的重新排列。

折叠测试的结果支持了这些发现（表1）。新鲜样品获得了B级，表明在対折时仅有轻微的破裂。相比之下，冷冻样品获得了A级，在対折成四分之一时仅略有破裂，表明凝胶的弹性更好。这些观察结果符合泰国工业标准（TIS 935–2533），该标准规定了冷冻鱼饼产品的最小凝胶强度为400 g·cm，并且平均折叠等级至少为A级（泰国工业标准协会，1990年）。本研究中的冷冻样品满足或超过了这些质量要求。

鱼凝胶的颜色特性
比色测量显示，新鲜和冷冻样品在亮度（L*）和白度（W）方面没有显著差异（p > 0.05），表明冷冻对其视觉亮度影响不大（表1）。然而，与新鲜样品相比，冷冻样品的绿色（-a*）显著降低，黄色（b*）显著增加（p ≤ 0.05）。绿色调的减弱和黄色的加深可能是由于即使在冷冻储存条件下也会发生的酶促自溶和微生物活动（Fan等人，2022a，b）。储存过程中含有色素的细胞器——色素细胞的破裂可能促进了色素向周围组织的迁移（Xie等人，2023年）。此外， lipid氧化在颜色恶化中起着重要作用，产生醛类化合物，使肌肉的颜色随时间从黄色变为棕色（Duarte等人，2020年）。肌红蛋白的氧化，由内在的酶促活性和外部氧气暴露共同驱动，也导致了这种变色。肌红蛋白是一种含血红素的蛋白质，通常以氧合肌红蛋白（oxyMb）的形式存在，赋予红色色调（Vanek & Kohli，2023年）。氧化成还原肌红蛋白（metMb）后，颜色变为不希望的棕色（Palanisamy等人，2025年），因为铁从亚铁（Fe2?）状态转变为铁（Fe3?）状态（Han等人，2024年；Hizbullah等人，2020年）。这些变化在冷冻储存期间因 lipid和蛋白质氧化过程而加速（Geng等人，2023年）。尽管发生了这些分子变化，新鲜和冷冻绞肉鱼之间的总颜色差异（ΔE*）仅为1.99，低于人眼的视觉检测阈值。因此，尽管在冷冻过程中发生了一些生化变化，但整体视觉质量基本保持不变。这一发现支持了冷冻储存能够保持鱼糜美观质量的可行性。

鱼凝胶的近似成分
在对鱼糜进行进一步加工成鱼丸之前，对其进行了近似分析，结果表明其成分如下：79.37%的水分，17.04%的蛋白质，0.34%的脂肪，0.15%的粗纤维，1.63%的灰分，以及1.47%的碳水化合物（表2）。这些数值符合泰国工业标准（TIS 935–2533），该标准规定了冷冻鱼饼产品的最大水分含量为80%（泰国工业标准协会，1990年）。这些结果与先前报道的dorab狼鲱鱼的成分一致，尽管存在一些差异。例如，Palani Kumar等人（2014年）报告了75.48%的水分和15.24%的蛋白质，而Hantoush等人（2022年）发现了73.74%的水分和18.61%的蛋白质。这些差异可能源于地区、季节或生物因素，包括鱼的年龄、大小、饮食和活动水平。

鱼凝胶的微生物质量
微生物评估显示，冷冻绞肉鱼具有优异的卫生质量。总活菌数（TVC）为1 × 102 CFU/g，远低于允许的1 × 10? CFU/g的限值（TIS 935–2533；AOAC，2002）。大肠杆菌的含量为43 MPN/g，金黄色葡萄球菌的含量小于10 CFU/g，均符合监管标准。此外，在25克样品中未检测到沙门氏菌属或霍乱弧菌的污染。这些结果证实，冷冻dorab狼鲱鱼符合微生物安全标准，适用于进一步加工成鱼丸等产品。

粘结剂对冷冻鱼丸在冻融循环中的稳定性的影响
基于冷冻鱼饼产品的质量显著受到冻融（FT）循环的影响，这些循环会导致肌肉蛋白质及其相关成分的物理和化学变化。本研究使用了2%、4%和6%浓度的大豆蛋白（SP）和蛋清（EW）粉末作为粘结剂，并分析了它们在0、1、3和5次冻融循环中对产品质量的影响。

