一种快速多重检测平台，能够同时检测基孔肯雅病毒、登革热病毒以及进行登革热血清分型，该平台基于等温扩增技术和侧向流动试纸条技术实现

《Infectious Diseases of Poverty》：A rapid multiplex platform for simultaneous detection of chikungunya virus, dengue virus, and dengue serotyping based on isothermal amplification and lateral flow dipsticks

　　摘要

背景
快速准确地诊断登革热病毒（DENV）和基孔肯雅病毒（CHIKV）对于有效管理患者和控制疫情至关重要。在这项研究中，建立了一种双链逆转录多酶等温扩增（RT-MIRA）检测方法，用于同时检测DENV和CHIKV，随后通过嵌套RT-MIRA检测方法进行DENV血清分型（DENV-1至DENV-4）。

方法
设计了针对DENV 3′-UTR、CHIKV E1基因和四种DENV血清型的特异性引物和探针。双链RT-MIRA和嵌套DENV RT-MIRA血清分型反应系统在39°C下进行了优化，使用便携式荧光或侧向流动试纸读数器进行检测。为了方法学验证，对35种相关病原体进行了特异性评估，并通过probit回归确定了95%检测限（LOD95）。为了临床验证，测试了236名疑似患者的血清样本，并与RT-qPCR和血清学检测进行了比较。统计分析包括使用Wilson评分方法计算95%置信区间（CIs）和Cohen’s kappa（κ）。为了外部验证，回顾性分析了12例CHIKV阳性的临床样本和5例人工模拟的共感染样本，以验证检测方法的准确性。

结果
双链RT-MIRA检测方法与其他病原体没有交叉反应。DENV的LOD95值为13.47拷贝/μl，CHIKV的LOD95值为10.49拷贝/μl。临床验证显示DENV的敏感性为96.15%（95% CI：89.28%–98.67%），CHIKV的敏感性为88.89%（95% CI：67.20%–96.90%）。两者的特异性均为100%（95% CI：92.87%–100%）。与RT-qPCR的一致性很强（DENV：κ=0.96，CHIKV：κ=0.92）。嵌套RT-MIRA血清分型检测方法具有高敏感性（LOD95：1.6–18.7拷贝/μl），无交叉反应，能够准确地将75份DENV阳性样本分为71份DENV-1和4份DENV-2。在外部验证中，该方法准确检测出了10例CHIKV单感染和2例CHIKV/DENV共感染，并在模拟基质中区分了四种DENV血清型。

结论
开发了一种快速灵敏的集成方法，结合了双链RT-MIRA来检测DENV和CHIKV，以及嵌套RT-MIRA进行DENV血清分型。扩增和检测步骤的简便性和快速性表明该平台适用于资源有限的地区的现场检测和监测，特别是在与便携式提取方法结合使用时。

背景
快速准确地诊断登革热病毒（DENV）和基孔肯雅病毒（CHIKV）对于有效管理患者和控制疫情至关重要。在这项研究中，建立了一种双链逆转录多酶等温扩增（RT-MIRA）检测方法，用于同时检测DENV和CHIKV，随后通过嵌套RT-MIRA检测方法进行DENV血清分型（DENV-1至DENV-4）。

方法
设计了针对DENV 3′-UTR、CHIKV E1基因和四种DENV血清型的特异性引物和探针。双链RT-MIRA和嵌套DENV RT-MIRA血清分型反应系统在39°C下进行了优化，使用便携式荧光或侧向流动试纸读数器进行检测。为了方法学验证，对35种相关病原体进行了特异性评估，并通过probit回归确定了95%检测限（LOD95）。为了临床验证，测试了236名疑似患者的血清样本，并与RT-qPCR和血清学检测进行了比较。统计分析包括使用Wilson评分方法计算95%置信区间（CIs）和Cohen’s kappa（κ）。为了外部验证，回顾性分析了12例CHIKV阳性的临床样本和5例人工模拟的共感染样本，以验证检测方法的准确性。

