冷藏通过m6A读取因子PpYTHDFE1促进 Peach 果实的软化过程，这一过程是由细胞壁软化相关转录因子PpEXP3的液-液相分离介导的降解所驱动的

《Molecular Horticulture》：Cold storage delays peach fruit softening via m6A reader PpYTHDFE1 liquid-liquid phase separation-mediated degradation of cell wall-loosening transcript PpEXP3

　　**摘要**

N6-甲基腺苷（m6A）是植物mRNA中最常见的表观转录组修饰类型，它作为关键的调控层来控制植物对环境的响应。冷藏可以减少细胞壁酶的转录，从而延缓果实软化，然而m6A是否参与了这一过程仍不清楚。在这里，我们发现了一种冷诱导的m6A识别蛋白PpYTHDFE1，它能够稳定桃子（Prunus persica L.）的果实硬度。表观转录组分析显示，果实硬度的维持与m6A修饰转录本的减少有关，例如过度表达的扩张蛋白PpEXP3会加速果实软化。体外RNA-EMSA和体内RIP-qPCR实验均证实PpYTHDFE1能够识别m6A修饰的PpEXP3转录本。转录抑制实验进一步证明，PpYTHDFE1通过RNA-蛋白质相互作用而非转录调控来加速PpEXP3的降解。从机制上看，PpYTHDFE1参与了液-液相分离，这一过程通过光漂白后的荧光恢复（FRAP）实验得到证实，从而促进了PpEXP3的降解。此外，过表达PpYTHDFE1会降低PpEXP3的mRNA水平，而沉默PpYTHDFE1则导致PpEXP3转录本的积累。在果实冷藏过程中，PpYTHDFE1转录本与果实硬度之间存在显著负相关。在桃子和番茄中，过表达PpYTHDFE1后，果实硬度分别增加了44%和45%。我们的发现为基于RNA修饰的策略提供了分子层面的见解，这些策略有助于减少采后损失并培育耐寒的园艺作物。

**引言**

N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物mRNA中最常见的RNA甲基化修饰类型，在调节RNA代谢和应激反应中起着关键作用（Jia et al. 2011; Liu et al. 2014; Pendleton et al. 2017; Zaccara et al. 2019; Xu et al. 2021; Boulias & Greer 2023; Mateos et al. 2024）。这种动态修饰可被m6A甲基转移酶（“写入器”）和去甲基化酶（“擦除器”）逆转性调控（Meyer & Jaffrey 2017; Balacco & Soller 2019）。m6A功能的核心是含有YTH结构域的识别蛋白，它们通过调控稳定性、剪接、核输出和翻译起始来识别m6A标记并影响mRNA的命运（Arribas-Hernández et al. 2018; Wei et al. 2018; Guo et al. 2022; Bian et al. 2024; Cai et al. 2024）。在模式植物中，特别是拟南芥（Arabidopsis thaliana）和番茄（Solanum lycopersicum）中，m6A识别蛋白的功能已得到充分研究，它们调节发育、开花、应激反应和果实品质等关键过程（Arribas-Hernández et al. 2018; Wei et al. 2018; Amara et al. 2023; Bian et al. 2024; Cai et al. 2024）。最近的研究表明，植物m6A识别蛋白利用液-液相分离（LLPS）来介导RNA处理。在拟南芥中，保守的C末端ECT蛋白（包括ECT1、ECT2、ECT8和CPSF30-L）在特定刺激下会发生相分离（Arribas-Hernández et al. 2018; Song et al. 2021; Lee et al. 2024）。例如，盐胁迫会促使ECT8将m6A标记的RNA隔离在细胞质凝聚物中，加速转录本的降解（Cai et al. 2024）。在番茄中，SlYTH2通过LLPS依赖的翻译重编程来改善果实成熟时的风味（Bian et al. 2024）。除了模式植物外，在经济重要的作物中も发现了YTH识别蛋白，如荔枝（Litchi chinensis）（Tang et al. 2022）、柑橘（Citrus sinensis）（Ouyang et al. 2019）和蔷薇科植物（Wang et al. 2025），其中苹果中的MhYTP2被证明可以调节应激途径（Wang et al. 2017a, b; Guo et al. 2022）。然而，非模式植物中m6A识别蛋白的功能验证和机制理解仍然有限。

低温是影响植物生长的关键环境因素。表观遗传修饰m6A在植物对冷胁迫的响应中起作用。在拟南芥中，低温会降低m6A水平，触发应激抵抗机制（Govindan et al. 2022; Wang et al. 2023）。在番茄中，冷诱导的花药发育缺陷与m6A水平下降有关（Yang et al. 2021）。敲除m6A写入酶MTA会严重损害拟南芥的耐寒性（Govindan et al. 2022; Wang et al. 2023）。同样，下调FIP37会降低寒冷条件下的光合效率，从而降低耐寒性（Vicente et al. 2023）。m6A擦除酶AtALKBH9C有助于种子的耐寒性；其敲除会显著降低冷胁迫后的发芽率（Amara et al. 2022）。尽管越来越多的证据表明m6A在冷响应中的作用，但m6A识别蛋白的功能仍大部分未知。

低温对植物生长构成挑战，但对食品安全和减少食物损失及浪费至关重要（FLW），全球每年有超过1万亿美元的食品被浪费。尽管大量食品被丢弃，但仍有7.83亿人遭受饥饿。2022年，水果和蔬菜的FLW率最高，达到45%（Hamish Forbes et al. 2024），其中48.9%发生在采后处理和储存过程中（Xue et al. 2021）。采后果实软化由细胞壁改变驱动，降低了运输抗性和市场价值，并增加了机械损伤和病原体的易感性（Seymour et al. 2013）。这一过程涉及细胞壁结构的协调变化，包括果胶降解、纤维素重组和水解酶活性（Brummell 2006; Airianah et al. 2016; Shi et al. 2021）。功能基因组学已经确定了番茄（Solanum lycopersicum）、苹果（Malus domestica）、草莓（Fragaria × ananassa）和辣椒（Capsicum annuum）等园艺作物中的关键细胞壁修饰酶（Shi et al. 2023）。CRISPR敲除番茄的扩张蛋白（SlEXP1）和纤维素酶（SlCEL2）可通过强化细胞壁来提高果实硬度并延长保质期（Su et al. 2024）。同样，双重敲除聚半乳糖醛酸酶（SlPG2a）和果胶裂解酶（SlPL）可以显著延长番茄的保质期（Ortega-Salazar et al. 2024）。在没有基因改造的情况下，冷藏仍然是通过减缓乙烯介导的成熟和老化来延缓软化和延长保质期的最有效方法（Brizzolara et al. 2020）。

