患病土壤的微生物组与挥发性有机化合物分析及其与由Ralstonia solanacearum引起的番茄萎蔫病的关联

《Phytopathology Research》：Microbiome and volatile organic compound profiling of diseased soils and their association with tomato wilt caused by Ralstonia solanacearum

　　摘要
土壤挥发性有机化合物（VOCs）对于抑制土传病原体至关重要，然而它们的微生物来源、功能机制以及对疾病抑制的贡献仍需进一步探索。本研究调查了两种番茄连作区域土壤中VOCs在抵抗细菌性萎蔫病原体Ralstonia solanacearum方面的作用。在致病性和抑制性土壤中，抑制性土壤表现出最低的疾病发生率（0.37%）和病原体负荷（9.6×103 CFU/g），这与VOCs对R. solanacearum生长和疾病发展的强烈抑制作用有关。GC–MS分析鉴定出13种与疾病指数显著相关的VOCs，包括萘、2-十一酮和木酚素，这些化合物在体外抑制了病原体生长，并促进了植物生长和防御酶（CAT和SOD）的产生。扩增子测序显示致病性和抑制性土壤之间的微生物群落多样性和组成存在差异，其中链霉菌（Streptomyces）是主要的疾病抑制菌类。从抑制性土壤中分离出的10株链霉菌证实了它们在无菌土壤中恢复VOCs抑制作用的能力，其中Stre2菌株实现了46.17%的病原体抑制率。相关性分析、Procrustes分析和变异分配分析（VPA）表明，土壤物理化学性质和微生物因素共同决定了土壤VOCs的组成，但细菌群落也具有显著的直接影响（11.1%的独特贡献）。我们的结果表明，抑制性土壤利用微生物产生的VOCs来抑制R. solanacearum并增强植物防御机制，为通过微生物代谢物工程实现可持续的病原体管理提供了新的见解。

背景
抑制性土壤能够抑制植物疾病（Weller等人2002；Mazzola 2007；Exposito等人2017）。经过多次土传病原体感染后，抑制性土壤能够通过微生物群落、物理化学性质和植物相互作用来识别并抑制病原体的入侵，从而保护植物健康（Schlatter等人2017）。其核心机制在于土壤具有类似于生物实体的“记忆”和“响应”能力，通过多种因素的协同作用维持生态平衡（Raaijmakers和Mazzola 2016）。与致病性土壤相比，抑制性土壤富含拮抗性微生物和拮抗物质（包括挥发性和非挥发性物质），这些物质有助于维持植物的生长发育和健康（Berendsen等人2012；Liu等人2016）。目前的研究主要集中在抑制性土壤中的微生物群落和非挥发性物质上，而挥发性有机化合物（VOCs）在这过程中的作用则被忽视（Cha等人2016；Wen等人2023）。

VOCs是低分子量（<300 Da）的亲脂性生物分子，主要来源于土壤微生物的一级和二级代谢途径（Raza等人2017；Schulz-Bohm等人2017；Weisskopf等人2021）。微生物产生的VOCs通常包括醇、烯烃、烷烃、醛、羧酸、酚类、酮类和吡嗪类（Schmidt等人2015）。大量研究表明，土壤微生物释放的VOCs通过直接抑制病原体和间接诱导植物防御机制来降低土传疾病的发病率。例如，来自Bacillus amyloliquefaciens T-5细菌的VOCs能够抑制R. solanacearum等细菌病原体和Fusarium oxysporum、Rhizoctonia solani等真菌病原体的生长和毒力（Raza等人2016；Ossowicki等人2020）。长期暴露于有益土壤细菌释放的VOCs可以驱动植物病原体发生适应性变化，增强与生存相关的特性，同时降低与毒力相关的特征，如群集运动性、生物膜形成和细胞外多糖分泌，最终导致对番茄的毒力降低（Wang等人2023）。此外，多种VOCs可以诱导植物的表型多样性并减少植物间的竞争（Raza等人2024）。植物可以“窃听”受感染植物释放的VOC信号，以调整其防御机制以应对当前或未来的生物胁迫风险（Kost和Heil 2006）。由于土壤环境的复杂性和多样性，土壤VOC的组成和排放-吸收动态受到土壤物理化学性质、微生物群落和内部环境条件的影响（Raza等人2017）。因此，土壤生物和非生物特征与土壤VOC的组成和功能之间的关系仍不清楚，特别是土壤抑制性与VOCs之间的联系。

Ralstonia solanacearum是一种广泛分布的土传植物病原菌，可引起多种作物的萎蔫病，对全球农业生产构成严重威胁（Jiang等人2017；Savary等人2019）。在这项研究中，我们选择了两个连续种植番茄的地区的R. solanacearum土壤作为研究对象。由于物理化学性质和微生物群落的差异，这些土壤具有不同的VOC组成。本研究旨在利用多组学方法分析这些土壤的VOC组成和疾病抑制功能，结合土壤疾病指数和微生物群落测量数据，以揭示土壤VOC在疾病抑制中的潜在作用及其与土壤微生物组和物理化学性质的可能联系，为未来的研究方向提供见解并解决科学挑战。

