2024-2025年间，在埃及未接种疫苗的肉鸡种鸡群中检测到禽类偏肺病毒A亚型和B亚型的血清学和分子学证据

《BMC Veterinary Research》：Serologic and molecular evidence of avian metapneumovirus subtypes A and B in unvaccinated broiler breeder flocks in Egypt (2024–2025)

　　摘要
背景
禽类偏肺病毒（aMPV）是一种对家禽具有重大经济影响的呼吸道病原体，会影响其生产性能、产蛋量和种禽群的繁殖能力。尽管该病毒具有显著影响，但在埃及，对其了解仍然有限，目前尚未在种禽群中进行过系统的监测研究。因此，本研究旨在首次对埃及肉鸡种禽群中aMPV的流行情况进行全面的分子和血清学评估。

方法
2024年至2025年间，从埃及十二个省的60个未接种疫苗的肉鸡种禽群中收集了共6,000份血清样本和800份气管拭子样本。血清样本在雏鸡16周（饲养期）和35周（生产期）时采集，并通过ELISA检测aMPV的A型和B型亚型。生产期采集的气管拭子被合并成80份复合样本，使用逆转录定量实时PCR（RT-qPCR）技术检测病毒RNA。

结果
血清学分析显示aMPV的暴露范围广泛，各省份的血清阳性率介于64.4%（卢克索）到89%（吉萨）之间。随着年龄的增长（16周至35周），抗体滴度有所上升，反映了累积的病毒暴露情况。分子检测显示，在67份（83.75%）复合拭子样本中检测到了aMPV RNA。其中，B型亚型为主要检测到的基因型，单独出现在65份样本中（81.25%），与A型亚型共同出现在2份样本中（2.5%）。血清学和分子检测结果基本一致，即aMPV RNA阳性的禽群通常表现出更高的抗体滴度。

结论
这些结果表明，aMPV（尤其是B型亚型）可能在整个埃及肉鸡种禽群中普遍存在。本研究揭示了知识上的空白，并强调了病毒分离、测序以及生物安全性和疫苗接种策略控制评估的必要性。

背景
禽类偏肺病毒（aMPV）是一种对家禽具有重大经济影响的呼吸道病原体，会影响其生产性能、产蛋量和种禽群的繁殖能力。尽管该病毒具有显著影响，但在埃及，对其了解仍然有限，目前尚未在种禽群中进行过系统的监测研究。因此，本研究旨在首次对埃及肉鸡种禽群中aMPV的流行情况进行全面的分子和血清学评估。

方法
2024年至2025年间，从埃及十二个省的60个未接种疫苗的肉鸡种禽群中收集了共6,000份血清样本和800份气管拭子样本。血清样本在雏鸡16周（饲养期）和35周（生产期）时采集，并通过ELISA检测aMPV的A型 and B型亚型。生产期采集的气管拭子被合并成80份复合样本，使用逆转录定量实时PCR（RT-qPCR）技术检测病毒RNA。

结果
血清学分析显示aMPV的暴露范围广泛，各省份的血清阳性率介于64.4%（卢克索）到89%（吉萨）之间。随着年龄的增长（16周至35周），抗体滴度有所上升，反映了累积的病毒暴露情况。分子检测显示，在67份（83.75%）复合拭子样本中检测到了aMPV RNA。其中，B型亚型为主要检测到的基因型，单独出现在65份样本中（81.25%），与A型亚型共同出现在2份样本中（2.5%）。血清学和分子检测结果基本一致，即aMPV RNA阳性的禽群通常表现出更高的抗体滴度。

结论
这些结果表明，aMPV（尤其是B型亚型）可能在整个埃及肉鸡种禽群中普遍存在。本研究揭示了知识上的空白，并强调了病毒分离、测序以及生物安全性和疫苗接种策略控制评估的必要性。