桃子（Prunus persica L.）是一种来自中国的经济重要水果，目前在全球范围内种植，年产量达2708万吨，种植面积达156万公顷（联合国粮食及农业组织，https://www.fao.org/faostat/）。采后软化会严重降低桃子的市场价值，增加受损和病原体腐烂的风险，导致显著的经济损失。虽然内源聚半乳糖醛酸酶（endo-PGs）与果实质地变化有关（Morgutti et al. 2006; Gu et al. 2016），但控制细胞壁重塑的调控网络仍不清楚。目前，冷藏是延缓采后劣化的主要方法（Brizzolara et al. 2020）。我们之前的研究表明，DNA甲基化这种关键的表观遗传修饰在桃子的冷响应中起作用，并有助于保持果实硬度（Duan et al. 2023）。然而，其他表观遗传修饰（如RNA甲基化）在这一过程中的作用仍不清楚。

在这项研究中，我们发现了桃子的YTH结构域蛋白PpYTHDFE1，它作为一种m6A识别蛋白，通过将RNA甲基化解码与相分离相结合来调节采后生理。通过综合转录组学、表观基因组学和LLPS分析，我们发现PpYTHDFE1在低温条件下高表达并发生相分离。它促进了m6A修饰的PpEXP3转录本的降解，从而保持果实硬度。这些发现揭示了一种新的机制，即冷藏信号通过RNA修饰来调节细胞壁代谢，为通过靶向调控m6A识别蛋白来延长易腐果实的保质期提供了潜力。

**结果**

消费者通常在购买后将水果储存在冰箱中以防止变质并延长保质期。为了研究冷藏水果这一常见做法背后的生物学机制，我们进行了采后储存实验。如图1A所示，桃子被分成四组：C0d（收获当天）、C0dS3（在20℃下储存3天）、C7d（在4℃下储存7天）和C7dS3（在4℃下储存7天，然后在20℃下储存3天）。桃子的初始硬度约为36牛顿（N），在20℃下储存3天后降至约5牛顿（C0dS3）。低温储存保持了硬度，在7天后仍约为24牛顿（C7d）。当转移到20℃下储存3天时，果实迅速软化（图1B）。这些结果表明，采后冷藏有效维持了果实硬度，并在后续的储存过程中进一步减缓了软化。

**图1** 图片的替代文本可能是使用AI生成的。

**PpYTHDFE1是一种由低温储存诱导的m6A识别蛋白。** 桃子储存实验的示意图。C0d：收获时的桃子；C0dS3：在20℃下储存3天的果实；C7d：在低温下储存7天的果实；C7dS3：在低温下储存7天后在20℃下恢复3天的果实。** B：桃子储存过程中的硬度变化。** 数据以九个独立生物重复实验的平均值±标准偏差（SD）表示。显著差异（Tukey的多重范围检验，P < 0.05，F = 13.36）用不同的小写字母表示。** C：本研究的研究策略概述。** ** D：低温储存期间八个桃子YTH基因的表达谱。** 数据以三个独立生物重复实验的平均值±标准偏差表示。虚线标记代表PpYTHDFE1的颜色块。** FPKM：每百万碱基对的片段数量。** ** E：PpYTHDFE1与拟南芥（At）和人类（Hs）中的m6A识别蛋白的多序列比对。** AtECT8的YTH结构域的二级结构元素显示在上方。黑色三角形表示芳香笼中的保守色氨酸残基。黄色圆圈表示接触m6A的残基。** ** F：EMSA显示GST-PpYTHDFE1特异性结合m6A修饰的UGUAA基序，而GST-PpYTHDFEm中的m6A结合能力被消除。** 每个通道加载了逐渐减少浓度的蛋白质和固定量的RNA寡核苷酸，最终浓度为10 nM。

**为了研究m6A识别蛋白在低温储存期间调节桃子硬度的作用，** 我们整合了基于RNA测序（RNA-seq）和从m6A测序（m6A-seq）得出的表观转录组修饰的数据，随后进行了基因功能鉴定（图1C）。我们之前的研究（Wang et al. 2025）在桃子中鉴定出了八个YTH基因，其中六个属于YTHDF亚家族。利用当前实验（图1D）和早期研究（图1；图S1）的转录组数据，我们鉴定出一个YTHDF亚家族成员PpYTHDFE1，其在低温下的表达显著增加了约七倍。这种升高的表达在恢复到室温后迅速下降（图1D）。

**PpYTHDFE1与拟南芥中的ECT8高度同源，** ECT8是一种已知的对环境响应至关重要的m6A识别蛋白（Wu et al. 2024; Cai et al. 2024）。为了探讨桃子冷诱导的PpYTHDFE1是否能够识别m6A修饰，我们进行了生物信息学和生化分析。使用ESPript3（Robert & Gouet 2014）进行的多重序列比对显示，PpYTHDFE1、AtECT8和人类YTHDFs具有高度保守的功能位点，包括芳香笼结构、m6A和RNA接触位点（图1E）。AlphaFold2（Tunyasuvunakool等人，2021年）预测的3D蛋白质模型显示，PpYTHDFE1和AtECT8具有相似的芳香笼结构，主要由色氨酸构成（图S2），AtECT8中保守的色氨酸残基为Trp-343、Trp-404和Trp-409，而PpYTHDFE1中则为Trp-358、Trp-419和Trp-424。多个比对和蛋白质结构模型的保守模式共同表明，PpYTHDFE1具有m6A识别功能。随后，我们纯化了带有谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签的重组蛋白PpYTHDFE1（GST-PpYTHDFE1），并进行了电泳迁移率变化实验（EMSA），以评估PpYTHDFE1结合m6A修饰RNA的能力。为了验证PpYTHDFE1的RNA结合活性是否依赖于m6A修饰，我们设计了5’生物素标记的RNA探针，其中包含m6A修饰和未修饰的UGUAA基序。实验结果表明，GST-PpYTHDFE1特异性结合m6A修饰的探针，而不结合未修饰的探针。此外，为了阐明芳香笼结构在YTH结构域中结合m6A的作用，我们纯化了点突变蛋白GST-PpYTHDFE1m（W451A）进行EMSA分析（图1F）。这种突变蛋白无法结合m6A修饰的RNA，证实了PpYTHDFE1的m6A结合能力依赖于由保守色氨酸残基形成的芳香笼的完整性。