结果
我们评估了四个地区连续种植番茄区域土壤中番茄萎蔫病的发生率和R. solanacearum的种群密度。所有四个地区的土壤都发生了番茄细菌性萎蔫病，其中广西土壤的疾病发生率最高，为45.24%，其次是山东土壤（11.35%）和江西土壤（7.93%）。江苏土壤的疾病发生率最低，为0.37%（附加文件1：图S1a）。关于R. solanacearum的种群密度，广西土壤中的病原体负荷显著高于其他地区（3.85×10? CFU/g土壤），这与疾病发生率模式一致（附加文件1：图S1b）。因此，我们选择广西土壤作为致病性土壤，江苏土壤作为抑制性土壤进行后续实验验证。

**土壤VOCs对番茄细菌性萎蔫和R. solanacearum生长的影响**
经过五天的土壤VOC暴露后，不同地区之间的番茄细菌性萎蔫发病率存在显著差异。具体而言，抑制性土壤中的VOCs显著抑制了疾病的发生率，而致病性土壤则没有（图1a，b）。值得注意的是，无菌土壤失去了其对番茄疾病发展的VOC抑制作用（图1c）。为了验证土壤VOCs对病原体生长的直接影响，仅在抑制性土壤VOCs中暴露的R. solanacearum表现出显著的生长抑制（图1d，e）；然而，这种抑制作用在无菌土壤中减弱（图1f）。这些结果表明，抑制性土壤中低水平的R. solanacearum和低疾病发生率产生的VOCs能够同时抑制病原体生长和疾病发展。

**土壤VOCs组成及其关键抑制性化合物**
我们使用顶空法和液体萃取法结合GC–MS来确定土壤样本的VOC组成。根据NIST数据库，我们根据化学结构对VOCs进行了分类。有趣的是，OPLS-DA分析显示两种类型土壤VOC之间存在显著差异，T1和Orthogonal T1解释了VOC组成的58.7%的总变异（Permanova检验：R2=0.604，P=0.031，图2a）。比较两种类型土壤释放的VOCs的校正峰面积，致病性土壤显示出更多的种类和更高的相对丰度（附加文件1：图S2）。然后我们比较了两种土壤之间的VOC类别差异。抑制性土壤富含烷烃和芳香族化合物，而致病性土壤含有更多的醇类和茚类（双侧Student’s t检验；n=4，图2b和附加文件1：图S3）。

**抑制性土壤VOCs与植物疾病指数的相关性**
我们使用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）分析了两种类型土壤中VOC的差异，并进行了Permanova检验。b显示两种地区土壤样本中VOC的化学类别组成。向上箭头表示化合物类别的相对丰度与植物疾病指数之间的正相关，向下箭头表示负相关。c显示基于STAMP分析的13种关键土壤VOC的富集（P<0.05）。d显示13种关键土壤VOC的峰面积与植物疾病指数之间的Spearman相关性。TMCHD的全称为2,6,6-Trimethyl-2-cyclohexene-1,4-dione。星号表示显著性水平：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。

随后，我们使用VIP值和DESeq2计算了两种土壤类型之间的差异VOCs。抑制性土壤在13种化合物中显著富集（Log2FC>1，P<0.05），包括2,6,6-Trimethyl-2-cyclohexene-1,4-dione（TMCHD）、umbellulon、萘、beta-phellandrene、pentyl-benzene、pentadecane、humulene、3-methyl-5-propyl-nonane、geosmin、2-undecanone、6-methyl-2-heptanone、2-methylisoborneol和2-decanone等（附加文件1：图S4）。使用STAMP分析，我们还发现了这两种土壤类型之间这些13种关键化合物的丰度存在显著差异（P<0.05；图2c）。随后，我们分析了这些VOCs与盆栽实验疾病指数之间的相关性，结果显示显著负相关（Spearman，R=-0.71，P=1.5e-08，图2d）。为了评估抑制性土壤来源VOC的生物活性，我们对鉴定出的所有化合物进行了筛选。其中11种可商业获得的化合物被选中，用于评估它们在控制条件下对R. solanacearum生长和Solanum lycopersicum防御相关表型的影响。不同VOCs对R. solanacearum的抑制效果差异很大。例如，6-methyl-2-heptanone、2-decanone、2-undecanone和humulene对R. solanacearum的生长有显著抑制作用，而其他化合物则表现出弱抑制或无抑制作用。在S. lycopersicum中，对这些VOC的响应因化合物而异。一些VOCs促进了植物生长，表现为生物量增加和根系延长，而其他化合物则没有效果或引起可见的应激相关表型（附加文件1：图S5）。

**土壤细菌组成和多样性**
我们分析了两种土壤类型之间细菌组成的PCoA差异，发现同一地区的样本聚集在一起，各组之间有明显的分离。在PCo1（84.6%）和PCo2（3.8%）轴上，细菌的分布显示出显著的地区差异（Permanova：R2=0.844，P=0.032；图3a）。就α多样性而言，两种土壤类型的细菌在Shannon指数和Chao1指数上没有显著差异（附加文件1：图S6和附加文件2：表S1）。扩增子测序分析显示，Acidobacteriota门是土壤样本中的主要细菌群，平均相对丰度为27.73%，其次是Proteobacteria和Chloroflexi。在门（phylum）水平上，抑制性土壤中酸杆菌门（Acidobacteriota）（33.87 ± 7.88%，P < 0.05）、珠菌门（Gemmmatimonadota）（8.28 ± 0.52%，P < 0.001）和疣微菌门（Verrucomicrobiota）（2.26 ± 0.12%，P < 0.01）的相对丰度显著高于促进性土壤。相反，厚壁菌门（Firmicutes）（13.45 ± 2.09%，P < 0.01）在抑制性土壤中的相对丰度显著低于促进性土壤（图3b，附加文件2：表S2）。图3。该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。