背景
禽类偏肺病毒（aMPV），曾被称为禽类肺炎病毒或火鸡鼻气管炎病毒，是家禽的一种主要呼吸道病原体。该病毒可引发上呼吸道疾病，表现为鼻窦炎、面部肿胀、头部肿大综合征（SHS）、产蛋量下降和死亡率增加，导致严重的经济损失[1, 2]。由于其能够感染多种家禽物种（包括火鸡、鸡、珍珠鸡、鸭和pheasants），显示出广泛的宿主范围和重要的流行病学意义[3, 4]。自1978年在南非火鸡中发现该病毒[5, 6, 7]以及随后在英格兰的鸡只中引发SHS[8]以来，aMPV已广泛传播至欧洲[9]、亚洲[10, 11, 12, 13]、非洲[14, 15, 16, 17]、美洲[18, 19, 20, 21, 22]和中东地区[23, 24, 25, 26, 27, 28, 29]。作为偏肺病毒属（Metapneumovirus）的典型成员，aMPV是一种具有螺旋状衣壳和负链单链RNA基因组的包膜病毒，基因组长度约为13.3–14 kb。病毒基因组中包含多个开放阅读框，编码八种蛋白质：核蛋白（N）、磷酸蛋白（P）、基质蛋白（M和M2）、融合蛋白（F）、小疏水蛋白（SH）、附着糖蛋白（G）和大聚合酶（L）。N蛋白具有高度保守性，常用于血清学诊断；而G蛋白则具有高度变异性，是分子分型的关键决定因素[30]。目前已确认四种主要的aMPV亚型（A、B、C和D）。这些亚型在地理分布和基因上存在差异：A型和B型主要分布在欧洲、非洲和亚洲大部分地区，C型主要出现在北美和亚洲部分地区，D型仅在法国被发现。尽管同一亚型内部具有高度保守性（例如，B型亚型分离株的核苷酸同源性约为97.7–99.98%），但亚型间的变异仍然显著。结构基因的比较分析显示A型和B型之间具有中等程度的相似性（例如，P蛋白約72%和M2-1蛋白約89%的氨基酸同源性），而C型则差异较大，其M基因与A型或B型分离株的核苷酸同源性仅约为70.6–71.7%[31, 32]。附着糖蛋白（G）基因高度变异，不同亚型间的同源性仅约为25–52%，反映出明显的抗原性和系统发育差异。尽管其他亚型的详细核苷酸比较文献较少[33, 34]，但D型亚型被认为是独特的。最近在北美野生鸟类中发现了新的类似aMPV的病毒，表明aMPV的遗传多样性仍在扩大[35, 36]。作为多因素呼吸道疾病复合体的一部分，aMPV会降低家禽群对大肠杆菌、鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum）和鼻气管鸟杆菌（Ornithobacterium rhinotracheale）的抵抗力，增加发病率并使诊断复杂化[37]。疾病严重程度因物种和年龄而异，火鸡和肉鸡通常表现出更严重的症状[38, 39]。虽然临床症状可能提示感染，但确诊需要实验室确认。由于病毒排毒期短且样本易降解，病毒分离较为困难；而分子检测技术能快速、灵敏地检测病毒。实验感染鸡只中，aMPV B型亚型的排毒通常在感染后3–7天内发生，峰值出现在第5天，因此限制了成功分离的机会[4]。实时逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）被认为是常规监测、早期检测和亚型鉴定的最有效方法之一[40, 41]。在禽类呼吸道病毒的分子监测项目中，合并样本策略被广泛采用，以优化实验室资源并保持广泛的禽群覆盖范围，特别是在大规模流行病学调查中[24]。尽管合并样本可能会因稀释效应降低低滴度样本的检测灵敏度，但仍是公认的监测方法。如有必要，可对阳性样本进行单独检测以确认禽群内的感染情况[42]。血清学检测适用于群体水平的监测，利用保守的N蛋白的ELISA试剂盒可可靠地检测自然暴露情况。尽管某些试剂盒针对A型和B型亚型进行了优化，但ELISA对于监测感染压力、评估禽群免疫状态和指导疫苗接种政策仍具有重要意义[43, 44, 45, 46]。