结果
双链RT-MIRA检测方法与其他病原体没有交叉反应。DENV的LOD95值为13.47拷贝/μl，CHIKV的LOD95值为10.49拷贝/μl。临床验证显示DENV的敏感性为96.15%（95% CI：89.28%–98.67%），CHIKV的敏感性为88.89%（95% CI：67.20%–96.90%）。两者的特异性均为100%（95% CI：92.87%–100%）。与RT-qPCR的一致性很强（DENV：κ=0.96，CHIKV：κ=0.92）。嵌套RT-MIRA血清分型检测方法具有高敏感性（LOD95：1.6–18.7拷贝/μl），无交叉反应，能够准确地将75份DENV阳性样本分为71份DENV-1和4份DENV-2。在外部验证中，该方法准确检测出了10例CHIKV单感染和2例CHIKV/DENV共感染，并在模拟基质中区分了四种DENV血清型。

结论
开发了一种快速灵敏的集成方法，结合了双链RT-MIRA来检测DENV和CHIKV，以及嵌套RT-MIRA进行DENV血清分型。扩增和检测步骤的简便性和快速性表明该平台适用于资源有限的地区的现场检测和监测，特别是在与便携式提取方法结合使用时。

背景
登革热病毒（DENV）和基孔肯雅病毒（CHIKV）是由埃及伊蚊和白纹伊蚊在热带和亚热带地区传播的节肢动物媒介病毒，对全球公共卫生构成了威胁。登革热的临床表现特征是突然出现高烧、剧烈头痛、肌肉疼痛、关节疼痛、斑丘疹和白细胞减少。相比之下，基孔肯雅感染的特点是突然出现高烧和致残性关节疼痛，通常影响小关节，伴有肌肉疼痛、斑丘疹、头痛和结膜炎。截至2024年4月，全球DENV病例超过760万例，其中16,000例为重症病例，3000例死亡[1]。到2025年9月，CHIKV已传播到119个国家，导致181,679例确诊病例和155例死亡，主要发生在美洲[2, 3]。两种病毒的症状表现相似，可能导致误诊[4, 5]。DENV包含四种血清型，抗体依赖性增强现象会导致重症[6]。目前没有特定的抗病毒治疗方法，疫苗选择也有限。这种情况凸显了先进诊断方法的迫切需求，以应对这些感染的复杂性。

DENV和CHIKV的实验室诊断主要依赖于血清学检测和核酸扩增测试（NAATs）。血清学检测，包括酶联免疫吸附试验（ELISA）和快速检测，用于检测免疫球蛋白M（IgM）和免疫球蛋白G（IgG）[7]。这些抗体在恢复期诊断过程中起着关键作用，有助于区分原发性和继发性感染。然而，黄病毒之间的交叉反应可能导致假阳性，从而复杂化DENV血清型的鉴定[8, 9]。DENV非结构蛋白1（NS1）抗原检测是急性期筛查的宝贵工具，但由于免疫复合物的存在，其在继发性感染中的敏感性可能会降低[10]。大量研究表明，NAATs，特别是逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR），因其高灵敏度和特异性而被视为早期诊断的金标准[11]。已经开发出多重检测方法，可以同时检测所有DENV血清型和CHIKV[12]。等温扩增技术，包括逆转录环介导的等温扩增（RT-LAMP）、重组酶聚合酶扩增（RPA）和逆转录多酶等温快速扩增（RT-MIRA）、基于CRISPR-Cas系统的检测方法，为现场检测（POCT）提供了快速结果[13, 14]。然而，这些技术成本高昂且复杂。开发新的检测方法对于有效区分DENV、CHIKV及其血清型至关重要。

在这项研究中，我们建立了一种双链RT-MIRA检测方法，用于快速超灵敏地检测DENV和CHIKV感染，并同时进行DENV血清分型。该方法的可靠性和成本效益使其非常适合用于现场识别DENV和CHIKV感染，以及疾病监测和控制。