在促进性和抑制性土壤中细菌群落的组成及其与土壤挥发性有机化合物（VOCs）的相关性。a 在ASVs水平上对细菌群落进行主坐标分析（PCoA），并使用Permanova检验。b 在门水平上细菌的组成。c 文氏图显示了三种统计方法（DESeq2、STAMP和LEfSe）识别的富集细菌属之间的重叠。d 六种在抑制性土壤中富集的属的相对丰度（双侧学生t检验；n = 4）。e 土壤细菌属的相对丰度与植物病害指数之间的Spearman相关性热图。f 13种关键土壤VOCs的峰值面积与六种土壤细菌属的相对丰度之间的相关性热图。星号表示显著性水平：*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001。TMCHD是2,6,6-三甲基-2-环己烯-1,4-二酮。

通过比较抑制性和促进性土壤中的微生物群落，发现在细菌属水平上存在显著差异。基于STAMP，我们确定了11种在抑制性土壤中显著富集的细菌属（附加文件1：图S7a）。使用DESeq2，共识别出237种差异富集的属（|Log2FC| > 2且Padj < 0.05）。与促进性土壤相比，抑制性土壤中有97种属显著上调，140种属显著下调（附加文件1：图S7b）。此外，我们使用LEfSe计算了两种土壤类型中关键属的重要性，并选择了前20种关键属，其中10种在抑制性土壤中富集（附加文件1：图S7c）。使用STAMP（11种属）、Deseq2（97种属）和LDA（LEfSe，10种属），我们确定了在抑制性土壤中富集的微生物属，并在文氏图中进行了可视化。然后我们重点关注了六种关键的抑制性微生物属（图3c），包括RB41、Luteitalea、MND1、链霉菌（Streptomyces）、溶菌菌（Lysobacter）和长微生物（Longimicrobium）（图3d）。这六种关键属与病害指数之间的相关性分析显示所有六种属都有显著的负相关性，其中链霉菌（Streptomyces）表现出最强的负相关性（图3e）。此外，这些关键微生物属的相对丰度与13种关键VOCs相关，表明链霉菌（Streptomyces）可能是胡芦烯（humulene）的主要来源（图3f）。

作为本研究中因VOCs介导而对土壤病害抑制性有贡献的关键属，我们从抑制性土壤中分离并鉴定了10株链霉菌（Streptomyces）菌株（图4a）。系统发育分析显示，大多数分离的菌株与通过扩增子测序鉴定的链霉菌分类群紧密相关（图4b，附加文件2：表S3）。这些菌株释放的VOCs对 tomato bacterial wilt （R. solanacearum）的抑制作用在体外进行了测试。在10个菌株中，有7个菌株显示出通过VOCs介导的R. solanacearum生长抑制作用。Stre2菌株的效果最强，其抑制R. solanacearum生长的程度高达46.2%，与对照组相比（图4d）。进行了比较分析，以确定抑制性土壤VOCs、链霉菌衍生的VOCs和生物测定定义的关键抑制性VOCs之间的共同VOCs。大多数化合物是链霉菌特有的（313种，73.6%）或抑制性土壤特有的（72种，16.9%），而35种VOCs（8.3%）在土壤和链霉菌之间存在共性，表明部分土壤挥发成分可能来源于链霉菌的代谢（图4c，附加文件2：表S4和表S5）。重要的是，有8种VOCs在所有三组中都被检测到，这表明它们是潜在的核心抑制性化合物。为了进一步验证它们在土壤抑制性中的作用，将链霉菌菌株引入了天然土壤和经过伽马射线照射的江苏土壤中。在灭菌土壤中，VOCs介导的病害抑制作用显著减弱，而添加链霉菌部分恢复了这种抑制能力（图4e）。这些结果表明链霉菌菌株在抑制抑制性土壤中的病害方面起着重要作用。

图4。该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。

链霉菌菌株的分离、其挥发性有机化合物（VOCs）的鉴定以及对R. solanacearum和番茄细菌性枯萎病的抗菌活性的验证。a、b 10株链霉菌菌株的平板形态特征以及基于16S rRNA测序的10株链霉菌菌株的系统发育树。c 从三种来源鉴定出的VOC谱型的比较：土壤VOCs、分离的链霉菌菌株释放的VOCs和关键抑制性VOCs。文氏图显示了这些VOC组之间的重叠。d 10株链霉菌菌株释放的VOCs对R. solanacearum生物量的影响（单因素方差分析，采用Tukey’s HSD检验校正；n = 3）。e 来自天然抑制性土壤（Nat_Soil）、灭菌抑制性土壤（Ster_Soil）以及添加了由所有10株分离的链霉菌组成的合成群落（SynCom）的灭菌抑制性土壤（Ster_Stre）对番茄细菌性枯萎病的影响（单因素方差分析，采用Tukey’s HSD检验校正；n = 4）。星号表示显著性水平：*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001。