在确定了PpYTHDFE1具有m6A识别功能且其表达在低温条件下显著增强后，我们使用三个生物学重复实验进行了m6A-seq分析，以研究水果冷藏过程中的m6A变化。每个文库产生了3300万到5500万个原始读数（表S1）。分别在C0d、C0dS3、C7d和C7dS3阶段发现了12,050个、12,108个、11,238个和11,435个高置信度的m6A峰值（图S3A）。平行RNA-seq分析估计每个转录本中有0.6到0.7个m6A峰值（表S2），这一水平与拟南芥和草莓中的情况相当（Wei等人，2018年；Bian等人，2024年；Zhou等人，2019年、2021年），表明m6A修饰是桃子mRNA的常见特征。大部分含有m6A的转录本（约60%）只有一个m6A峰值（图S3B）。经过7天冷藏后，具有两个或更多m6A峰值的转录本比例下降，而只有一个m6A峰值的转录本比例增加。m6A峰值的基序分析发现了一个UGUAY（Y代表A、U、G或C）序列基序（图S3C），这与拟南芥和番茄中的发现一致（Wei等人，2018年；Bian等人，2024年；Zhou等人，2019年）。对m6A峰值在转录本中的分布进行评估后发现，3'非翻译区（3'UTR）和终止密码子附近m6A富集度较高（53.8%至61.9%），这与在番茄和草莓果实中的先前观察结果一致（Zhou等人，2021年、2019年）。在低温（C7d）下储存的果实中，3'UTR和终止密码子处的m6A密度高于其他阶段（图S3D）。

为了进一步研究m6A在低温响应中的作用，我们将基因分为两类：m6A靶向基因和非m6A靶向基因。通过分析这些基因的表达变化，我们观察到m6A对基因表达具有稳定作用，使转录组保持相对稳定状态（图S4）。接下来，我们分析了冷藏后转录组的变化，发现4966个转录本显著减少，4841个转录本在解除冷藏后显著增加（图2A）。然后，我们鉴定了2553个在低温响应中具有m6A修饰的差异表达基因（DEGs）。GO富集分析显示“mRNA修饰”、“低温适应”和“质体组织”等术语高度富集，这些都与我们关于冷藏期间转录后调控的核心机制密切相关。此外，与细胞壁相关的术语如“细胞壁果胶生物合成过程”、“细胞壁果胶代谢过程”、“细胞壁多糖生物合成过程”和“细胞壁大分子生物合成过程”也高度富集（表S3、S4），表明细胞壁代谢在冷藏期间非常活跃，并受到m6A修饰的调控。

此外，我们还筛选了在低温下被激活但在转移到20℃后减少的基因转录本，发现5331个在冷藏后显著增加的转录本，以及5459个在解除冷藏后显著减少的转录本（图S5）。共有2198个DEGs在低温下被激活且具有m6A修饰（表S5）。GO富集分析显示“泛素-蛋白转移酶活性”、“氨酰转移酶活性”、“酰基转移酶活性”和“钙依赖性蛋白激酶活性”高度富集（表S6）。这些结果表明，在冷藏期间形成了一个与m6A修饰相关的复杂调控网络，整合了蛋白质水解（泛素化）、蛋白质和脂质修饰以及钙信号传导等过程。

PpYTHDFE1不能直接影响与成熟相关的基因。Venn图显示了从C0d到C7d的DEGs重叠情况，从C7d到C7dS3的DEGs增加情况，以及m6A基因的情况。B数据显示，PpCBF6的表达在冷藏过程中显著增强。数据以三个独立生物学重复实验的平均值±标准差（SD）表示。显著差异（Tukey多重范围测试，P < 0.05，F = 10,087）用不同的小写字母表示。FPKM表示每百万碱基对的片段数。C数据显示了PpNAC1在冷藏过程中的表达情况。数据以三个独立生物学重复实验的平均值±SD表示。显著差异（Tukey多重范围测试，P < 0.05，F = 876.6）用不同的小写字母表示。D数据显示了桃子在储存过程中的乙烯释放率。显著差异（Tukey多重范围测试，P < 0.05，F = 122.5）用不同的小写字母表示。数据以三个独立生物学重复实验的平均值±SD表示。E数据显示了PpACO1在冷藏过程中的表达情况。数据以三个独立生物学重复实验的平均值±SD表示。显著差异（Tukey多重范围测试，P < 0.05，F = 12,597）用不同的小写字母表示。F数据显示了PpYTHDFE1在体内的结合亲和力（ns，无显著差异；Student's t测试，t = 0.04021，df = 4）。数据以平均值±SD表示（n = 3，每个生物学重复用一个点标记）。

此外，我们还筛选了在低温下被激活但在转移到20℃后减少的基因转录本，发现5331个在冷藏后显著增加的转录本，以及5459个在解除冷藏后显著减少的转录本（图S5）。总共鉴定出2198个在低温下被激活且具有m6A修饰的DEGs（表S5）。GO富集分析显示“泛素-蛋白转移酶活性”、“氨基酰转移酶活性”、“酰基转移酶活性”和“钙依赖性蛋白激酶活性”高度富集（表S6）。这些结果表明，在冷藏期间形成了一个与m6A修饰相关的复杂调控网络，整合了蛋白质水解（泛素化）、蛋白质和脂质修饰以及钙信号传导等过程。

低温响应和成熟的转录及激素调节因子

C重复序列结合因子（CBF）通路介导的冷信号级联反应是植物物种中进化保守的调控模块（Xie等人，2018年；Mei等人，2023年）。全基因组分析在桃子中鉴定出六个CBF基因，其中PpCBF6是主要的冷响应成员（Duan等人，2023年）。我们观察到PpCBF6具有显著的冷诱导性，在4℃储存7天后转录诱导程度增加了46倍（图2B）。尽管PpCBF6转录本没有m6A修饰（表S7），但对桃子Cold-Regulated Genes（COR）同源物的分析显示，46.7%（49/105）的COR基因具有m6A修饰（表S7），表明CBF和m6A共同调控下游冷响应基因。接下来，我们系统地分析了植物转录因子数据库（Jin等人，2017年）中注释的转录因子（TFs）的表达动态和m6A谱型（表S8）。定量分析显示，39.1%（587/1500）的检测到的TFs具有m6A修饰，表明TFs在低温下受到广泛的转录后调控。值得注意的是，我们发现之前认为与果实冷响应有关的TF PpMADS2（Prupe.5G208400）在低温下发生m6A修饰，并伴随着转录抑制。比较分析发现，番茄成熟调节因子SlNOR的同源物PpNAC1（Prupe.4G187100）在20℃的保质期内表达增加（图2C），但其缺乏可检测的m6A修饰（表S8）。PpMADS2和PpNAC1 TFs之间这种对比鲜明的表观遗传调控模式突显了采后冷藏期间调控基因表达的不同分子机制。