材料与方法
RNA标准的制备
通过体外转录合成了泛DENV、DENV1-4和CHIKV的标准RNA转录本。使用T7高产RNA转录试剂盒（Vazyme，南京，中国）进行RNA转录，随后使用Qubit 4.0版本（Thermo Fisher Scientific，美国）进行定量。RNA标准物依次稀释十倍，作为后续实验的模板。

细胞和病毒
婴儿仓鼠肾（BHK-21）细胞在Dulbecco改良Eagle培养基中于37°C培养。而白纹伊蚊C6/36细胞在RPMI-1640培养基中于28°C培养。两种细胞系均在含有10%胎牛血清和100 U/ml青霉素-链霉素的培养基中培养，并在5% CO2环境下进行培养。使用C6/36细胞系繁殖了四种DENV毒株：DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4。此外，三种CHIKV基因型（ECSA、亚洲型和西非型）也在BHK-21细胞中繁殖。病毒滴度随后通过BHK-21细胞 plaque检测进行评估。用于特异性评估的35种病原体来自云南省公共卫生和生物安全重点实验室（表S1）。

双链RT-MIRA的设计
CHIKV特异性的MIRA引物和探针按照先前的描述进行了设计[15]。泛DENV引物和探针针对3′非编码区（3′-UTR），而血清型特异性引物和探针针对5′非编码区（5′-UTR）、前膜蛋白和衣壳蛋白基因。引物和探针的设计使用了Primer Premier 5.0（Premier Biosoft International，旧金山，美国），随后由泰禾生物技术有限公司（北京，中国）进行合成。序列列在表S2和S3中。

DENV和CHIKV的双链RT-MIRA检测
按照制造商的说明，使用GeneRotex系统和Ex-DNA/RNA（4.0）试剂盒（Tianlong，西安，中国）从参考病原体和存档的临床样本中提取核酸。双链RT-MIRA检测使用针对DENV和CHIKV优化的引物和探针组合进行。简要来说，50 μl的反应混合物包括29.4 μl缓冲液A、2.0 μl每种引物（10 μmol/L）、0.6 μl每种探针（10 μmol/L）、2.5 μl缓冲液B、3.9 μl无核酸酶的水和5 μl RNA模板。扩增在39°C下进行20分钟，结果使用便携式荧光读取器或LFD试纸读取。DENV血清分型采用嵌套MIRA策略，包括外部RT-MIRA和内部RT-MIRA步骤[15]。内部MIRA扩增的试剂固定在试管盖中，与底部的外部RT-MIRA反应混合物空间分离。第一轮扩增在39°C下进行10分钟，然后离心以混合内部试剂和主要扩增产物。这启动了第二轮在39°C下的20分钟扩增，使得整个扩增过程无需打开试管即可完成。结果使用便携式荧光读取器或LFD试纸读取。

特异性、敏感性、重现性和准确性的评估
共测试了35种病原体，包括22种病毒、7种细菌、3种酵母和3种真菌（表S1）。使用泛DENV、DENV 1–4和CHIKV RNA标准物的十倍系列稀释（从10^4到1拷贝/μl）在三个独立重复实验中确定检测限（LOD）。使用10^3拷贝/μl RNA标准物测量检测内的重复性和检测间的重复性，检测在不同的日子进行。最后，测试了实验室存储的阳性和阴性样本以及人工合成的混合感染样本。

稳定性和干扰的评估
冻干试剂在4°C、25°C和37°C下存储最多14天，随后使用添加了灭活DENV和CHIKV培养物的阴性血清进行测试。此外，在不同浓度的内源性物质（血红蛋白和白蛋白）和外源性物质（抗凝剂（肝素、EDTA和柠檬酸钠）以及常见治疗药物（利巴韦林、对乙酰氨基酚、阿莫西林和地塞米松）存在下测试了灭活的病毒培养物。