微生物群落对土壤VOC组成的影响比土壤物理化学性质更为显著。抑制性土壤与促进性土壤在物理化学性质上表现出显著差异（表1）。总体而言，抑制性土壤的pH值、矿物质养分（NO3?N、AvCa、AvP和AvFe）以及与有机物相关的参数（DOC、DON、TC和TN）显著更高（所有P < 0.01）。值得注意的是，抑制性土壤中的NO3?N和DON浓度高出五倍以上，总碳和氮含量也显著增加。这些发现表明，抑制性土壤提供了更丰富的营养和更有利于化学的环境，这可能支持与病害抑制相关的有益微生物群落。土壤物理化学性质的主坐标分析（PCoA）显示，在前两个主要坐标上抑制性土壤和促进性土壤之间有明显的分离（附加文件1：图S8a）。PC1单独解释了总方差的96.0%，两种土壤类型之间的整体分离在统计学上显著（Permanova：R2 = 0.955，P = 0.037）。这些结果表明，抑制性土壤在物理化学性质上与促进性土壤有显著差异，反映了它们环境背景的实质性区别。

表1 两种土壤类型的土壤物理化学性质。全尺寸表格。

为了进一步探索与VOC变化相关的环境和微生物因素，我们进行了关键抑制性VOCs、细菌属和土壤物理化学性质之间的相关性分析（图5）。大多数抑制性VOCs，包括胡芦烯（humulene）、土臭素（geosmin）、2-甲基异松油醇（2-MIB）和萘（naphthalene），以及核心细菌属链霉菌（Streptomyces）、溶菌菌（Lysobacter）和长微生物（Longimicrobium），与土壤物理化学参数（如pH值、AvCa、AvFe和AvP）显示出显著的正相关。相反，病害指数（DI）与这些性质呈负相关。这些结果表明，营养丰富、均衡的土壤倾向于促进有益微生物的生长和抑制性VOCs的积累，从而降低病害发生率。

图5。该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。

土壤性质、抑制性细菌属和挥发性有机化合物（VOCs）之间的关系。Spearman相关性热图显示了土壤物理化学性质、关键抑制性VOCs、六种核心细菌属和病害指数（DI）之间的关联。红色和蓝色分别表示正相关和负相关。星号表示显著性水平：*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001。

变异分解分析（VPA）进一步量化了土壤物理化学因素和微生物因素对VOC变化的相对贡献（附加文件1：图S8b）。总体而言，土壤性质和细菌群落解释了VOC组成总变化的70.2%（调整后的R2），其中59.1%为共享变化，11.1%独属于细菌群落，仅0.046%由土壤性质解释，而29.8%仍未得到解释。一致地，Procrustes分析表明VOC组成与土壤物理化学性质（M2 = 0.252，P = 0.024，附加文件1：图S8c）和细菌群落组成（M2 = 0.211，附加文件1：图S8d）之间有显著的一致性。与细菌群落更强的一致性证明，微生物群落的结构比非生物土壤因素更直接地决定了土壤VOC的模式。

讨论

R. solanacearum是一种具有重要经济意义的土传细菌性枯萎病病原体，被认为是十大最具危害性的病原体之一（Mansfield等人，2012年）。我们从两个番茄细菌性枯萎病发生率不同的典型地区选取了土壤，并观察到了病害发生率和R. solanacearum种群数量的差异。随后，我们测量了这些土壤释放的VOCs的病害抑制能力。我们发现，来自抑制性土壤的VOCs显著降低了番茄细菌性枯萎病的病害指数并抑制了R. solanacearum的生长。我们的分析显示，番茄细菌性枯萎病的土壤病害指数与R. solanacearum的数量呈负相关，而VOCs的病害抑制能力也与此相关。具体来说，病害发生率较低且R. solanacearum数量较少的土壤释放的VOCs具有更强的病害抑制作用。这些发现突显了VOCs介导机制在土壤抑制性中的潜在作用。

VOC谱型分析显示两种土壤类型之间的VOC组成存在显著差异。通过进行VOC丰度与病害指数之间的Spearman相关性分析，我们确定了13种潜在的抑制性VOCs。这些抑制性VOCs，包括萘（Raza等人，2016年）、2-癸酮（Wang等人，2025年）、2-十一酮、十五烷（pentadecane）和胡芦烯（Xing等人，2018年）等，已被报道为微生物释放的抗菌物质。尽管大多数研究关注的是它们对R. solanacearum以外的微生物的抑制作用。在这项研究中，大多数潜在的抑制性VOCs抑制了R. solanacearum的生长并促进了植物生长，还诱导了过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性，表明它们在诱导植物系统抗性中的作用。虽然CAT和SOD活性被广泛接受为植物防御激活的指标，但需要在植物转录组学或代谢组学层面进行进一步研究，以阐明这些VOCs激活植物防御并减少病害严重程度的机制（Raza等人，2016年）。

