通过贝叶斯潜在类别分析评估血浆游离DNA定量PCR技术在加蓬兰巴雷内（Lambaréné）孕妇队列中诊断血吸虫病（Schistosoma haematobium）的准确性

《Infectious Diseases of Poverty》：Diagnostic accuracy of plasma cell-free DNA qPCR for Schistosoma haematobium assessed by Bayesian latent class analysis in a cohort of pregnant women from Lambaréné, Gabon

　　摘要
背景
有效诊断血吸虫病对于疾病控制至关重要。然而，目前的检测工具往往对低强度感染缺乏敏感性，这是世界卫生组织（WHO）最近发布的被忽视的热带病路线图中指出的一个挑战。本研究旨在评估一种新型的无细胞DNA（cfDNA）定量聚合酶链反应（qPCR）检测方法，该方法仅使用20微升血浆并进行粗略的DNA提取。这种方法旨在提高诊断准确性，并降低分子检测在实地应用中的实施障碍。我们将该方法与尿液过滤显微镜检测以及用于加蓬Lambaréné地区孕妇的Up-converting Reporter Particle Lateral Flow Circulating Anodic Antigen（UCP-LF CAA）检测方法进行了性能比较。

方法
在加蓬对296名孕妇进行了一项前瞻性横断面研究。2018年12月至2020年11月期间收集了EDTA抗凝的血液、尿液和粪便样本。尿液样本通过尿液过滤显微镜检测和UCP-LF CAA检测进行分析。cfDNA qPCR检测则使用简化的DNA提取方法对20微升冻存血浆进行了回顾性分析。通过敏感性、特异性和一致性指标来评估诊断准确性。由于缺乏金标准，研究采用了贝叶斯潜在类分析（BLCA）来估计检测性能。

结果
诊断阳性率分别为：cfDNA qPCR检测为24.3%，尿液过滤显微镜检测为18.6%，UCP-LF CAA检测为20.9%。不同检测方法之间的一致性有限。BLCA结果显示qPCR检测的敏感性最高（74.0%，95%置信区间：57.2–90.8%），其次是UCP-LF CAA（65.7%，95%置信区间：49.0–82.8%）。显微镜检测的特异性最高（94.9%，95%置信区间：89.6–99.3%）。估计的患病率在22.5%至27.1%之间。接收者操作特征（ROC）分析证实了各检测方法的良好表现（AUC 0.837–0.868），结合任何两种检测方法的性能进一步提高（AUC最高达0.931）。

结论
本研究验证了仅使用20微升血浆的新型cfDNA qPCR方法的高敏感性，其性能与显微镜检测和UCP-LF CAA相当。虽然显微镜检测保持了高特异性，但将其与高敏感性检测方法（如qPCR或UCP-LF CAA）结合使用可以显著提高诊断效果。进一步优化这种简化版的qPCR检测方法将使我们更接近于一种高度准确、适用于资源有限地区的便捷型诊断工具，这对于血吸虫病控制计划至关重要。

背景
有效诊断血吸虫病对于疾病控制至关重要。然而，目前的检测工具往往对低强度感染缺乏敏感性，这是世界卫生组织最近发布的被忽视的热带病路线图中指出的一个挑战。本研究旨在评估一种新型的无细胞DNA（cfDNA）定量聚合酶链反应（qPCR）检测方法，该方法仅使用20微升血浆并进行粗略的DNA提取。这种方法旨在提高诊断准确性，并降低分子检测在实地应用中的实施障碍。我们将该方法与尿液过滤显微镜检测以及用于加蓬Lambaréné地区孕妇的Up-converting Reporter Particle Lateral Flow Circulating Anodic Antigen（UCP-LF CAA）检测方法进行了性能比较。

方法
在加蓬对296名孕妇进行了一项前瞻性横断面研究。2018年12月至2020年11月期间收集了EDTA抗凝的血液、尿液和粪便样本。尿液样本通过尿液过滤显微镜检测和UCP-LF CAA检测进行分析。cfDNA qPCR检测则使用简化的DNA提取方法对20微升冻存血浆进行了回顾性分析。通过敏感性、特异性和一致性指标来评估诊断准确性。由于缺乏金标准，研究采用了贝叶斯潜在类分析（BLCA）来估计检测性能。