临床样本
2019年至2020年间，从昆明长水国际机场收集了236份疑似患者的临床血清样本。研究人群包括出现急性发热（>37.5°C）或具有虫媒病毒感染临床症状（如皮疹、关节痛或头痛）的旅行者。体积不足（<200 μl）或缺少关于症状起始时间的关键临床数据的样本被排除。所有样本均在-80°C下储存以提取RNA。所有样本都经过严格的诊断算法，包括RT-qPCR、IgM捕获ELISA和NS1抗原检测，这些作为参考标准。根据这些参考结果，队列包括确诊的DENV和CHIKV阳性病例，以及健康对照组和其他确认为阴性的发热疾病病例。分析了研究队列的人口统计和临床特征，以评估其代表性。如图S1所示，患者年龄范围广泛，性别分布均衡。最常见的临床症状是发热和皮疹，这与典型的虫媒病毒感染表现一致。这个特征明确的样本集随后用于评估双链RT-MIRA检测方法的诊断性能（敏感性、特异性和一致性）。

外部验证
外部验证由云南省公共卫生和生物安全实验室独立进行。使用2019年至2020年间在昆明长水国际机场识别的12份临床样本进行了回顾性分析。这些样本包括10例CHIKV单感染病例和2例CHIKV/DENV共感染病例。此外，通过将之前被确认为四种DENV血清型阳性的五个人血清样本与CHIKV单阳性血浆混合，制备了人工模拟的共感染样本。所有验证程序均由上述实验室的工作人员执行。

**统计分析**
统计分析和图表生成使用了GraphPad Prism 8.0.1（GraphPad Software，美国加利福尼亚州圣地亚哥）、OriginPro 2025（OriginLab Corporation，美国马萨诸塞州北安普顿）和R 4.5.2（R Foundation for Statistical Computing，奥地利维也纳）。实验重复进行了三次，数据以平均值±标准差（SD）的形式呈现。95%检测限（LOD95）通过probit回归法估算。在临床验证中，计算了诊断敏感性（真阳性数/（真阳性数+假阴性数）和特异性（真阴性数/（真阴性数+假阳性数）），并使用Wilson评分方法确定了95%置信区间（CIs）。通过Cohen’s kappa系数（κ）评估了双层RT-MIRA检测方法与参考方法之间的一致性。为了评估配对二元结果的统计显著性，使用了McNemar检验。P值<0.05被认为具有统计意义。

**从样本到信号的完整工作流程**
针对CHIKV和DENV的双层RT-MIRA检测工作流程如图1所示。收集疑似患者的血清样本，并提取病毒RNA作为扩增的模板。双层RT-MIRA扩增过程在39°C的恒定温度下进行20分钟，期间病毒RNA被逆转录为cDNA。重组酶促进特定引物与cDNA的结合，从而形成核蛋白复合体。目标基因的指数级扩增过程涉及使用解旋酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶。荧光标记的探针与模板杂交，然后外切酶释放荧光信号。这些测试的结果可以使用便携式荧光读数仪实时解读，或者使用侧向流装置（LFD）作为终点测量。DENV阳性样本会进行嵌套RT-MIRA检测以确定感染的血清型。

**图1**
该图的替代文本可能是使用AI生成的。

**双层RT-MIRA工作流程和操作原理的示意图。**
a. 从样本到信号的完整工作流程概述。从疑似DENV和CHIKV患者处收集血清样本（I）；进行核酸提取（II）；将提取的RNA加入双层RT-MIRA反应体系并在39°C下孵育20分钟（III）；解读结果（IV）。对于DENV阳性样本，进一步进行嵌套RT-MIRA检测以确定感染的DENV血清型（IV）。
b. 双层RT-MIRA原理的示意图。病毒RNA首先被逆转录为互补DNA（cDNA）。重组酶促进特定引物与cDNA模板的结合，形成核蛋白复合体。在解旋酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶的协同作用下，目标基因被指数级扩增。同时，荧光标记的探针与模板杂交，外切酶III（exo）或外切酶IV（nfo）特异性地识别探针上的THF位点，从而释放荧光信号或形成荧光标记的扩增产物。扩增结果可以使用便携式荧光读数仪实时解读，或者使用侧向流装置（LFD）在终点处检测。
RT-MIRA：逆转录多酶恒温扩增；CHIKV：基孔肯雅病毒；DENV：登革热病毒。