在先前的研究中，我们发现有益细菌释放的VOCs有效抑制了R. solanacearum的生长和毒力特征（Raza等人，2016年）。在这项研究中，我们揭示了土壤VOCs的病害抑制作用的微生物基础，表明它们的主要作用是由土壤微生物群落介导的，而不是由土壤物理化学性质决定的。Ossowick等人（2020年）通过土壤微生物群移植实验表明，土壤VOCs对Fusarium culmorum的抑制作用与土壤物理和化学参数无关，而是与土壤微生物组有关（Ossowicki等人，2020年）。为了进一步研究这一点，我们使用扩增子测序评估了土壤中的细菌群落组成和多样性，确认了两种土壤类型之间的显著差异。确定的抑制性细菌属包括RB41、Luteitalea、MND1、链霉菌（Streptomyces）和长微生物（Longimicrobium）（Gao等人，2025年）。其中，链霉菌是一种重要的有益土壤微生物，可以产生各种代谢物来抑制病原体并增强植物抗性（Olanrewaju和Babalola，2019年）。它们释放的萜类化合物，如土臭素（geosmin）和2-甲基异松油醇（2-methylisoborneol），是吸引土壤昆虫的重要VOCs（Becher等人，2020年）。此外，先前的研究表明，Streptomyces setonii WY228通过VOCs调节植物生长并增强盐胁迫耐受性（Qin等人，2024年）。

微生物释放VOCs是一个受生物和非生物因素影响的复杂过程。先前的研究表明，在抑制性土壤中，放线菌（Actinobacteria）是抑制真菌根病原体R. solani的最活跃群体，已有300株链霉菌被分离并分析了它们的VOC组成和功能（Cordovez等人，2015年）。与这些发现一致，链霉菌在我们的研究中成为土壤VOC组成的主要贡献者，将链霉菌接种到灭菌土壤中部分恢复了土壤VOCs的病害抑制能力，突显了它们作为功能相关挥发物的微生物来源的重要性。值得注意的是，虽然大多数分离的链霉菌菌株通过VOCs介导的抑制作用抑制了R. solanacearum的生长，但其中一部分菌株（Stre4、Stre6和Stre8）在体外诱导了病原体的生长。此外，根据16S rRNA序列，菌株Stre4与其他五种抑制R. solanacearum生长的链霉菌菌株属于同一支系，而另外两种链霉菌菌株（Stre6和Stre8）则形成独立分支。尽管我们之前的研究表明，在芽孢杆菌中，生物合成基因簇与系统发育亲缘关系之间存在正相关，但当前的研究结果表明，仅基于16S rRNA基因序列的系统发育距离不足以预测链霉菌中的挥发性有机化合物（VOCs）介导的功能（Xia等，2022年）。重要的是，将所有分离出的10种链霉菌菌株共同接种到无菌土壤中后，土壤的抑病能力得到了恢复，这表明土壤层面的疾病结果更可能是由多种微生物菌株的联合效应和复杂的VOC混合物共同驱动的，而不是由单独菌株的活性决定的。从应用的角度来看，这些抑病VOCs的环境友好性和潜在生态风险需要仔细考虑。在本研究中，所鉴定的VOCs是由土壤微生物自然产生的，并在土壤微环境中以低浓度存在（Schulz-Bohm等，2017年；Garbeva和Weisskopf，2020年）。它们的高挥发性和短暂性质表明，与传统的化学杀虫剂相比，其在环境中的持久性有限（Garbeva和Weisskopf，2020年；Weisskopf等，2021年）。然而，在考虑将这些VOCs用于田间条件下的疾病管理之前，对生态安全性进行全面评估是必要的，包括非靶标效应、对土壤动物群和有益微生物的影响以及环境归趋性（Weisskopf等，2021年）。因此，生态风险评估是未来研究的一个重要方向。我们提出，土壤VOCs的抑病潜力可能归因于由抑病微生物（如链霉菌）释放的化合物，如萘、2-十一酮和葎烯。这些VOCs可以抑制茄科病害细菌（R. solanacearum）的生长，促进植物生长，并增强防御酶的合成，从而减少疾病的发生。这为进一步探索抑病土壤的特性提供了理论基础。

**结论**
本研究揭示了土壤VOCs在抑制番茄细菌性枯萎病中的关键作用，以及背后的微生物驱动机制和微生物群落分析。研究结果表明，土壤VOCs的抑病功能主要归因于关键的拮抗性微生物群落。鉴定了13种关键的拮抗性VOCs，它们可以直接抑制枯萎病原菌的增殖并促进植物生长，同时间接调节与防御相关的酶的合成。富含营养、pH值较高、AvCa、AvFe和AvP含量较高的土壤进一步促进了抑病微生物的生长和VOCs的产生。这些发现强调了在适宜土壤条件下形成的由微生物群落驱动的VOCs对疾病抑制的重要性，并为开发可持续的土壤健康策略以控制病原体提供了基础。这项研究为微生物VOCs在农业中的应用提供了理论依据，并为开发绿色控制方法（如生物农药或土壤改良剂）提供了潜在途径。