结果
诊断阳性率分别为：cfDNA qPCR检测为24.3%，尿液过滤显微镜检测为18.6%，UCP-LF CAA检测为20.9%。不同检测方法之间的一致性有限。BLCA结果显示qPCR检测的敏感性最高（74.0%，95%置信区间：57.2–90.8%），其次是UCP-LF CAA（65.7%，95%置信区间：49.0–82.8%）。显微镜检测的特异性最高（94.9%，95%置信区间：89.6–99.3%）。估计的患病率在22.5%至27.1%之间。接收者操作特征（ROC）分析证实了各检测方法的良好表现（AUC 0.837–0.868），结合任何两种检测方法的性能进一步提高（AUC最高达0.931）。

结论
本研究验证了仅使用20微升血浆的新型cfDNA qPCR方法的高敏感性，其性能与显微镜检测和UCP-LF CAA相当。虽然显微镜检测保持了高特异性，但将其与高敏感性检测方法（如qPCR或UCP-LF CAA）结合使用可以显著提高诊断效果。进一步优化这种简化版的qPCR检测方法将使我们更接近于一种高度准确、适用于资源有限地区的便捷型诊断工具，这对于血吸虫病控制计划至关重要。

背景
血吸虫病是一种由血吸虫属寄生虫引起的慢性疾病。该疾病在全球范围内造成了巨大的健康负担，目前全球有超过2.5亿人感染[1]。作为一种被忽视的热带病（NTD），大多数感染者生活在农村贫困地区，其中85%的病例发生在撒哈拉以南非洲[2]。作为抗击血吸虫病及其他21种被忽视的热带病的一部分，WHO制定了一份路线图，其中概述了截至2030年的目标及实现这些目标所需的行动。对于血吸虫病而言，目标是以公共卫生问题的形式消除该疾病。为此需要在多个领域采取行动，包括倡导、能力建设、资金支持、干预措施以及新型诊断技术的发展[3]。目前已有少数血吸虫病诊断方法被常规使用，但这些方法通常依赖手动计数技术，如尿液过滤（用于血吸虫病）或粪便样本的Kato-Katz涂片（用于曼氏血吸虫病），这些方法都存在敏感性和通量不足的问题[4]。其他检测方法依赖于免疫学检测技术来检测血吸虫抗原，例如市售的即时检测（POC）CCA检测，该方法可以检测成年血吸虫释放的循环阴极抗原（CCA），在检测曼氏血吸虫病方面表现良好，敏感性高于Kato-Katz方法[5]，但在检测血吸虫病方面敏感性较低[6]，且在某些特定人群（包括孕妇）中的特异性也较低[7, 8]。还有一种检测循环阳极抗原（CAA）的方法，其敏感性和特异性都有显著提高[9]，但它不是即时检测方法，且普及程度不高，而是依赖于Up-Converting Reporter Particle-Lateral Flow（UCP-LF）技术。目前正在开发一种快速检测CAA的方法[10]。CCA检测最初是为血清样本设计的；后来引入尿液样本以便于样本采集和提高可接受性[9, 11]。此外，血清学检测在非流行地区广泛用于检测从流行地区返回的有症状旅行者或大规模筛查[12, 13]，但这种方法无法区分当前感染和过去的感染。

分子方法具有克服这些限制的潜力，具有高通量、高敏感性和高特异性。转向分子检测方法进行传染病诊断依赖于通过聚合酶链反应（PCR）检测病原体DNA，多项研究探讨了qPCR在血吸虫病诊断中的应用；然而，这些方法大多依赖于富含虫卵的粪便或尿液样本，因此仅适用于曼氏血吸虫病或血吸虫病，而不适用于两者[5, 14]。还有一些研究探索了使用血清检测血吸虫无细胞DNA（cfDNA）的方法[15, 16]，但由于需要大量样本、复杂的样本处理步骤以及所需设备限制，其应用受到局限。其他基于等温扩增的核酸检测方法（如Loop-mediated isothermal amplification [LAMP] [17] 或 recombinase polymerase amplification [RPA] [19]）也有所探索，但这些方法也存在成本、知识产权保护和技术问题（如复杂的检测设计及缺乏多重检测能力）等障碍[21]。

现有的诊断方法目前被认为不足以支持该疾病的消除。无论是因为敏感性或特异性不足，还是因为无法实现即时检测。因此，需要在疾病监测、大规模药物分配（MDA）决策以及后续监测等各个阶段开发更敏感的即时检测方法，特别是对于监测消除进展而言，这些方法还有助于异源监测、耐药性检测以及检测血吸虫病的其他较少见的症状（如女性生殖器血吸虫病[FGS] [22]）。