水分损失特性（解冻损失、离心损失和烹饪损失）
所有样品的解冻损失都随着冻融循环次数的增加而增加，除了含有4% SP的样品（SP4）（图2A），这表明由于凝胶基质的稳定化，WHC得到了改善。冷冻过程中冰晶的形成和重结晶破坏了蛋白质结构并增加了孔隙率，从而促进了水分的泄漏（Fan等人，2022a，b；Feng等人，2023；Pan等人，2021；Wang等人，2021）。然而，SP4、SP6和所有测试浓度的EW相对于对照组显著减少了解冻损失（p ≤ 0.05），支持了粘结剂可以减少水分损失的假设。离心损失也呈现出类似的趋势，随着冻融循环次数的增加而增加，反映了凝胶基质的弱化。所有SP和EW浓度都显示出相对于对照组的显著改善（p ≤ 0.05），并且较高浓度获得了更好的效果（图2B）。这表明这两种粘结剂都能增强内部凝胶网络并稳定水分。烹饪损失是由于加热过程中的蛋白质变性造成的（Lv等人，2021），也随着冻融循环次数的增加而增加，尤其是在对照组样品中。SP6和EW4–EW6在所有循环中有效限制了烹饪损失（图2C）。这些粘结剂可能有助于形成更稳定的凝胶并提高热稳定性（Yu等人，2022）。

图2
不同粘结剂浓度下冷冻鱼丸在重复冻融循环中的解冻损失（A）、离心损失（B）和烹饪损失（C）。图例：小写字母表示在同一冻融循环内不同配方之间的统计学显著差异（p ≤ 0.05）。大写字母表示在不同冻融循环中同一配方之间的显著差异（p ≤ 0.05）

质地特性（凝胶强度和TPA参数）
质地特性如弹性、凝聚性和咀嚼性受到了冻融循环的影响（图3A–C）。总体而言，冻融循环次数的增加对质地特性产生了逐渐不利的影响，因为反复的冰晶形成和蛋白质变性破坏了凝胶基质。EW4和EW6保持了显著较高的弹性值（p ≤ 0.05），表明粘结剂水平调节了冻融应力下质量保持的程度，而不是完全防止了恶化。SP2和对照组的凝聚力下降，而较高水平的粘结剂（SP4、SP6和EW配方）更好地保持了内部凝胶的完整性。所有处理中的咀嚼性随着冻融循环次数的增加而降低；然而，含有2–6% SP或EW的配方始终表现出比对照组更高的咀嚼性，表明粘结剂浓度在反复冻融过程中对结构稳定性的增强作用。凝胶强度作为鱼饼的关键属性，随着冻融循环次数的增加而下降，但SP4、SP6和所有EW浓度都保持了比对照组更好的值（图4），这表明粘结剂水平主要影响了质量损失的程度，而冻融循环则影响了质量的恶化方向和程度。这些发现与Zhang等人（2019年）的结果一致，他们证明了在银鲤鱼丸中加入4%的最佳程度的大豆蛋白显著增强了凝胶强度、弹性和保水能力，而更高水平并未提供额外的质地效益。

图3
不同粘结剂浓度下冷冻鱼丸在重复冻融循环中的弹性（A）、凝聚力（B）和咀嚼性（C）。图例：小写字母表示在同一冻融循环内不同配方之间的统计学显著差异（p ≤ 0.05）。大写字母表示在不同冻融循环中同一配方之间的显著差异（p ≤ 0.05）

图4
不同粘结剂浓度下冷冻鱼丸在重复冻融循环中的凝胶强度。图例：小写字母表示在同一冻融循环内不同配方之间的统计学显著差异（p ≤ 0.05）。大写字母表示在不同冻融循环中同一配方之间的显著差异（p ≤ 0.05）