**建立双层RT-MIRA检测方法**
构建双层RT-MIRA检测系统的初步阶段包括筛选最佳引物组合和优化反应条件。设计了针对DENV 3′UTR和CHIKV E1基因的引物和探针，并使用浓度为1×10^4拷贝/μl的RNA标准品进行测试。F1+R1（针对DENV）和F3+R1（针对CHIKV）的MIRA引物组合显示了最高的扩增效率（图2a）。最佳条件确定为39°C、400 nmol/L的引物浓度和120 nmol/L的探针浓度，获得了最大的效率和最强的荧光信号（图2b–d）。因此，开发了一种用于同时检测DENV和CHIKV的双层RT-MIRA检测方法。

**图2**
该图的替代文本可能是使用AI生成的。

**双层RT-MIRA检测系统反应条件的优化。**
a. 设计了针对DENV和CHIKV的多重MIRA引物，并使用浓度为1×10^4拷贝/μl的RNA标准品进行引物筛选。
b–d 使用相同浓度（1×10^4拷贝/μl）的RNA标准品，系统地优化了影响双层RT-MIRA扩增效率的关键因素，包括温度、引物浓度和探针浓度。
RT-MIRA：逆转录多酶恒温扩增；CHIKV：基孔肯雅病毒；DENV：登革热病毒。

**双层RT-MIRA检测方法的特异性和敏感性评估**
通过测试35种与DENV和CHIKV引起的发热性疾病相似的病原体，评估了其交叉反应性。结果表明完全没有交叉反应性，从而证实了双层RT-MIRA检测方法的显著特异性（图3a，表S1）。为了评估分析敏感性，分析了10倍系列稀释的标准RNA（从1×10^4拷贝/μl到1拷贝/μl），共进行10次重复实验。在浓度≥100拷贝/μl时观察到100%的检测率，随着RNA浓度的降低，检测率下降（图3b–e）。通过荧光检测确定DENV的LOD95为13.47拷贝/μl，CHIKV的LOD95为10.49拷贝/μl（图3c，f）。这些结果证实了双层RT-MIRA检测方法同时检测DENV和CHIKV的高敏感性。

**图3**
该图的替代文本可能是使用AI生成的。

**双层RT-MIRA检测系统的特异性和敏感性评估。**
a. 使用35种病原体评估双层RT-MIRA检测方法的特异性（显示部分结果）。
b、d、e 使用RNA标准样本（浓度范围从1×10^4拷贝/μl到1拷贝/μl），采用荧光检测和LFD方法评估双层RT-MIRA系统检测登革热病毒（DENV）和基孔肯雅病毒（CHIKV）的分析敏感性。
c、f 比较荧光检测和LFD的概率回归图：红色曲线和粉红色阴影区域代表DENV及其95%置信区间（CI），蓝色曲线和浅蓝色区域代表CHIKV及其95%置信区间（CI）。黑色虚线与红色或蓝色虚线的交点表示每种方法的95%检测限（LOD95）。每种浓度都进行了10次平行重复实验。