**方法**
**土壤采集和R. solanacearum定量**
为了评估土壤VOCs对R. solanacearum引起的番茄细菌性枯萎病的影响，从中国广西（南宁，红壤）、江苏（南京，黄棕壤）、江西（南昌，潜育水稻土）和山东（滕州，砂壤土）的长期番茄连作区域采集了土壤样本。这些土壤样本于2020年采集，并随后转移到南京农业大学的白马实验基地。所有土壤样本在受控的温室系统中保存了两年，期间持续种植同一种番茄品种（Micro-Tom），并实行统一的水肥管理，以最小化区域干扰效应。该期间的疾病发生率和R. solanacearum丰度数据见附件1：图S1。2022年8月至9月期间，使用五点采样方法采集了土壤样本。大约收集了30厘米的表层土壤，通过2毫米筛子过滤后混合成单一样本。每个区域取四个重复样本，然后分成四个子样本并置于无菌塑料袋中。第一个子样本用于定量R. solanacearum。土壤样本依次稀释后接种在改良的选择性培养基（SMSA）上，在30°C下孵育48小时以计数菌落（Pradhanang等，2000年）。第二个子样本用40%甘油（1:1，v/v）在-80°C下保存，用于微生物扩增子测序和关键微生物的分离。第三个子样本用于VOC分析及其对植物疾病和R. solanacearum生长的影响。使用前将其在4°C下保存，然后在室温（28°C）下活化24小时。第四个子样本用于测量土壤的物理化学性质。所有土壤样本在运输过程中保持在冰上，并在到达实验室后保存在4°C（Raza等，2017年）。

**番茄生长条件和病原菌接种**
表面消毒的番茄种子（Solanum lycopersicum，品种“Micro-Tom”）在水琼脂板上发芽3天。随后将幼苗移植到装满伽马射线照射培养基（每孔50克，购自江苏兴农育苗技术有限公司）的72孔培养盘中。当植物长到三叶一心期时，将其移植到装有伽马射线照射培养基的盆中（每盆100克），并放置在一个塑料罐上方（图1a）。首先用消毒水清洁盆和塑料罐，然后用70%乙醇清洗以去除附着的物质，之后晾干。塑料罐中加入70克土壤以测试释放的VOCs的效果，并在盆和罐的连接处用双层聚四氟乙烯薄膜密封，然后放入温室中。接受来自下方土壤VOCs的植物盆在五天内被接种了R. solanacearum菌株QL-RS1115（GenBank: GU390462），最终浓度为每克土壤10^6 CFU（Wei等，2011年）。所有温室实验都在受控的光照条件下进行，光照周期为12小时/天，相对湿度为60%。每隔一天用无菌水浇水，以保持足够的水分但不使水滴入下方的塑料罐中。从番茄植株出现症状开始，每两天记录一次疾病严重程度，直到不再观察到新的症状。每个区域的土壤样本包含6株番茄幼苗，每个重复三次，未处理的伽马射线照射土壤用作对照。

**土壤VOCs对R. solanacearum生长的影响（体外实验）**
使用分区的培养皿评估了VOCs对R. solanacearum的抑制作用，略微修改了之前的方法（Raza等，2020年）。简而言之，将单个R. solanacearum QL-RS1115菌落培养在CPG培养基（1克半胱氨酸，BD Bacto，Becton, Dickinson and Company，美国）中，温度为30°C，时间为24小时。细菌悬浮液用0.85% NaCl溶液冲洗两次，并调整至1×10^7 CFU/mL。分区的培养皿（直径85毫米）一侧填充15毫升CPG琼脂培养基，将5微升细菌悬浮液点在两个相距5厘米的位置。另一侧填充来自不同地区的10克土壤（干重）。培养皿用聚四氟乙烯薄膜密封，在30°C下孵育（图1d）。对照组包括不含土壤的培养皿。24小时后，移除含有细菌的琼脂，用1毫升无菌水冲洗，然后测量OD600值以确定细菌生长情况。同时，使用DMSO作为溶剂，加入浓度为10微摩尔的商业VOC化合物，并使用1毫米无菌滤纸片作为载体。培养皿密封后孵育。

**土壤物理化学性质测量**
本研究测量了十一个土壤物理化学性质。田间持水量（FC）采用重量法测定。简要来说，空气干燥的土壤在实验室条件下用去离子水饱和，自由排水分24小时。然后在105°C下烘烤至恒重，FC表示为相对于干土壤重量保留的水分百分比（Minasny和McBratney，2018年）。对于土壤pH值，将土壤与去离子水以1:2.5（w/v）的比例混合制成浆液，使用pH计（Orion Star A211，Thermo Fisher Scientific，美国）进行测量（Xu等，2003年）。溶解有机碳（DOC）和溶解有机氮（DON）通过1:10的土壤-水比例提取，随后振荡和离心。提取物通过0.45微米膜过滤，使用总有机碳分析仪（Elementar，德国）测量DOC和DON。总碳（TC）和总氮（TN）使用Vario MACRO cube元素分析仪（VarioMAX，Elementar，德国）和空气干燥的筛分土壤样本进行分析（Filep和Rekasi，2011年）。硝酸盐氮（NO3-N）和铵氮（NH4+N）通过将新鲜土壤与1 M KCl以1:5（土壤-溶剂质量比）混合，随后在25°C下振荡30分钟提取。硝酸盐氮的浓度使用连续流分析仪测定（Carlson，Seal AutoAnalyzer AA3，Norderstedt，德国）（Carlson等，1990年）。有效磷（AvP）通过将空气干燥的土壤与0.5 M NaHCO3以1:20（土壤-溶剂比）混合提取。微量元素通过将空气干燥的土壤与0.05 M二乙基三胺五乙酸（DTPA）以1:5（土壤-溶剂比）混合提取（Cancela等，2002年）。有效钙（AvCa）和微量元素的使用电感耦合等离子体光学发射光谱仪（Agilent 710 ICP-OES，Agilent Technologies，美国）测定。所有测试均重复三次，并使用标准物质进行校准以确保数据准确性。