乙烯在调节桃子成熟过程中起核心调节作用，包括质地变化，如果实软化（Wang等人，2017c；Cao等人，2024a）。我们的数据表明，在桃子冷藏过程中，随着果实硬度的保持，乙烯的产生相应减少（图2D）。先前的研究已确定PpACS1和PpACO1是参与乙烯生物合成的关键基因（De Los Cobos等人，2024年），这两个基因的表达在低温下被抑制（图2E；表S9），这证实了之前的研究结果（Wang等人，2017c）。值得注意的是，虽然在PpACO1转录本上检测到m6A修饰（图S6），但m6A识别蛋白PpYTHDFE1对这些修饰的mRNA没有结合亲和力（图2F）。重要的是，尽管乙烯应用可以加速果实软化（Cao等人，2024a），但它不能显著改变PpYTHDFE1的表达（图S7）。这一观察结果进一步得到了1-甲基环丙烯（1-MCP）处理后PpYTHDFE1未受到抑制的支持，1-甲基环丙烯是一种已知的乙烯信号抑制剂。这些综合发现表明，PpYTHDFE1独立于乙烯生物合成途径发挥作用，而乙烯信号传导不调节PpYTHDFE1的表达。此外，还分析了与脱落酸（ABA）、生长素（IAA）和茉莉酸（JA）合成及信号传导相关的转录本的表达模式和m6A修饰谱型（表S9）。这显示了一个复杂的m6A介导的转录和激素介导的调控网络。

为了阐明果实质地的表观转录组调控机制，我们对2553个差异表达基因（DEGs）中编码参与果实软化酶的转录本进行了系统分析（图2A、3A）（Shi等人，2023年）。鉴定出三个表现出m6A峰值的细胞壁基因：果胶甲基酯酶PpPME2（Prupe.2G279800）、内聚半乳糖醛酸酶PpPG10（Prupe.2G014800）和膨胀蛋白PpEXP3（Prupe.6G075100）。PpPME2和PpPG10的转录本与果实硬度无关，或其表达水平相对较低（FPKM < 10）。因此，膨胀蛋白PpEXP3的转录本被选为唯一在四个储存阶段都显示保守甲基化的显著冷响应m6A靶标。转录动态的定量分析显示，PpEXP3在4℃冷藏期间的表达下降了九倍，但在转移到20℃后迅速增加（表S10；图3A）。这种表达谱型的显著变化与PpYTHDFE1的积累呈强烈负相关（r = ?0.829，P < 0.01，图S8），并与PpEXP3在桃子软化中的作用一致（De Los Cobos等人，2024年）。

PpYTHDFE1与m6A-PpEXP3 mRNA结合并加速其降解。A显示了细胞壁基因的表达谱型和m6A甲基化状态。数据以三个独立生物学重复实验的平均值表示。热图从蓝色到红色逐渐变化，反映了归一化的FPKM强度。具有m6A修饰的基因用红星标记。PpEXP3在储存期间的m6A甲基化状态通过综合基因组浏览器（IGV）显示。输入的读数显示在前景中。黄色矩形指示3'非翻译区（3’UTR）中的m6A靶标位置。B显示了GST-PpYTHDFE1特异性结合m6A修饰的PpEXP3。每个通道加载了逐渐减少的蛋白质浓度和一致量的RNA oligo，最终浓度为10 nM。C显示了PpYTHDFE1在体内的结合亲和力（***，P < 0.001；Student’s t测试，t = 32.20，df = 4）。数据以平均值±SD表示（n = 3，每个生物学重复用一个点标记）。D和E显示了在桃子肉质愈伤组织中过表达（D）和RNA干扰（RNAi）（E）PpYTHDFE1时PpYTHDFE1的表达情况，证明了其对PpEXP3表达的负调控作用（*，P < 0.05，**，P < 0.01；Student’s t测试）。空向量作为对照。数据以三个独立生物学重复实验的平均值±SD表示。F和G显示了基于拟南芥叶片（F）和桃子肉质愈伤组织（G）过表达PpYTHDFE1的RNA稳定性实验结果，表明PpYTHDFE1可以加速PpEXP3 mRNA的降解。数据以平均值±SD表示（n = 3，每个生物学重复用一个点标记）。

相比之下，没有观察到内聚半乳糖醛酸酶（PG）如PpPG21（Prupe.4G261900）和PpPG22（Prupe.4G262200）的m6A修饰（表S10）（Qian等人，2021年），这些基因与桃子软化有关（Qian等人，2021年）。此外，与PpEXP3不同，PpPG21和PpPG22在低温储存后的表达增加，表明不同细胞壁基因的调控机制不同。

我们使用生物素标记的RNA探针针对PpEXP3的3’UTR区域，证明了PpYTHDFE1通过结合并在转录后调控PpEXP3 mRNA来直接调节果实硬度的维持。RNA-EMSA结果显示，m6A修饰的PpEXP3探针被GST-PpYTHDFE1蛋白识别，并且随着反应混合物中蛋白质浓度的增加，结合程度增加。当探针中的m6A residues被腺嘌呤（A）取代时，GST-PpYTHDFE1无法识别RNA探针，结合也就消失了（图3B），这表明蛋白质-RNA之间的相互作用依赖于m6A修饰。为了确立功能相关性，我们使用针对PpYTHDFE1的多克隆抗体对桃子果实进行了RIP-qPCR实验，以免疫沉淀蛋白质及其相关的RNA。RIP-qPCR结果显示，与IgG相比，免疫沉淀复合物中的PpEXP3转录本增加了大约13倍（图3C，P<0.001）。这种体内验证结合我们在体外获得的生化证据（图3B），确凿地证明了PpYTHDFE1能够识别PpEXP3 mRNA上的m6A修饰标记。