**嵌套RT-MIRA检测方法的性能评估**
如先前在另一项研究中所述，使用嵌套RT-MIRA检测方法进行DENV血清型鉴定。该检测方法使用了针对所有四种DENV血清型的最佳特异性引物组合（图S2）。扩增过程在39°C下进行，最初的10分钟阶段在外层RT-MIRA反应中进行，随后的20分钟阶段在内部MIRA反应中进行。该检测方法的分析性能在特异性和敏感性方面都得到了验证。结果显示与另外34种测试病原体无交叉反应性，从而确认了每种血清型的特异性（图4a，表S1）。通过使用10倍系列稀释的RNA，测得所有血清型的检测限低至1拷贝/μl（图4b，d）。随后的测试确定了LOD95，不同血清型的LOD95范围从1.6到18.7拷贝/μl，取决于所使用的检测方法（图4c，e）。这些结果证实了嵌套RT-MIRA检测方法在登革热病毒血清型鉴定中的高敏感性和可靠性。

**图4**
该图的替代文本可能是使用AI生成的。

**嵌套RT-MIRA检测方法的特异性和敏感性评估。**
a. 使用35种病原体评估嵌套RT-MIRA检测方法的特异性（显示部分结果）。
b、d 使用RNA标准样本（浓度范围从1×10^4拷贝/μl到1拷贝/μl），采用荧光检测和LFD方法评估双层RT-MIRA系统检测登革热病毒（DENV）和基孔肯雅病毒（CHIKV）的分析敏感性。
c、f 比较荧光检测和LFD的概率回归图：红色曲线和粉色阴影区域代表DENV及其95%置信区间（CI），蓝色曲线和浅蓝色区域代表CHIKV及其95%置信区间（CI）。黑色虚线与红色或蓝色虚线的交点表示每种方法的95%检测限（LOD95）。每种浓度都进行了10次平行重复实验。

**双层RT-MIRA和嵌套RT-MIRA的重复性和准确性评估**
对双层RT-MIRA和嵌套RT-MIRA检测方法的重复性和准确性进行了严格评估。如图S3所示，检测内的变异系数（CV）范围为1.99%至3.19%，检测间的CV范围为3.68%至4.25%，均远低于5%的阈值。使用138个样本验证了临床性能，结果显示与参考qPCR方法的一致性为100%（表1）。具体来说，双层RT-MIRA正确识别了98例DENV阳性和28例CHIKV阳性病例。此外，嵌套RT-MIRA在血清型鉴定方面的准确性为100%，成功识别了所有10例混合DENV血清型感染病例和8例DENV/CHIKV共感染病例。值得注意的是，对于DENV-2血清型，嵌套RT-MIRA和qPCR均一致地从20个样本中识别出19例阳性病例，进一步证实了所开发的MIRA平台的高可靠性。

**表1**
双重RT-MIRA检测DENV和CHIKV的准确性评估，以及使用嵌套RT-MIRA检测DENV的血清型鉴定。

**稳定性和干扰分析**
使用模拟临床样本评估了冻干试剂的稳定性。结果表明，在4°C、25°C和37°C下储存长达14天后，该检测方法始终保持了检测DENV和CHIKV的能力，显示出优异的试剂稳定性（表S4）。此外，该检测方法对常见的基质干扰具有很强的鲁棒性。在含有高浓度血红蛋白、白蛋白或抗凝剂（肝素、EDTA和柠檬酸钠）的样本中，或在存在常见治疗药物的情况下，均未观察到显著的抑制或交叉反应（表S5）。