实际上，WHO的一个工作组最近提供了血吸虫病诊断的明确目标产品规格（TPP），详细描述了一种能够同时检测曼氏血吸虫病和血吸虫病的便携式检测方法，该方法无需电源，仅需1–100微升尿液或血液样本，每小时可检测7–10人，结果可在2小时内得出，结果是半定量的，成本为每项检测1–3美元[23]。理想检测方法的敏感性和特异性应分别达到至少60%和95%，理想情况下应超过75%和96.5%。qPCR具备适合这一目标的特性，具有高通量和高准确性，尽管还需要进一步改进以满足血吸虫病等疾病的TPP要求，特别是在性能、成本和便携性方面。

本研究旨在评估使用减少样本量和处理要求的cfDNA qPCR检测方法在血吸虫病检测中的适用性，作为简化工作流程和未来实现即时检测平台的初步评估。为了评估该方法的性能，我们首先将其与尿液过滤显微镜检测和UCP-LF CAA进行了比较。为了使评估更加可靠，我们还进行了贝叶斯潜在类分析，以评估该方法的敏感性和特异性。通过潜在类分析，我们还研究了年龄和共感染等协变量及其对该人群血吸虫病发生的影响。

方法
研究地点
本文描述的实验和分析是更大研究（HelmVit, DRKS00016745）[24]的一部分，该研究在加蓬的Lambaréné医学研究中心（CERMEL）进行。HelmVit研究的目的是评估妊娠期间血吸虫病对胎儿维生素D代谢和免疫系统的影响。数据和样本收集时间为2018年12月至2020年11月，地点为加蓬中部的Lambaréné及其周边Moyen Ogooué省，该地区属于热带雨林气候，降雨量大，河流系统发达，拥有适合中间宿主蜗牛生存的淡水环境，这些条件有利于血吸虫病的流行，当地血吸虫病患病率约为23%[25]。

研究对象
受邀参与研究的对象是在H?pital Albert Schweitzer和Centre Hospitalier Régional Georges Rawiri这两家医疗机构进行常规产检和/或分娩访问的孕妇。计划在两家医疗机构分娩的参与者有资格参与研究。已知患有慢性疾病（糖尿病、HIV、乙型/丙型肝炎）的参与者被排除在研究之外。

研究设计和程序
HelmVit研究设计为前瞻性横断面研究。基线时收集了人口统计学（年龄、性别和地理位置）及人体测量学（体重、身高）数据。首次就诊时从参与者处收集了EDTA抗凝的血液、尿液和粪便样本。血浆样本从肝素抗凝血液中制备，并在-80°C下长期保存，随后用干冰运输至德国慕尼黑，在那里保存直至2024年进行检测。本评估仅包括首次就诊的样本。

寄生虫学检查和抗原检测
全血用于通过皂苷浓度技术检测微丝蚴，同时制作厚涂片和薄涂片，用Giemsa染色和显微镜检查疟原虫。尿液过滤后进行显微镜检查，作为泌尿生殖系统血吸虫病的标准诊断方法。此外，为了获得更准确的综合参考标准，使用UCP-LF CAA检测方法测量尿液样本中的CCA。检测使用的UCPAhT417试剂盒的阈值为2 pg/mL [9]。粪便样本通过Kato-Katz方法（WHO推荐的STH虫卵检测标准方法）、共培养技术和Harada Mori培养技术（用于检测钩虫和Strongyloides stercoralis幼虫）进行分析。所有检测均在加蓬Lambaréné的CERMEL进行。

样本选择
预计样本量为约300名参与者，根据标准诊断准确性样本量公式[26]进行估算，假设预期敏感性为60%，特异性为95%，精确度为10%，置信度为95%，患病率约为30%。最终数据集包含296名参与者，与计划样本量基本相符。这些参与者是从最初的648人 cohort中筛选出来的，筛选标准是他们具备进行比较分析所需的完整、匹配的诊断数据。入选条件包括有尿液过滤显微镜检结果和UCP-LF CAA检测的结果，以及足够的存档血浆体积以便进行回顾性cfDNA qPCR分析（图1）。参与者因缺乏诊断结果或血浆体积不足而无法进行分子检测被排除，而不是基于预先定义的临床或寄生虫学特征。