**土壤和微生物VOCs的鉴定**
VOC谱型的鉴定遵循了之前的方法，并进行了轻微修改（Raza等，2017年，2020年）。对于土壤中VOCs的顶空提取，称取10克土壤放入60毫升棕色玻璃小瓶中，然后用Teflon?背衬的硅胶塞子密封。不含有土壤的小瓶用作对照。所有样本在室温下保存12小时以激活土壤微生物。随后向小瓶中加入10微升5毫米醋酸壬酯作为内标。然后将预处理的（250°C加热5分钟）固相微萃取（SPME）纤维（Supelco，Bellefonte，PA，50/30微米DVB/CAR on PDMS）插入小瓶，在30°C下孵育30分钟，然后在50°C下再孵育30分钟。SPME纤维随后插入气相色谱-质谱（GC–MS）系统的进样口（Finnigan Trace DSQ，Austin，美国），并在220°C下解吸1分钟。分析使用RTX-5MS柱（30米，0.25毫米内径，0.25微米膜厚度）。使用的烤箱温度程序为：33°C（保持3分钟），180°C（10°C/分钟），240°C（30°C/分钟），然后在240°C下保持5分钟。质谱仪在70电子伏特和220°C下操作，扫描范围为50–500 m/z。色谱图使用AMDIS 2.73软件（National Institute of Standards and Technology，Gaithersburg，美国）获取和分析。去卷积的VOC峰谱与NIST/EPA/NIH质量光谱库中的主要和/或次要库进行比较（Agilent Technologies，Santa Clara，CA，美国）。化合物的Kovats保留指数使用烷烃校正混合物计算，并与NIST/EPA/NIH质量光谱库中的数据比较。如果化合物的质量谱与列表中的化合物匹配，匹配因子高于800，并且计算出的保留指数与非极性半标准柱的列表值相差不超过五个单位，则认为该化合物被鉴定。

土壤样本的VOC谱型 also 使用液体提取方法确定。用于顶空提取的土壤样本中加入了内标1,4-二氟苯（20微克/毫升甲醇），浓度为每千克土壤50微克。随后，通过振荡彻底混合土壤，然后置于室温下过夜以达到平衡。然后向含有土壤样本的瓶子中加入30毫升甲醇，用未使用的Teflon?背衬硅胶盖密封。将瓶子倒置并标记液位以检测任何泄漏。将瓶子置于75°C下轻轻振荡（60转/分钟）以保持土壤悬浮状态。为避免破损，将瓶子放在另一个容器中。24小时后检查液位，丢弃任何体积减少的瓶子。随后将土壤悬浮液离心（1500转/分钟），将10毫升上清液转移到50毫升烧瓶中。向溶剂提取液中加入30毫升蒸馏水，然后加入10毫升己烷。剧烈振荡烧瓶1分钟，然后静置5分钟以分离相。上层己烷层的体积几乎与所加入的己烷体积相同。收集己烷层，通过Millipore膜过滤器（0.45 μm）过滤后，使用GC–MS进行分析，样品量为2 μL。GC–MS分析和VOC鉴定的其余步骤与上述相同。为了确定提取效率，将标准化合物单独在己烷中处理（浓度为10–100 μg/mL）。如果SPME和液体提取方法都检测到某种VOC，则将这两种方法的校正后峰值面积相加。VOC的峰值面积表示为每克土壤（干重）的相对VOC丰度（以任意单位a.u.表示）。标准化合物1,4-二氟苯在液体提取方法中的回收率为77%。为了分析链霉菌产生的VOC谱，按照上述方法制备了细胞悬浮液（浓度为1×10^8 CFU/mL），并将5 μL悬浮液接种到含有20 mL International Streptomyces Project medium 3 (ISP3)的50 mL锥形瓶中，然后在30°C下孵育72小时。每个处理重复三次，不接种细菌的瓶子作为对照。孵育后，加入10 μL 5 mM乙酸壬酯作为内标物。接着使用SPME和GC–MS鉴定VOC成分，步骤与土壤样品分析相同。与未接种细菌的对照处理相比，不考虑相似的色谱峰。记录每种处理产生的VOC数量，并将色谱峰面积表示为相对于内标的相对峰面积（以任意单位a.u.表示），以此间接估计每种VOC的相对量（Raza等人，2020，2024）。