**通过临床样本验证**
总共236份疑似DENV和CHIKV感染的患者的血清样本接受了anti-CHIKV IgM、DENV NS1抗原和RT-qPCR的检测。检测过程确定了78份DENV阳性样本和18份CHIKV阳性样本，其中包括一例共感染病例（图5a）。随后，这些阳性样本以及50份阴性对照样本接受了双层RT-MIRA检测。该检测方法成功区分了临床阳性和阴性样本（图5b，c），显示DENV的敏感性为96.15%（75/78；95%置信区间：89.28%–98.67%），特异性为100%（50/50；95%置信区间：92.87%–100%）。对于CHIKV，敏感性为88.89%（16/18；95%置信区间：67.20%–96.90%），特异性为100%（95%置信区间：92.87%–100%）（图5b–e）。统计分析显示双重RT-MIRA和RT-qPCR在DENV检测方面有显著的一致性（κ=0.96；P>0.05），以及与DENV NS1抗原的良好一致性（κ=0.83；P>0.05）（图5d）。对于CHIKV，虽然与RT-qPCR的一致性很好（κ=0.92；P>0.05），但与anti-CHIKV IgM的一致性中等（κ=0.53；P>0.05）（图5e）。进一步分析循环阈值（CT）值确认了双层RT-MIRA在各种病毒载量下的稳健检测能力，仅有一例DENV的检测结果不一致（图S4a）。此外，分子结果和血清学结果之间的差异主要归因于采样时间的不同，反映了两种方法的诊断窗口期不同（图S4b）。

**图5**
该图的替代文本可能是使用AI生成的。

**双层RT-MIRA检测DENV和CHIKV的临床评估。**
a. 临床研究设计：共招募了236名疑似患者，所有患者均根据临床诊断指南进行了评估，包括RT-qPCR、DENV NS1抗原检测和anti-CHIKV IgM检测。
b、c 显示DENV（b）和CHIKV（c）阳性样本的荧光信号（RFU）和侧向流条强度（Dr）分布的箱形图，与阴性对照（n=50）进行比较。红色虚线表示临界值。
d、e 双层RT-MIRA检测方法与标准方法在DENV（d）和CHIKV（e）诊断上的一致性分析。表格提供了敏感性、特异性、阳性/阴性预测值（PPV/NPV）、总体一致性（Kappa系数）和McNemar检验p值。
RT-MIRA：逆转录多酶恒温扩增；CHIKV：基孔肯雅病毒；DENV：登革热病毒；RT-qPCR：逆转录-定量聚合酶链反应。

**随后，对75份DENV阳性样本进行了嵌套RT-MIRA检测和Sanger测序（图6a）。**结果显示71份样本对DENV-1呈阳性（96.7%），4份样本对DENV-2呈阳性（5.3%）（图6b）。这些发现的有效性通过Sanger测序结果和基于E1区域的系统发育树进一步得到了证实，这为发现结果的准确性提供了额外的验证（图6c、d）。图6：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。

对DENV的嵌套RT-MIRA血清分型准确性的临床评估：a. 使用嵌套RT-MIRA测试了75个DENV阳性样本，并同时进行了Sanger测序。b. 比较了嵌套RT-MIRA和Sanger测序所得的DENV血清分型结果。c. DENV E区域的代表性测序色谱图。d. 使用MAFFT v.7对扩增的DENV E区域核苷酸序列进行了比对，并使用IQ-TREE v.2.2.6和GTR + F + I + R4模型构建了系统发育树，进行了1000次超快自助法复制。RT-MIRA：逆转录多酶等温扩增；DENV：登革热病毒。

外部验证结果显示，双分支RT-MIRA测试有效检测出了所有10例CHIKV单感染病例和2例CHIKV/DENV共感染病例（图S5）。在人工模拟样本的分析中，该测试能够准确识别特定的DENV血清型，并且即使在存在CHIKV共感染的情况下也能在复杂样本中区分四种DENV血清型（图S6）。总体而言，这些发现证实了双分支RT-MIRA测试在准确检测CHIKV和DENV方面的高可靠性和临床适用性，以及嵌套RT-MIRA测试在DENV血清分型方面的高准确性。