图1：此图像的替代文本可能是使用AI生成的。

Full size image：HelmVit研究及其所进行的诊断方法的示意图。HelmVit研究在加蓬的Lambaréné招募了600多名孕妇。在研究设计中，尿液过滤显微镜检查和UCP-LF CAA是用于确定血吸虫感染状态的关键诊断方法。所有样本都在同一时间点收集。在慕尼黑，其中296个样本接受了血浆qPCR检测。使用Biorender制作。

qPCR：定量聚合酶链反应；UCP-LF CAA：上转换报告粒子侧向流动循环阳极抗原。

cfDNA的DNA分离和纯化采用Quantabio公司的Extracta DNA Prep Kit（美国马萨诸塞州贝弗利市）这种简单的基于试剂的系统。选择这种方法是因为它之前已被用于血吸虫病的分子诊断，可以简化DNA制备过程，适用于资源有限的环境[27]，同时评估低复杂度血浆提取工作流程在cfDNA qPCR中的可行性，而不是为了最大化cfDNA产量。我们将每个血浆样本加入20微升提取试剂中，加热至95摄氏度10分钟，然后冷却至室温。可选地，我们还加入等体积的Stabilization Buffer以延长提取DNA的保存时间。

引物和探针设计：
对于S. haematobium的实时qPCR，针对Dra1序列[GenBank登录号：DQ15769 8.1]，使用以下引物（正向引物：5′-GAT CTC ACC TAT CAG ACG AAA CAA AGA-3′；反向引物：5′-CGA CCA ACC ATT CCG GAG ATAT-3′）和探针（5′-[6FAM] TGC GAAACAGG CACTTCCAC CAAC [BHQ1]-3′）。扩增子长度为86 bp。对于S. mansoni的实时qPCR，针对Sm1-7序列[GenBank登录号：M61098.1]，使用以下引物（正向引物：5′-GAT CTGA ATC CGA CCA ACC G-3′；反向引物：5′-GTT TTA TAT TAA CGC CCA CGC TC-3′）和探针（5′-[6FAM] CTA TGA AAA TCG TTG TAT CTC CGA AAC CAC [BHQ1]-3′）。扩增子长度为115 bp。S. mansoni的检测方法和分析评估是在检测方法开发过程中并行进行的；然而，在本研究中并未将此方法应用于临床样本。

实时qPCR：
qPCR反应混合物（总体积20微升）包含4微摩尔/升的引物、4微摩尔/升的DNA、4微摩尔/升的探针和4微摩尔/升的AptaTaq Genotyping Master（德国曼海姆Roche Diagnostics Deutschland GmbH）。调整后的实验程序包括在95摄氏度下预热10分钟，然后进行45个循环的95摄氏度孵育30秒和60摄氏度退火45秒。所有qPCR检测均在CFX384 Touch实时PCR检测系统（美国加利福尼亚州赫拉克勒斯市Bio-Rad公司）上进行。使用基因组DNA的系列稀释液和物种特异性对照来评估qPCR检测的灵敏度和物种特异性。每次qPCR检测板上都包括基因组DNA和阴性血清样本作为阳性和阴性对照，还包括无模板对照以监测PCR过程中的污染情况。未设置截止值，因为通过截止值分析未发现显著差异（数据未显示）。

统计分析：
所有诊断变量都被转换为二进制和连续格式以供分析，没有缺失或不确定的结果。阴性qPCR结果被赋予Ct值45.1，以便纳入定量分析。感染强度根据卵子数量分为无卵、轻度（1–49个卵/10毫升）或重度（≥50个卵/10毫升）三个等级。对诊断准确性的变异性分析是探索性的。没有预先指定的亚组分析；进行了事后比较（例如，按感染强度和共感染情况），以辅助解释结果。所有统计分析均使用R 4.4.2版本（奥地利维也纳的R Foundation for Statistical Computing）在RStudio 2025.09.2版本（美国波士顿Posit软件公司）中进行。使用R中的caret、epiR和DescTools包计算诊断性能指标，包括灵敏度、特异性、准确性和Youden’s J统计量。灵敏度和特异性最初是针对UF显微镜检查和UCP-LF CAA的联合参考标准进行计算的。诊断一致性通过euler包生成的Venn图进行可视化。为了评估测试间的一致性，计算了每对测试的Cohen’s kappa系数，并使用corrplot包分别用上下三角形热图表示。

在R中使用runjags包实现了贝叶斯潜在类别分析（BLCA）框架，以在没有金标准的情况下估计尿液过滤显微镜检查、qPCR和UCP-LF CAA检测的灵敏度和特异性。将观察到的测试结果（阳性/阴性）的二进制矩阵作为输入传递给模型。为了评估模型假设和先验规范的稳健性，探索了多种BLCA模型配置。这些配置包括有无截断先验的模型，将灵敏度和特异性限制在≥0.4的值，作为合理性约束以减少潜在的不可识别性并排除生物学上不合理的参数区域。此外，特异性参数的先验可以是平的（无信息的）或基于已发表的诊断性能估计的信息性Beta先验。信息性先验仅应用于特异性，反映了相对于灵敏度来说对特异性有更强的先验知识，而灵敏度则没有受到强烈约束，以允许数据主导推断。特异性信息性先验包括Beta(15,5)，对应于显微镜检查的平均值为75%（95%先验区间约为54–91%）[28]；Beta(18,3)，对应于UCP-LF CAA的平均值为86%（95%先验区间约为68–97%）[29]；Beta(9,3)，对应于qPCR的平均值为75%（95%先验区间约为48–94%）[29]。所有模型都假设了两类潜在结构（感染与未感染），并对类别比例使用了Dirichlet(1,1)先验。后验分布使用三个并行链进行估计，每个链有1,000个样本的燃烧期和5,000个保留的后验抽样。