在埃及，尽管已广泛接种了针对禽流感、新城疫和传染性支气管炎的疫苗，呼吸道病毒感染仍对家禽生产构成挑战[47, 48, 49]。埃及的家禽产业采用垂直整合的生产体系，大型商业企业与中小型生产商网络相结合，共同满足全国大部分动物蛋白需求。其中肉鸡产业占比最大，2017年至2023年间，商业农场贡献了约90%的鸡肉总产量。大约有1000万只肉鸡种禽（亲本鸡）构成了这一生产体系的核心，主要分布在尼罗河三角洲和吉萨省[50]。然而，由于大多数研究要么零散进行，要么地域范围有限，目前对aMPV的流行病学了解仍然不足。A型和B型亚型已在火鸡、鸡和鸭中检测到，常与细菌感染同时存在[23, 51, 52, 53, 54]。尽管如此，关于商业种禽养殖场疫苗接种状况的全面记录仍然有限。

疫苗接种政策因生产系统而异，通常在兽医监督下实施，而非通过协调的国家框架。接种的疫苗通常是进口的减毒A型或B型活疫苗，有时在生产期会追加灭活加强针。除了进口商业产品外，还开发了基于埃及本地菌株的国产灭活疫苗，实验条件下显示具有保护效果[55]。埃及市场上销售的商业疫苗包括活B型疫苗（如Vaxxon SHS、NEMOVAC、AVIFFA RTI、RESPIVAC aMPV）、活A型疫苗（Poulvac TRT）和灭活B型疫苗（HIPRAVIAR TRT和TUR-3）。尽管这些疫苗可商业购买，但描述其实际应用范围、总体覆盖率和与当地流行病毒匹配情况的同行评审数据很少[1, 55, 56, 57]。疫苗实施的这种多样性以及缺乏系统的现场数据强调了在未接种疫苗的禽群中评估病毒流行情况的重要性，以便更好地了解埃及肉鸡种禽群中的自然感染动态。

本研究旨在评估埃及多个省份未接种疫苗的肉鸡种禽群中aMPV的暴露情况和分子流行率，并鉴定流行的aMPV亚型。这些信息有助于提供综合的流行病学数据，以支持针对性的生物安全性和疫苗接种策略。

材料与方法
研究设计和伦理声明
本研究是一项横断面研究，旨在调查2024–2025年间埃及未接种疫苗的商业肉鸡种禽群中aMPV感染的动态。研究结合了血清学和分子监测方法：(i) 确定aMPV特异性抗体的流行率和分布；(ii) 识别流行的亚型；(iii) 评估与年龄相关的血清转化和累积暴露情况。所有动物处理和样本采集程序均获得了开罗大学兽医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（批准编号：Vet CU-301220251281）。

研究区域和样本采集
在研究期间，采用了多阶段分层采样设计，涵盖十二个省份，并根据已建立的地理分布和生产密度模式将其分为三个主要家禽生产区：尼罗河三角洲区（贝赫拉、卡弗埃尔谢赫、加尔比亚、沙尔基亚、卡尤比亚和梅努菲亚）是北部主要的、人口密集的种禽生产带；中部埃及（吉萨、法尤姆和贝尼苏夫）是一个次级的高密度生产区；上部埃及（米尼耶、阿苏特和卢克索）的家禽养殖场分布较广但商业活动活跃。这种区域划分有助于进行有结构的区域比较，同时反映生态和生产差异。总共纳入了60个商业肉鸡种禽群（每个省份五个）。每个禽群在16周（饲养期）和35周（生产期）采集50份血清样本，以评估与年龄相关的血清学动态。所有纳入的禽群均确认未接种aMPV疫苗。通过查阅官方农场疫苗接种记录、咨询现场兽医和检查疫苗采购文件，确认所有禽群均未接种aMPV疫苗。虽然部分禽群在饲养期出现轻微呼吸道症状，部分禽群在生产期产蛋量有所下降，但采样包括临床受影响的和外观健康的禽只。这种方法旨在提供全面的禽群水平评估，而不仅仅是关注有症状的个体。关于禽群分布、样本数量和记录的临床观察的详细总结见补充表1（表S1）。

对于分子检测，在生产期（35周龄）采集了800份气管拭子样本（每个禽群10–20份）。其中，吉萨和法尤姆各采集100份拭子，贝尼苏夫、米尼耶、阿苏特和卢克索各采集30份拭子。使用无菌聚酯头拭子收集样本，立即将其放入3 mL的病毒运输介质（VTM）中，该介质由Anderson改良的Hanks平衡盐溶液（HBSS）制成，并添加了2%的热灭活胎牛血清（FBS）、100 μg/mL庆大霉素和0.5 μg/mL两性霉素B（Sigma-Aldrich）。样本在运输过程中保存在2–8°C的保温箱中。在到达开罗大学兽医学院病毒学实验室后，拭子悬浮液被涡旋混合，通过短暂离心澄清，然后分装并储存于-80°C，直到用于分子分析。