冷冻鱼丸的颜色稳定性
图5和图6A–C显示，冻融循环显著影响了鱼丸的颜色特性。白度（W）和亮度（L*）逐渐降低，可能是由于冰晶形成、蛋白质氧化和结构退化（Chang等人，2023；Li等人，2023a，b）。SP4和SP6显示的W和L*值明显低于对照组，表明高SP水平可能会加重变色（Zhao等人，2024年）。相反，EW2在早期循环中比对照组更有效地保持了亮度，尽管EW4和EW6没有进一步的改善（p > 0.05）。过多的添加可能会交联蛋清蛋白质和鱼饼基质，从而破坏结构完整性（Niu等人，2025年）。绿色（-a*）在所有配方中保持稳定（图6B）。与对照组相比，SP6和EW6组的黄色（b*）显著增加（图6C），导致产品变色加剧。这些发现突出了SP和EW在重复冻融条件下对颜色稳定性的不同影响。

图5
不同粘结剂浓度下冷冻鱼丸在重复冻融循环中的白度（W）值。图例：小写字母表示在同一冻融循环内不同配方之间的统计学显著差异（p ≤ 0.05）。大写字母表示在不同冻融循环中同一配方之间的显著差异（p ≤ 0.05）

图6
不同粘结剂浓度下冷冻鱼丸在重复冻融循环中的L*（A）、a*（B）和b*（C）值。图例：小写字母表示在同一冻融循环内不同配方之间的统计学显著差异（p ≤ 0.05）。大写字母表示在不同冻融循环中同一配方之间的显著差异（p ≤ 0.05）

基于保水能力、凝胶强度、质地稳定性、颜色特性以及在重复冻融循环中质量退化的抵抗力等方面的整体表现，4%的粘结剂浓度（SP4和EW4）被确定为最适合的浓度，因此被选为后续的详细分析，包括物理化学、微生物和感官评估。

通过扫描电子显微镜（SEM）确认了选定SP4和EW4在冻融条件下的结构退化（图7）。冻融循环增加了凝胶基质的孔隙率和破碎程度。初始紧凑的结构在3次和5次循环后明显退化，这与水分损失增加和凝胶强度降低一致。横截面观察进一步支持了这些发现（图8）。在0周期时，产品具有紧凑且组织良好的网络结构，但在3和5周期后出现了更多的孔隙和分裂现象，这证实了反复冷冻（FT）处理的影响。这些微观结构变化与观察到的感官性质恶化密切相关，尤其是凝胶强度、凝聚性和咀嚼性的下降。孔隙的逐渐扩大以及连续蛋白质网络的破坏降低了凝胶基体的有效承重能力，从而降低了其对变形的抵抗力。在分子水平上，反复的冷冻处理已知会促进蛋白质的变性、聚集以及二级结构的重排，这些都会削弱蛋白质之间的相互作用，并限制加热过程中稳定三维凝胶网络的形成。因此，蛋白质结构改变和微观结构降解的综合作用解释了在长时间冷冻处理下SP4和EW4配方感官完整性的下降。

图7：掺加了4%大豆蛋白（SP4）或4%蛋清（EW4）粉末的冷冻鱼球样品在每个冻融循环（FT0、FT1、FT3和FT5）下的微观结构特征，观察范围为200倍放大。

图8：掺加了4%大豆蛋白（SP4）或4%蛋清（EW4）粉末的冷冻鱼球样品在连续冻融循环（FT0、FT1、FT3和FT5）下的横截面形态。

物理化学质量：
- 如表3所示，SP4样品的冻干比（WHC）在循环过程中显著下降（p ≤ 0.05）。这种下降归因于蛋白质变性、交联以及冰晶对凝胶基体的破坏（Hu等人，2025；Zhang等人，2022）。相比之下，EW4的WHC在循环过程中保持稳定（p > 0.05），这可能是由于卵清蛋白和卵黏蛋白的稳定作用，它们在冷冻过程中形成了有弹性的凝胶网络（Quan & Benjakul，2017；Tong等人，2025）。

表3：含有4%大豆蛋白或蛋清粉的冷冻鱼球配方在多次冻融循环中的物理化学性质。

TVB-N值随着冻融循环次数的增加而逐渐升高，反映了反复冷冻应力引起的蛋白质累积降解（表3）。值得注意的是，SP4样品在第三次冻融循环后的TVB-N含量超过了通常认为的腐败阈值30毫克/100克（Chang等人，2023），而EW4样品则在后期循环才接近但未超过这一限度。这表明在反复冷冻过程中，蛋清蛋白比大豆蛋白更有效地减缓了蛋白质的降解。EW4配方中TVB-N积累的减少主要归因于蛋白质凝胶基体结构完整性的提高，这可能限制了酶和微生物对蛋白质底物的接触。