讨论：本研究引入了一种双分支POCT平台，用于同时检测和区分DENV和CHIKV，并采用嵌套RT-MIRA方法进行DENV血清分型。双分支RT-MIRA方法表现出超灵敏的检测能力，DENV的LOD95为13.47拷贝/μl，CHIKV的LOD95为10.49拷贝/μl。这一性能超过了现有的方法，如RPA-CRISPR/Cas12a和RT-LAMP [16,17,18]。为了提高检测的准确性，研究还调查了该测试与35种类似病原体的交叉反应性。嵌套RT-MIRA测试对于DENV血清型1-4的LOD95分别为9.17、9.13、2.03和1.6拷贝/μl，显示出比各种RT-LAMP测试更高的灵敏度 [19, 20]。临床验证表明，双分支RT-MIRA测试在检测DENV方面的灵敏度为96.15%，特异性为100%，超出了通过磁场凝集增强的RT-RPA方法 [21]。值得注意的是，这种高准确性也体现在血清分型上：所有75个DENV阳性样本的类型都正确无误，且结果与Sanger测序完全一致。对于CHIKV，灵敏度和特异性分别达到了88.89%和100%。然而，需要注意的是，研究中仅包括了18个CHIKV阳性临床样本，这可能是CHIKV灵敏度略低的原因。我们对不一致案例的时间分析（图S4b）确认，分子结果和血清学结果之间的差异源于它们不同的诊断窗口，而非测试失败。双分支RT-MIRA阳性/血清学阴性的样本出现在急性期早期（中位时间1-2天），反映了血清转化之前的病毒血症窗口。相比之下，双分支RT-MIRA阴性/血清学阳性的样本出现在后期（中位时间5-6天），与病毒清除和随后的免疫反应一致。这些发现突显了双分支RT-MIRA在早期诊断中的实用性，而血清学则作为后期阶段的补充工具，与已建立的感染动力学一致 [22, 23]。

如表S6所总结的，RT-MIRA平台在操作简便性、速度和成本效益方面相比传统的qPCR和其他等温方法（例如RT-LAMP）具有明显优势。其快速检测时间为20-30分钟，成本适中（每次测试5-10美元），为资源有限的设置提供了可扩展的解决方案，无需复杂的热循环仪 [24,25,26,27,28,29, 35,36,37,38,39]。整个工作流程，包括自动化样本准备和结果解释，可以在40分钟内完成。然而，与分子POCT平台强调的“提取-扩增-检测”集成设计概念相比，特别是那些无需提取的工作流程，还需要进一步优化 [30, 31]。尽管加速病毒裂解技术（例如将样本在80°C下加热2分钟）有助于从唾液和尿液等非侵入性材料中提取核酸，但从血液样本中分离和检测病毒RNA仍然是一个具有挑战性的任务 [32]。这种现象可以归因于免疫球蛋白G和各种酶抑制剂的存在，包括抗凝剂、血红蛋白和RNases，它们具有降解RNA的能力 [33, 34]。为了解决这个问题，研究采用了全自动设备来促进病毒RNA的释放和纯化，从而提高了检测灵敏度。

本研究有几个局限性。首先，尽管我们进行了初步的外部验证和模拟共感染测试来评估测试的可行性，但临床样本的数量相对较少。特别是对于自然发生的DENV和CHIKV共感染以及特定的DENV血清型（DENV-2、-3和-4），这种方法仅在一家实验室得到了验证，因此无法进行实验室间或多中心验证。其次，我们使用血清和血浆评估了该测试，但没有评估使用全血或指尖采血样本的可行性，而这些样本对于现场应用至关重要。第三，虽然当前的工作流程速度较快，但尚未完全自动化。未来的工作将集中在进行大规模的多中心验证，并开发一种完全集成的“样本到结果”设备，该设备结合了样本预处理、扩增和智能终端连接。

结论：总之，我们开发了一种快速的双分支RT-MIRA诊断技术，可以同时检测DENV和CHIKV。对于DENV阳性的样本，嵌套RT-MIRA方法能够实现准确的血清分型。我们的结果显示，与RT-qPCR相比，该技术的表现始终如一，提供了更快、更方便的结果。这些特点使其成为资源有限环境中的一种合适候选技术，并为未来的POCT应用提供了有前景的工具。