血清制备和血清学分析：从随机选择的鸟类翅膀静脉中无菌采集大约1.5毫升血液，并转移到无菌试管中。血液在室温下凝固后，以1000×g离心10分钟。所得血清被转移到标记的Eppendorf试管中，注明鸡群、省份、年龄和采集日期，并储存于-20°C，直至检测。出现溶血或污染的样本被排除在分析之外。血清样本使用商业间接ELISA试剂盒（IDVET? Laboratories，Grabels，法国）检测aMPV A和B亚型。样本按照1:500的比例稀释，并在与aMPV抗原预涂层的96孔微量滴定板上孵育。孵育和清洗后，加入抗鸡辣根过氧化物酶（HRP）结合物，接着加入TMB底物进行显色反应。每个ELISA板包含制造商提供的阴性对照（A1和B1）和阳性对照（C1和D1）的双重孔。根据试剂盒说明，未稀释地添加对照样本。使用阴性对照和阳性对照来确定背景光密度（ODNC），计算S/P比值，并验证板性能。光密度（OD）在450nm处使用Thermo Scientific? Multiskan FC?微孔光度计测量，如先前所述[28, 58]。样本与阳性值的S/P比值计算公式为：(样本OD – NC OD)/(PC OD – NC OD)。

抗体滴度计算公式为Log10(滴度) = 1.09 Log10(S/P) + 3.360。如果平均ODPC大于0.250且ODPC/ODNC比值大于3，则认为检测有效。尽管制造商建议的临界值为S/P > 0.2（滴度 > 396），但在研究群体中应用这一阈值导致了较高的血清阳性率。因此，最终的血清状态分类基于对ELISA吸光度值的分布分析得出的数据驱动临界值。

RNA提取和RT-qPCR分子检测：每个鸡群中每10个气管拭子合并为一个池，共计80个池。根据制造商说明，使用QIAamp Viral Mini Kit（Qiagen，Hilden，德国）从200 μL的合并气管拭子中提取病毒RNA。所有操作均在无RNase条件下进行，提取的RNA储存于-80°C以供后续处理。所有RNA样本使用常规RT-PCR检测方法筛查Mycoplasma gallisepticum、Mycoplasma synoviae、Ornithobacterium rhinotracheale（ORT）、Newcastle disease virus（NDV）、Infectious Bronchitis Virus（IBV）和禽流感病毒（H5和H9亚型）。

aMPV的分子检测使用Kylt? aMPV A&B实时RT-PCR试剂盒（AniCon Labor GmbH，Emstek，德国）和AB 7500快速实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific，Foster City，CA）进行。该检测同时针对A和B亚型的G基因，使用分别标记有FAM（aMPV-A）和Cy5（aMPV-B）的特异性引物和TaqMan探针。如先前报告的，使用β-actin特异性引物和HEX标记的探针作为内源性对照[59]。反应包括16 μL的混合液和4 μL的RNA模板，热程序如下：50°C反转录10分钟，95°C聚合酶激活1分钟，95°C变性42个循环各10秒，60°C退火/延伸1分钟，并在FAM、Cy5和HEX通道中进行荧光检测。阳性对照包括商业活疫苗aMPV亚型A（Poulvac? TRT，Zoetis，Parsippany，NJ）和亚型B（Nemovac?，Merial，Lyon，法国），而无RNase的水作为阴性对照。Ct值≥37被视为阴性，同一样本中FAM和Cy5之间的差异> 10个循环被视为可疑。

统计分析：为了确定最佳的ELISA血清阳性阈值，对吸光度值的分布应用了核密度估计（KDE）。评估了双峰性，并将密度峰之间的局部最小值确定为区分血清阴性和阳性群体的经验临界值。使用Wilcoxon等级和测试进行生产阶段间的血清学比较。随后使用Kruskal–Wallis测试进行省份和区域间的比较，然后进行成对事后分析和根据Bonferroni校正调整p值。所有统计分析和数据可视化在RStudio（版本2025.09.2）[60]中使用R编程语言（版本4.5.2）[61]进行。数据以算术平均值±标准差表示，统计显著性定义为p < 0.05。