PpYTHDFE1加速了PpEXP3 mRNA的降解。我们的发现证实了PpYTHDFE1对PpEXP3转录本的m6A依赖性识别。由于缺乏合适的转基因桃子系统，我们开发了一种使用桃子果肉克隆愈伤组织实现的同源瞬时表达系统。重要的是，这些细胞系在低温处理（4℃）下仍能保持PpYTHDFE1的天然诱导，表现出转录激活增加了三倍（图S9），从而为功能研究提供了生物学依据。通过农杆菌介导的瞬时过表达（诱导八倍），PpEXP3转录本减少了十倍（图3D）。相反，RNA干扰（RNAi）介导的敲低导致PpEXP3转录本增加了两倍（图3E）。这种反向调节在低温储存果实的转录组中得到了强烈证实（P<0.001，图S8），从而确认了PpYTHDFE1作为PpEXP3转录本的转录后负调控因子。

为了更深入地了解PpYTHDFE1的作用机制，我们在翻译独立条件下进行了转录抑制实验。在异源系统（Nicotiana benthamiana，图3F）和同源系统（桃子果肉愈伤组织，图3G）中，过表达PpYTHDFE1的细胞系在放线菌D处理后，PpEXP3转录本的半衰期分别减少了大约58%和30%。这种上位性关系表明，PpYTHDFE1通过直接的RNA-蛋白质相互作用加速m6A标记的PpEXP3降解，而不是通过转录调控。

先前的研究已经表明，m6A读取蛋白通过液-液相分离（LLPS）来调控RNA代谢的变化。为了研究PpYTHDFE1的生物物理性质，我们进行了结构预测，发现了其内在无序区域（IDRs）和类似朊病毒的结构域（PrLD，残基83-171）（图4A）。使用GFP-PpYTHDFE1重组蛋白，我们观察到在含有20% PEG8000的样品溶液中出现了浑浊现象，而GFP蛋白或BSA则没有这种现象（图4B）。

基于这些体外观察结果，我们在N. benthamiana和桃子果肉愈伤组织中利用农杆菌介导的瞬时表达系统（图4C）研究了PpYTHDFE1的定位。共聚焦显微镜显示，PpYTHDFE1-GFP在这两个系统中形成了动态的凝聚体，这与GFP对照组的弥散胞质定位形成对比。删除PrLD结构域后，PpYTHDFE1△PrLD-GFP失去了形成动态凝聚体的能力（图S10），表明PrLD结构域在LLPS中起着关键作用。时间延迟成像捕捉到了快速融合事件（15秒内完全合并），证明了PpYTHDFE1-GFP凝聚体的流动性（图4D）。为了进一步研究这些胞质凝聚体的液态特性，我们进行了荧光恢复（FRAP）实验来分析漂白后的动态变化。结果表明PpYTHDFE1-GFP液滴在烟草叶片中的荧光强度在160秒内从30%恢复到80%（图4E）。在桃子果肉愈伤组织中也观察到了类似的结果，PpYTHDFE1-GFP液滴的荧光强度在漂白后从25%增加到45%（图4F）。这些发现共同表明PpYTHDFE1经历了LLPS。

我们的功能基因组学方法揭示了PpYTHDFE1对细胞壁松弛基因PpEXP3的转录后调控作用。为了确立表型因果关系，我们在桃子果肉（品种“Hujingmilu”）中进行了农杆菌介导的瞬时转化实验，结果表明PpYTHDFE1过表达使PpEXP3转录本减少了十倍（P<0.001），同时使组织硬度增加了44%（P<0.05，图5A）。相比之下，PpEXP3过表达导致硬度下降了32%，但没有影响PpYTHDFE1的水平，证实了这种单向调控。一种新的基于愈伤组织的硬度测定方法（TA-XT2i加纹理分析仪，7.9毫米探针）也得到了相同结果：过表达PpYTHDFE1的愈伤组织硬度增加了39%，而过表达PpEXP3的愈伤组织硬度下降了41%（图5C）。值得注意的是，过表达PpYTHDFE1后，与乙烯合成相关的基因PpACO1的转录水平没有变化（图S11）。

PpYTHDFE1通过加速低温条件下PpEXP3 mRNA的降解来调控果实的硬度。条形图显示了过表达PpYTHDFE1和PpEXP3的桃子果肉中的PpYTHDFE1和PpEXP3表达水平。小提琴图显示了过表达PpYTHDFE1和PpEXP3的桃子果肉硬度结果（*，P<0.05，**，P<0.01，***，P<0.001；学生t检验）。空向量作为对照。示意图展示了桃子果肉愈伤组织硬度测试的过程。条形图显示了过表达PpYTHDFE1和PpEXP3的桃子果肉愈伤组织中的PpYTHDFE1和PpEXP3表达水平。小提琴图显示了过表达PpYTHDFE1和PpEXP3的桃子果肉硬度结果（*，P<0.05，***，P<0.001；学生t检验）。空向量作为对照。D和E显示了PpYTHDFE1和PpEXP3基因表达与低温储存期间硬度的相关性，但在正常储存期间则没有这种相关性。这些数据基于我们之前的研究（Duan等人2023年）和当前的数据（G）。实线代表线性回归线，虚线代表95%置信区间。p值表示相关性分析结果的显著性。

这种调控模块的保守性通过开发35S:PpYTHDFE1转基因番茄得到了验证（第2代），这些番茄的果实硬度提高了45%（P<0.001，图S12A），且未影响乙烯的产生（图S12B）。“Hujingmilu”是一种不易烂熟的桃子品种，我们想了解低温对PpYTHDFE1和PpEXP3的调控作用是否在不易烂熟的桃子品种“Qingzhoumi”中也存在，因此我们在低温储存期间检测了它们的表达模式。结果表明，低温可以显著保持果实硬度（图S13A），同时激活了PpYTHDFE1的表达并抑制了PpEXP3的转录水平（图S13B），揭示了这种低温响应机制的保守性。元分析显示，在低温储存条件下，PpYTHDFE1的表达与硬度呈正相关（P<0.001），而PpEXP3则呈负相关（P<0.001）。

低温对植物的适应性、生长和采后生理有深远影响，尤其是在易腐烂的水果中。虽然冷藏可以通过抑制细胞壁解体来延缓软化，但其背后的分子机制尚未完全明了。在桃子中，Wang等人发现低温导致参与细胞壁修饰和乙烯生物合成的酶的转录本显著减少，这与硬度增加有关（Wang等人2017c）。尽管有证据表明转录水平的变化通常由转录因子调节（Shi等人2022），但这种减少的机制尚未被研究。我们的整合转录组和表观转录组研究表明，YTHDF类型的m6A读取蛋白PpYTHDFE1通过LLPS将低温感知与转录后调控相结合，选择性地破坏了编码细胞壁松弛蛋白（如PpEXP3）的转录本（图6）。