**土壤VOC对R. solanacearum生长及植物生长和防御酶活性的影响**
根据相关性分析结果，选择与疾病指数显著相关的VOC并进行购买（附加文件2：表S4）。按照上述方法测试土壤释放的VOC对R. solanacearum生长的影响，不同之处在于将培养皿的一侧替换为纯VOC化合物。使用DMSO作为溶剂，将10 μL浓度为5 μM的VOC施加到1毫米的无菌滤纸上作为液滴载体。培养皿用Parafilm密封后放入培养箱中孵育，其中仅含DMSO和水的培养皿作为对照。孵育24小时后，使用打孔器取出含有R. solanacearum的琼脂，清洗后用1 mL无菌水悬浮，测量R. solanacearum的OD600值。每种VOC重复测量六次。

**纯VOC化合物对Solanum lycopersicum生长及氧化防御酶活性的影响**
为了研究这一现象，采用了分培养皿实验，将植物放在一个隔间，细菌放在另一个隔间。实验中，S. lycopersicum种子先在70%（v/v）乙醇中表面消毒1分钟，然后在5%（v/v）NaOCl中消毒5分钟。随后用无菌水清洗三次，放在含有0.8% Murashige and Skoog (MS)琼脂的培养皿中。种子在4°C预冷3天，随后置于21°C、光照时间为16小时/黑暗时间为8小时的生长箱中。发芽后，在每个隔间中放置三颗大小均匀的种子，每个隔间含有15 mL含有0.5%蔗糖和0.8%琼脂的MS培养基。培养皿用Parafilm密封后放回生长箱。第三片真叶出现后，在分培养皿的另一个隔间中的1毫米无菌滤纸上加入10 μL浓度为5 μM的VOC。培养皿重新密封后放回生长箱。孵育15天后，将S. lycopersicum植株从琼脂中取出，用清水冲洗以去除根部残留的琼脂，拍干去除多余水分，并记录植株的新鲜重量。使用商业试剂盒（Solarbio，北京，中国）测量SOD、PAL和CAT的活性。每种化合物重复测量六次，以DMSO作为对照。

**土壤DNA扩增子测序及生物信息学分析**
根据制造商的说明书，使用PowerSoil DNA Isolation Kit（Mo Bio Laboratories，美国）提取土壤DNA。使用NanoDrop 1000分光光度计（Thermo Scientific，美国）评估DNA浓度和质量，并通过电泳检测DNA降解情况。利用16S rRNA标记物进行扩增子测序，以确定细菌群的组成和多样性。使用引物515F（5’-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）扩增细菌16S rRNA基因的V4区域（Cardenas等人，2010）。扩增子文库在Illumina MiSeq平台（Shanghai BIOZERON Co., Ltd.）上采用双端（2×250）模式进行测序，遵循标准协议（Gu等人，2020）。序列读段使用QIIME 2中的DADA2算法（Quast等人，2013）进行处理和去重。对配对读段进行修剪和过滤，每个读段的最大允许误差为2（maxEE=2）。合并配对读段并进行嵌合体过滤后，使用UCLUST算法（http://www.drive5.com/usearch/manual/uclust_algo.html）将16S rRNA基因扩增子序列变异体（ASVs）与Silva（SSU138.1）16S rRNA数据库及其他数据库进行系统发育分类，置信度阈值设定为80%（Caporaso等人，2010）。仅保留总丰度大于5的序列用于进一步分析。

**链霉菌的分离及其释放的VOC的功能验证**
使用改进的Gauze合成培养基从抑菌性江苏土壤中分离出10株链霉菌（Wang等人，2024）。使用引物27F和1492R扩增这些链霉菌的16S rRNA基因并进行测序（Heuer等人，1997）。为了验证链霉菌释放的VOC对R. solanacearum生长的抑制作用，采用上述双段平板法。在平板的一侧加入3滴（每滴5 μL）R. solanacearum，在另一侧接种10 μL链霉菌悬浮液（浓度为1×10^8 CFU/mL）。平板用Parafilm密封后在28°C下孵育2天。之后，使用打孔器取出含有R. solanacearum的琼脂，清洗后用1 mL无菌水悬浮，测量OD600值。蒸馏水处理作为空白对照，每种处理重复三次。

**此外，还进行了盆栽实验来验证链霉菌在土壤中释放抑菌VOC的能力（图1a）**。将伽马辐照的抑菌土壤接种含有所有十株链霉菌的合成菌群（SynCom），菌群浓度为1×10^7 CFU/g土壤。评估链霉菌处理土壤释放的VOC对R. solanacearum诱导的疾病发生率的影响，以灭菌土壤和自然土壤作为对照。每个处理包括六株番茄幼苗，每个处理重复三次。

**统计分析**
所有数据分析均使用R版本4.3.1进行。“ONE Tukey HSD2”函数用于比较处理间的差异。使用ASVs评估微生物群落多样性。使用“microceo”v1.9.0 R包通过主成分分析（PCoA）评估群落组成的变化。使用vegan v2.6.4和DESeq2 v1.40.2包中的函数评估处理间的群落结构显著差异。使用ComplexHeatmap v1.10.2包生成与疾病指数相关的关键微生物或VOC的热图。使用rdacca.hp v1.1包进行RDA和VPA中重要因素的分析层次结构构建。