**结果：**
**肉鸡繁殖鸡群中aMPV的血清监测：**
呼吸系统症状通常较轻且自限性，影响Delta鸡群中不到6%的鸟类，在中埃及和上埃及地区影响的比例低于3%。在采样期间未观察到死亡率或生产参数的显著异常。ELISA吸光度值的核密度分析显示双峰分布，表明存在两个不同的血清学群体。密度峰之间的局部最小值（吸光度=0.555）被确定为血清状态分类的最佳阈值，如图S1所示。采用这种分类方法，所有调查的省份均检测到高水平的aMPV暴露。总体而言，78.2%的血清样本对aMPV抗体呈阳性，表明在个体鸟类水平上存在广泛的血清学感染证据。在鸡群层面，所有采样的肉鸡繁殖鸡群均为血清阳性，证实所有研究的生产环境中都存在aMPV暴露。省份层面的血清阳性率从卢克索的64.4%到吉萨的89%不等。可见的地理差异见补充表S2。

**抗体滴度：**
从饲养阶段到生产阶段，抗体滴度显著增加（图1）。35周龄鸡群的抗体水平显著高于16周龄鸡群（Wilcoxon等级和测试，p < 0.001），这与生产周期中的血清转换一致。16周时，平均抗体滴度为2,363 ± 1,128（CV = 47.7%），而35周时平均滴度为4,426 ± 2,057（CV = 46.4%）。

**地区间差异：**
16周时，中埃及地区的抗体滴度高于Delta和上埃及地区（图2A）。这一地区模式在35周时发生了变化，Delta地区显示最高的抗体滴度，超过了中埃及和上埃及地区的水平（图2B）。空间图（图3A和B）显示生产阶段抗体滴度从北到南存在持续梯度，上埃及地区的鸡群始终表现出较低的抗体水平（图3）。

**地理分布：**
16周时，贝尼苏夫和吉萨省的抗体滴度最高，法尤姆、卡利乌比亚、加尔比亚、贝海拉和卡夫尔埃尔谢赫省的滴度中等，阿苏特、米尼亚和卢克索省的滴度最低（图4A）。到35周时，所有省份的抗体滴度均增加（图4B）。Delta省份（卡利乌比亚、加尔比亚、梅努菲亚、卡夫尔埃尔谢赫和贝海拉）形成了高滴度簇，而沙尔基亚和吉萨省则呈现中等反应。贝尼苏夫、法尤姆和上埃及省份的抗体水平较低，证实了整个生产周期中的地理异质性。完整的个别原始ELISA吸光度（OD）值和相应的S/P比值数据集见附加文件4。

**RT-qPCR的分子检测和亚型分型：**
在80个气管拭子池中，67个（83.75%）对aMPV RNA检测呈阳性。B亚型是主要基因型，仅在65个样本池中单独检测到（81.25%），而在来自贝海拉省的2个样本池中与A亚型共检测到（2.5%）。没有样本池仅对A亚型呈阳性（表1）。

**讨论：**
使用综合血清学和分子框架，本研究提供了对埃及未接种疫苗的肉鸡繁殖鸡群中aMPV传播的结构性评估。通过结合双年龄抗体分析和针对A和B亚型的G基因的亚型特异性RT-qPCR，我们评估了多个省份的累积暴露和同时病毒检测，将免疫证据与活跃感染联系起来。所有检查鸡群中观察到的统一高血清阳性率（78.2%）表明繁殖群体中广泛存在暴露。鉴于所有鸡群均确认未接种疫苗，检测到的抗体最符合自然感染。类似水平的血清阳性率已在孟加拉国（总体上53.3%；肉鸡繁殖鸡群中超过72%）、伊朗（93.2%）和韩国（总体上73.1%；肉鸡中97.3%，蛋鸡中67.5%）的繁殖鸡群中报告[12, 13, 23, 26]，这支持了aMPV在多样化生产环境中的区域传播观点。这些发现将置于更广泛的流行病学背景下考虑。