在低温储存期间，PpYTHDFE1的表达增加并发生相分离。PpYTHDFE1选择性地结合到经过m6A修饰的PpEXP3转录本上，后者是一种与果实硬度相关的细胞壁松弛基因，并加速了这些转录本的降解。这种相互作用减少了PpEXP3转录本的数量，从而导致细胞壁重塑，从而维持了桃子的硬度。这一调控机制的核心是PpEXP3的识别，这是一种其转录本在采后储存期间经历m6A修饰和温度依赖性降解的扩展蛋白（图3和5）。系统发育和共表达分析表明，EXP家族蛋白在细胞壁松弛中起着非酶促的促进作用（Cosgrove 2024）。例如，对604个桃子RNA-seq数据集的共表达网络分析显示了PpEXP3在软化过程中的作用（De Los Cobos等人2024），并促进了细胞壁基质的分解（Shi等人2023）。苹果果实的硬度由MdEXP-A1基因控制（Su等人2025），而SlExp1和SlCel2的协同作用驱动了番茄的软化（Su等人2024），尽管果胶代谢也在软化中起作用（Shi等人2023；Ortega-Salazar等人2024）。有趣的是，EXPs的表达在器官特异性调控中表现出显著的环境适应性。例如，在甘薯叶片和根部下调（Noh等人2009），而在拟南芥种子和中柱花药中上调（Yamauchi等人2004；Imin等人2004）。这种灵活性使得在不同的发育和压力条件下可以精确地重塑细胞壁，包括通过EXP转录重编程介导的盐度响应（Kwon等人2008；Zhang等人2014）。这种适应性在拟南芥中也得到了进化上的保守，其中同源基因AtECT8在盐度条件下会破坏AtEXPA6（Cai等人2024）。这种跨物种的平行性表明，m6A读取蛋白作为环境传感器，在非生物胁迫下微调细胞壁动态。在这里，我们证明了低温诱导的PpEXP3降解是由m6A读取蛋白PpYTHDFE1介导的，且这一机制在不同品种间是保守的（图S13）。此外，只有PpYTHDFE1对低温有反应，而其他七个读取蛋白则不受低温影响（图1D）。

先前的研究表明，植物中的CBF依赖性低温响应涉及COR基因的转录调控（Xie等人2018；Mei等人2023）。在桃子中，我们观察到了双层调控机制：COR基因的转录激活与表观转录组对转录水平的精细调节相结合。具体来说，46.7%（49/105）的CBF靶标发生了m6A修饰（表S7）。PpCBF6表现出热敏感性诱导动力学，在4℃储存七天后达到最大激活，然后在暴露于环境温度后返回基础水平（图2B）。需要进一步研究以确定m6A读取蛋白是否影响COR基因转录本的稳定性，以及低温是如何诱导m6A读取蛋白PpYTHDFE1表达的。有趣的是，PpYTHDFE1的作用不仅限于细胞壁重塑，还体现在其他过程中，如泛素化、激酶信号传导和应激激素响应中m6A转录本的富集（图S5；表S5、S6），表明它可能是在其他遗传性低温适应反应中的多功能枢纽。

在室温下桃子果实成熟过程中，乙烯生物合成基因（如PpACS1和PpACO1）由PpNAC1转录激活，驱动成熟相关事件（Cao等人2024a）。然而，内源乙烯激增、外源乙烯处理或1-MCP均未改变PpYTHDFE1的表达（Wang等人2025）（图S7），表明它与经典的乙烯信号传导途径脱钩。值得注意的是，低温储存通过抑制PpACS1和PpACO1的表达来抑制乙烯的产生，这在桃子中也有报道（Duan等人2023；Wang等人2017c）。重要的是，这里描述的PpYTHDFE1介导的mRNA降解独立于乙烯（图2F）。表达PpYTHDFE1的桃子果肉和愈伤组织其硬度分别增加了44%和39%（图5），但并未改变关键乙烯合成基因PpACO1的表达（图S11），这与PpYTHDFE1不识别PpACO1的结果一致（图2F）。同样，过表达PpYTHDFE1的转基因番茄其果实硬度也增加了45%，且没有影响乙烯的产生或成熟进程（Wang等人，2025年）（图S12）。这些发现揭示了一个先前未被认识的调控轴，即通过特定的冷诱导m6A读取器对细胞壁松弛基因（如PpEXP3）进行表转录组调控，这与激素途径并行运行。虽然乙烯介导的果实成熟和软化过程中的转录调控已被广泛研究（Seymour等人，2013年；Shi等人，2023年；Li等人，2020年），但我们的研究表明了一条与乙烯无关的采后质地调控途径，并为在不影响成熟进程的情况下延长果实保质期提供了可转化的框架。然而，还需要考虑寒冷对果实其他质量方面的影响（Duan等人，2023年）。我们的发现通过将表转录组学与环境感知相结合，重新定义了采后生物学的范式。m6A读取器作为细胞壁动态的热敏调节因子的发现，为培育耐气候的作物和减少采后损失提供了新的途径。例如，靶向YTH-EXP节点可以将延长保质期与延迟成熟等不良特性分开，这对于昼夜节律性水果来说是一个重要的进展。通过阐明低温如何重塑表转录组，这项研究将分子洞察转化为实际应用，从而在气候不确定的时代推进了可持续园艺的发展。此外，这一机制的进化保守性表明其在包括盐度和干旱在内的各种非生物胁迫下的广泛适用性。

**方法**

**植物材料和处理**
本研究使用了从中国浙江省宁波市的一个果园收获的白色果肉、可溶性果肉的桃子（Prunus persica L. Batsch.，品种Hujingmilu）在商业成熟期采集的果实。选择外观无缺陷的均匀果实进行采后储存。这些桃子被随机分成两组，分别在4℃和相对湿度90%的条件下储存0天和7天，标记为C0d和C7d。然后从每组中随机选取一半的果实转移到20℃的环境中再储存3天，标记为C0dS3和C7dS3。另外，从中国山东省临沂市的一个果园收获了白色果肉、不可溶性果肉的桃子（Prunus persica L. Batsch.，品种Qingzhoumi）在商业成熟期采集的果实。同样选择外观无缺陷的均匀果实进行采后储存。这些桃子被随机分成两组，分别在4℃和20℃和相对湿度90%的条件下储存5天。在每个时间点采集大约5毫米厚的果肉组织切片，将其冷冻在液氮中，并储存在-80℃下进行生化和分子分析。每个处理准备三个生物学重复实验，每个重复实验至少使用五个果实。