SP4样品中的水分含量随着冻融循环次数的增加而减少（p ≤ 0.05），这是由于冰晶引起的结构破坏，导致WHC下降；而EW4配方通过将水分锁在蛋白质基质中保留了水分。蛋白质含量略有下降，但差异不显著（Lv等人，2021）。SP4样品中的脂肪含量在第五个循环时下降，而EW4样品保持稳定，这归因于乳化稳定性的增强（Liu等人，2023）。

感官评估和微生物质量：
感官评估仅限于那些在物理化学质量和微生物安全方面保持可接受水平的冻融循环，以确保评估组成员的安全和消费者的可靠感知。因此，SP4的感官分析在第一次冻融循环进行，而EW4在第一次和第三次冻融循环进行。结果显示，经过一次冻融处理的EW4在颜色、风味、口感、质地和整体喜好方面评分最高，同时接受度和购买意图也最高（90.74%和79.63%（表4）。与第一次冻融循环相比，经过三次冻融处理的EW4样品在颜色、风味、口感和整体喜好方面的评分显著降低（p ≤ 0.05），表明随着冻融次数的增加，感官质量整体下降。基于SP4的样品虽然仍然可以接受，但由于颜色较深和豆腥味而评分较低。这些发现表明，反复的冻融循环，尤其是在一次以上循环后，会对多个感官属性和消费者的整体接受度产生负面影响。最终的微生物检测确认了产品符合泰国工业标准（2014年）（CPS 328/2557）。总菌落计数为1×10^2 CFU/g，未检测到沙门氏菌属、金黄色葡萄球菌和产气荚膜梭菌等病原体。大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的含量也在安全范围内（公共卫生部，2020年），证实了EW4增强型冷冻鱼球的安全性。

表4：含有4%大豆蛋白（在第一次冻融循环评估）或4%蛋清粉（在第一次和第三次冻融循环评估）的冷冻鱼球样品的感官特性、消费者接受度和购买意图。数据来自一个消费者小组（n = 54）。

实际意义：
从实际角度来看，反复的冻融循环显著降低了产品的吸引力和消费者的接受度。为了保持产品质量并减轻质量下降的风险，使用小包装格式可能有助于减少处理和储存过程中的冻融次数。此外，可以考虑添加抗氧化剂或防腐剂作为进一步延长保质期和提高冷冻鱼球产品稳定性的策略。

研究局限性和未来展望：
本研究仅限于在固定冷冻温度下对物理化学、质地、微观结构、微生物和感官属性的评估，并未探讨蛋白质变性的分子水平指标（例如，二级蛋白质结构或巯基/二硫键变化）或脂质氧化机制。因此，结论主要局限于 binder 类型、 binder 浓度和冻融频率对蛋白质相关质量属性的影响。未来的研究应包括蛋白质变性的分子指标、脂质氧化以及不同的冷冻条件，以进一步阐明影响冷冻鱼球产品质量和稳定性的机制。

结论：
研究表明，冷冻和多次冻融循环（特别是0、1、3和5次循环）显著影响了切碎的金虎鱼（Chirocentrus dorab）的质量及其在冷冻鱼球制造中的使用。冷冻后的切碎鱼具有出色的物理化学特性，包括改善的凝胶强度，同时符合可接受的色彩和微生物安全标准，表明其适合作为原材料。添加4%的大豆蛋白或蛋清粉可以提高水分保持能力、凝胶稳定性和在反复冻融循环中的质地韧性，对颜色的影响可以忽略不计。然而，不同 binder 在保持质量方面的效果有所不同：蛋清粉在1和3次冻融循环中更有效地保持了水分保持能力和感官质量，而大豆蛋白在较高循环次数下的表现相对较差。含有4%蛋清粉并经过一次冻融循环（第1周期）的配方获得了最高的感官评分，消费者接受度超过90%，购买意图接近80%，这突显了它们在有限冻融条件下的潜在商业应用性。微生物分析证实了所有样品的安全性。总体而言，研究结果表明，binding 类型和冻融频率共同决定了质量下降的情况，最佳性能出现在早期的冻融循环中，而不是长期循环过程中。