这些发现的解释应考虑到ELISA测量的是暴露而非功能性的中和活性。尽管如此，商业间接ELISA已获验证可用于流行病学监测，并在aMPV研究中得到广泛应用[28, 31]。观察到的高血清阳性率得到了同一鸡群合并气管拭子中aMPV RNA的同时检测的支持，证实了活跃的病毒传播，并降低了非特异性反应的可能性。因此，血清学和分子数据一致表明aMPV A和B亚型的持续传播。分子分析显示B亚型明显占主导地位，A亚型未被单独检测到，而A和B亚型的共检测仅限于贝海拉省。这种亚型分布与摩洛哥、突尼斯、阿尔及利亚和土耳其的报告一致[14, 15, 38, 39]，在这些地区也经常检测到B亚型。在贝海拉观察到的有限共检测可能反映了密集繁殖系统内的局部亚型重叠，这种模式也已在其他大型商业禽流感病原体中描述[62]。然而，需要更广泛的基因组数据来确定这代表稳定的共传播还是暂时的引入事件。不同群体和省份之间的病毒滴度变化可能反映了暴露压力、管理实践和生物安全条件的差异，这与其他禽类病毒感染（如马立克病和禽白血病）的情况类似[64]，从而凸显了种禽养殖场中呼吸道病毒传播的多因素性质。抗体强度在各个生产阶段的空间分布变化进一步说明了生态因素与生产相关因素之间的相互作用。在16周龄时，贝尼苏夫、吉萨和法尤姆省的抗体平均水平较高。调查于2024年11月进行，正值野生鸟类的迁徙季节。此外，后院和小规模养殖场靠近湿地和灌溉渠道，可能会增加从野生鸟类间接传播病原体的风险[65]。相比之下，尼罗河三角洲省份在35周龄时抗体水平较高的情况可能反映了该区域内持续的病毒传播。尼罗河三角洲地区以高禽类密度、大规模的养殖场以及人员和设备的频繁流动为特征，这些因素都有利于病毒的持续存在和传播[47, 66]。在北非和中东的生产系统中也发现了类似的由密度驱动的禽类病原体扩张现象[39, 47, 48, 49]。尽管在横断面研究中无法确立因果关系，但观察到的分布与生产阶段相关的暴露动态差异是一致的。尽管所研究的群体未接种疫苗，但不能完全排除其间接接触来自邻近养殖场的疫苗衍生病毒的可能性。欧洲已有疫苗衍生病毒返祖事件的记录，包括一种与火鸡临床疾病相关的A型aMPV疫苗株，尽管受影响农场近期并未接种疫苗[67, 68]。所使用的针对特定亚型的RT-qPCR方法无法区分野毒株和疫苗株，分子鉴别需要基于序列的分析[32]。目前，该数据集中没有直接证据表明病毒来源与疫苗有关。对具有高病毒载量的样本进行测序正在进行中，这将有助于更准确地确定流通病毒株的系统发育位置。

需要承认几个限制因素。横断面设计限制了我们对传播方向和时间动态的推断。此外，由于缺乏全长基因或全基因组测序，使得菌株分化和进化分析的分辨率受到限制。在病毒载量较低的情况下，使用合并的气管拭子样本进行RT-qPCR分析可能会因稀释效应而降低分析灵敏度。然而，在大规模的禽类呼吸道病毒分子监测项目中，合并样本的方法被广泛接受，因为它可以在节省实验室资源的同时实现高效的群体筛查，并在需要时通过单个样本检测来验证阳性结果。为了明确病毒的引入途径和维持机制，还需要进行纵向监测，并结合家禽与野生动物之间的基因组特征分析。正如先前研究建议的那样[69, 70]，进一步评估潜在的垂直传播也是必要的，以便更好地界定种禽群体的流行病学作用。

**结论**
本研究显示，在调查的埃及所有省份中，未接种疫苗的肉鸡种禽群体中普遍存在aMPV病毒，其中B亚型占主导地位。血清学和分子证据共同证实了病毒的持续存在，并揭示了与生产系统差异相关的区域性和年龄差异。这些发现强调了综合监测和进一步的基因组分析的重要性，以更好地了解aMPV的流行病学特征，并为种禽群体的疫情控制提供科学依据。