**果实乙烯产生和硬度分析**
乙烯产生的测量方法如前所述（Duan等人，2023年）。将果实置于1.8升的密闭容器中一小时以测量乙烯产生量。然后从容器中抽取1毫升气体样本注入配备火焰离子化检测器的气相色谱仪（GC）（Agilent Technologies 6890 N GC System，美国）。烤箱、进样器和检测器的温度分别设置为100℃、140℃和230℃。果实硬度使用TA-XT2i plus质构分析仪（Stable Micro System，英国）进行测量，该分析仪配备7.9毫米直径的探针。穿刺深度为10毫米，穿刺速度为1毫米/秒。每个果实测量两次，总共测量不少于9个果实。对于短暂过表达PpYTHDFE1的果肉和愈伤组织，穿刺深度为5毫米，穿刺速度为1毫米/秒。每个组织测量两次，总共测量不少于9个组织切片。

**系统发育分析和结构表征**
系统发育树是使用MEGA X软件（Kumar等人，2018年）构建的，参数设置为邻接连接（NJ）方法和泊松校正，以及成对删除和1000次自助法重复。所有YTH结构域蛋白的多序列比对使用Clustal X 2.0进行。蛋白质的AI预测二级结构从AlphaFold蛋白质结构数据库（https://alphafold.ebi.ac.uk/）下载（Tunyasuvunakool等人，2021年）。

**蛋白质表达和RNA电泳迁移率测定（RNA-EMSA）**
从Hujingmilu的cDNA中克隆PpYTHDFE1的编码序列，并插入pGEX-GST载体中。然后将重组载体引入大肠杆菌菌株Rosetta (DE3)中。按照制造商的说明使用GST标签蛋白纯化试剂盒（Beyotime，中国）纯化蛋白质。所有用于构建载体的引物列在表S11中。

**测定GST-PpYTHDFE1和GST-PpYTHDFE1m对m6A修饰的结合亲和力**
设计了带有m6A修饰的标记RNA探针；探针的详细序列信息列在表S12中。RNA EMSA使用LightShift Chemiluminescent RNA EMSA试剂盒（Thermo Fisher Scientific，美国）按照制造商的说明进行。在RNA EMSA系统中，标记探针的浓度为10 nM，并逐步减少蛋白质含量。

**m6A-seq和数据分析**
m6A-seq的测定方法如前所述（Bian等人，2024年）。简而言之，从上述C0d、C7d、C0dS3和C7dS3阶段的桃子果皮组织中提取总RNA。使用Agilent 2100生物分析仪（Agilent，G2939A）评估RNA完整性。然后使用DynabeadsTM mRNA纯化试剂盒（Invitrogen，美国）纯化mRNA，并通过将mRNA在RNA断裂缓冲液（10 mM Tris–HCl，10 mM ZnCl2，pH 7.0）中孵育10分钟将其片段化为约200个核苷酸长的片段。通过添加100 mM EDTA终止断裂反应，并用异丙醇沉淀收集片段。总共保留500 ng的片段mRNA作为输入对照。

**m6A免疫沉淀（m6A-IP）**
将5 μg的片段mRNA与2 μg的抗m6A多克隆抗体（Synaptic Systems，德国）在含有10 mM Tris-HCI，pH 7.4，150 mM NaCl，0.1% IGEPAL CA-630（v/v）和300 U/mL RNase抑制剂（Takara，日本）的400 μL免疫沉淀缓冲液中孵育2小时。在4℃下混合2小时后，洗涤Dynabeads Protein-A（Thermo Fisher Scientific，美国）并加入进行免疫沉淀，然后用6.7 mM N6-甲基腺苷（Sigma，美国）在IP缓冲液中洗脱以释放结合的mRNA。用异丙醇沉淀（50%异丙醇（v/v）和136 mM CH3COONa，pH 5.2）在4℃下过夜沉淀洗脱的mRNA。总共使用50 ng的免疫沉淀mRNA或输入对照用于NEBNext Ultra II RNA文库构建试剂盒（NEB，美国）构建文库。使用Illumina NovaSeq 6000进行高通量测序，配对末端读取长度为150 bp，遵循标准协议。m6A-seq分析使用三个独立的生物学重复实验，每个重复实验至少包含五个桃子果实。

**m6A-seq原始读数的质量评估**
使用FastQC工具评估m6A-seq的原始读数质量。使用Trimmomatic（Bolger等人，2014年）去除具有接头污染、低质量碱基或长度少于30个核苷酸的读数。然后使用HISAT2（Kim等人，2015年）将干净的读数与Prunus persica v2.1的参考基因组比对。使用R包exomePeak2（Meng等人，2014年）对映射的读数进行峰调用。使用相同的软件对识别的峰进行注释。我们只将所有三个生物学重复实验中一致检测到的m6A峰指定为高置信度m6A峰进行进一步分析。使用HOMER软件（http://homer.ucsd.edu/homer/）识别m6A峰的保守序列基序，并使用IGV软件（http://www.igv.org/）可视化m6A峰。

**RIP-qPCR**
RIP-qPCR的测定方法如前所述（Bian等人，2024年）。使用1%甲醛溶液固定C7d阶段的果实样本，然后用0.125 M甘氨酸溶液终止固定。将固定的组织研磨成粉末，将5克这种粉末溶解在7.5毫升裂解缓冲液中（50 mM Tris–HCl，pH 7.5，300 mM KCl，5 mM MgCl2，5 mM DTT，0.2% Triton X-100，2%甘油，1 mM PMSF，1×蛋白酶抑制剂）。在4℃下裂解30分钟后离心收集上清液。使用上清液的10%作为输入。剩余的上清液分成两等份，分别加入等量的多克隆抗PpYTHDFE1抗体（Abmart，中国）或IgG（ABclonal，中国），这些抗体与Pierce? Protein A磁珠（Thermo Fisher Scientific，美国）结合，并在4℃下过夜进行免疫沉淀。用洗涤缓冲液（25 mM Tris–HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，0.05% Tween-20，1 mM PMSF，1×蛋白酶抑制剂，80 U/mL RNase抑制剂）洗涤磁珠五次。然后用蛋白酶K和DNase I消化后，使用RNAiso Plus（Takara，日本）提取RNA。提取的RNA用作使用HiScript II Q RT SuperMix（Vazyme，#R223）合成互补DNA（cDNA）的模板。使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme，Q711）在CFX96 Real-Time PCR系统（Bio-Rad，Hercules，CA，美国）上进行定量实时PCR（qRT-PCR）。这个测定使用三个独立的生物学重复实验。所有用于RIP-qPCR的引物列在表S11中。

**通过根癌农杆菌在愈伤组织中的瞬时过表达**
在愈伤组织中瞬时过表达的方法改编自Ni等人（Ni等人，2023年）。使用表S11中指定的引物将目标基因的完整编码序列（CDS）克隆到pCambia1300-221载体中。这些重组载体以及一个空载体通过化学转化导入根癌农杆菌GV3101。从Prunus persica L. Batsch cv. Hujingmilu成熟果实的果肉组织中诱导愈伤组织。将愈伤组织小心转移到细菌悬浮液中（OD600=0.8）并浸泡10分钟。然后通过三层纱布过滤混合物，并用无菌滤纸吸收愈伤组织表面的任何剩余细菌悬浮液。将感染的愈伤组织转移到含有20 mg/L AS的固体SH培养基中，表面铺有滤纸。在24℃和60%相对湿度的黑暗条件下共培养3天后，将感染的愈伤组织转移到含有50 mg/L卡那霉素（Kan）的固体SH培养基中进行筛选。培养物在黑暗中保持4天后再取样。固体SH培养基的成分是：13.2 g/L SH，20 g/L蔗糖，1 g/L PVP和7 g/L琼脂。

**通过根癌农杆菌在愈伤组织中的瞬时RNAi沉默**
使用适当的引物（表S11）克隆PpYTHDFE1编码区域的400 bp片段，并通过Gateway技术插入pHELLSGATE2基因沉默载体中。将经过序列验证的重组载体以及空载体转移到根癌农杆菌GV3101中。如上所述进行感染后，将愈伤组织冷冻在液氮中并在-80℃下储存以进行生化和分子分析。

**通过根癌农杆菌在果实果肉中的瞬时过表达**
如我们之前的研究（Cao等人，2024b）所述，在桃子果实中进行瞬时过表达。使用表S11中指定的引物将目标基因的完整编码序列（CDS）克隆到pCambia1300-221载体中。将这些重组载体和一个空载体通过化学转化导入根癌农杆菌GV3101，并在28℃下培养直到OD600达到0.8。用0.5% NaClO消毒果实表面10分钟后，从每个果实的对立面切下两个0.8厘米厚的果肉块。携带目标基因或空载体的根癌农杆菌在70 kPa的真空下渗透到果肉中。然后用无菌水冲洗组织三次，并在Murashige和Skoog（MS）培养基中培养3天（25℃，85%相对湿度）。然后对果肉块进行硬度分析。每个处理重复三次，每次使用三个果实。

**RNA分离和定量实时PCR（qRT-PCR）分析**
使用FastPure Universal Plant Total RNA Isolation Kit（Vazyme，中国）从样本中提取总RNA。然后使用HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR（+ gDNA wiper）（Vazyme，中国）合成cDNA以进行qPCR。定量RT-PCR实验在CFX96系统（Bio-Rad，Hercules，加利福尼亚州，美国）上进行，使用的试剂为ChamQ SYBR qPCR Master Mix（Vazyme，中国）。PpTEF2（Prupe.4G138700）作为内参。基因表达水平通过2?ΔΔCt方法进行量化，具体方法参考Schmittgen & Livak（2008）的描述。引物列表见表S11。

**mRNA稳定性检测**
mRNA稳定性检测按照先前Bian等人（2024）的方法进行，使用瞬时过表达PpYTHDFE1的烟草本氏草（Nicotiana benthamiana）叶片和果肉愈伤组织作为实验对象，空白载体作为对照。叶片和果肉愈伤组织被 infiltration 浸泡在含有20 μg/mL 放线菌素D的溶液中。真空渗透1分钟后静置孵育5分钟，随后在0小时时收集样本，并在1小时、2小时和4小时时分别收集额外样本。之后通过上述方法（qRT-PCR）检测这些样本中的基因mRNA表达水平。所有用于PCR扩增的引物均列于表S11中。数据分析采用GraphPad Prism 9.5软件提供的非线性回归单相衰减模型。

**LLPS检测**
LLPS检测方法基于Luo等人（2023）的研究，但有所修改。为了表达和纯化GFP-PpYTHDFE1重组蛋白，将PpYTHDFE1的 coding sequence (CDS) 克隆并插入包含N端GFP的pET-N表达载体中。用于载体构建的引物列于表S11中。将该载体转化至大肠杆菌Rosetta (DE3) 中，在16°C下加入0.1 mM异丙基β-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白质表达20小时。之后收集细胞，并在含有25 mmol/L HEPES（pH 7.4）和200 mmol/L NaCl的溶液中通过超声波破碎细胞。在4°C下以10,000 g离心40分钟后，上清液通过HisTALON Gravity Column（Takara，日本）进行分离。结合的蛋白质用洗脱缓冲液（25 mmol/L HEPES（pH 7.4）、200 mmol/L NaCl和150 mmol/L imidazole）洗脱。为了观察GFP-PpYTHDFE1的体外相分离能力，将纯化后的蛋白稀释至10 μM，并与20%（m/v）PEG 8000以1:1比例混合，同时使用BSA蛋白和GFP蛋白作为对照。

**体内相分离能力观察**
为了观察PpYTHDFE1的体内相分离能力，利用Zeiss LSM880共聚焦激光扫描显微镜（Carl Zeiss AG，德国）观察瞬时过表达蛋白的烟草叶片和愈伤组织，显微镜配备有×20、×40和×60倍的物镜。GFP荧光在488 nm处激发，在490–535 nm处检测。

**时间序列显微镜观察**
时间序列显微镜观察在同一台显微镜下进行，每秒记录一次GFP荧光图像，持续5分钟，数据用ZEISS ZEN lite软件分析。在FRAP检测中，使用488 nm激光脉冲以70%的强度对GFP荧光进行漂白处理，每秒记录一次荧光恢复情况，持续5分钟。

**统计分析**
统计分析使用GraphPad Prism 9.5软件完成。成对比较采用非配对t检验。多重比较通过ANOVA分析后进行Tukey检验，统计显著差异（P < 0.05）用不同的小写字母表示。RNA稳定性分析采用的拟合模型基于GraphPad Prism 9.5软件提供的单相衰减模型。相关性分析同样使用GraphPad Prism 9.5软件进行，计算皮尔逊相关系数。