模型输出基于每个测试的Se和Sp的后验点估计和95%可信区间进行比较。为了模型验证和测试一致性评估，我们从后验感染概率中得出个体级别的潜在类别状态，并将其与每个测试结果进行比较。计算了LCA推断状态和观察到的测试结果之间的Cohen’s kappa系数，并使用LCA状态作为参考生成接收者操作特征（ROC）曲线（例如，PCR Ct、UCP-LF CAA浓度）。分析使用pROC包进行，AUC值用于评估单独和两个测试组合的二元检测方法的区分能力。

评估了qPCR循环阈值（Ct）值、UCP-LF CAA浓度和尿液卵子计数之间的成对相关性。为了便于比较，Ct值被倒数（–Ct），以便更高的值表示更大的寄生虫负担。使用R中的ggplot2包计算Spearman等级相关系数（ρ），显著性通过双尾测试确定（P<0.05）。所有其他图表均使用GraphPad Prism 10.4.1版本（美国加利福尼亚州圣地亚哥GraphPad软件公司）制作。

结果：
在人类队列中评估之前，针对DraI（S. haematobium）和Sm1.7（S. mansoni）的qPCR检测方法的分析验证显示，其检测限为0.1皮克/微升基因组DNA（图S1），并且物种目标之间没有交叉反应（数据未显示）。

为了评估诊断性能，该qPCR检测方法在加蓬Lambaréné的孕妇临床队列中进行了评估，并与已建立的血吸虫病诊断方法进行了比较。这里我们关注了296名（图1）具有完整qPCR、尿液过滤显微镜检查和UCP-LF CAA诊断数据的参与者。该队列仅包含孕妇，中位年龄为24岁（表1）。

表1：2018年12月至2020年11月期间来自加蓬Lambaréné的HelmVit队列（N=296）的年龄分布和诊断结果。

首先，我们查看了每种测试的基本阳性率（表1和图2a）。qPCR检测到的阳性病例最多（24.3%），其次是UCP-LF CAA（20.9%），然后是尿液过滤显微镜检查（18.6%）。然后我们使用尿液过滤显微镜检查和UCP-LF CAA的复合参考标准来评估qPCR的性能。结果表明，qPCR的灵敏度为52.8%，特异性为87.9%（图2b，表S1）。当仅以尿液过滤显微镜检查为参考时，结果类似（灵敏度58.2%，特异性83.4%）（图S2a，表S2）。16.6%的显微镜检查阴性病例在qPCR中呈阳性（图2d）。另一方面，并非所有尿液显微镜检查中卵子负荷较轻或较重的病例（图2c）都能被qPCR检测到（图2d），这突显了测试方法之间存在差异，这也体现在每种诊断方法的所有阳性病例的Venn图中（图2e），其中只有19名参与者在三种测试中均呈阳性。这一点也体现在Cohen’s kappa得分中（图S2b），三种测试之间的一致性很低（0.35–0.37）。与二元测试结果之间的一致性一致，当比较qPCR Ct值与卵子计数或CAA浓度（pg/ml）时也显示出弱相关性（图2f）。

图中：此图像的替代文本可能是使用AI生成的。

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诊断方法的比较。A. 所有血吸虫病诊断方法的阳性率。B. qPCR与尿液过滤显微镜检查和UCP-LF CAA复合参考标准的灵敏度和特异性（估计值和95%置信区间）。C. 显微镜检查样本中没有卵子、卵子负荷较轻和较重的比例。D. 每种卵子负荷类别中qPCR检测到的阳性病例百分比。E. 通过三种不同测试呈阳性的个体比例的Venn图。F. qPCR与尿液过滤显微镜检查或UCP-LF CAA之间的成对相关性分析，每对相关性在散点图中用Spearman’s rho表示。

接下来，我们使用3种不同的BLCA模型规格计算了qPCR、尿液过滤显微镜检查和UCP-LF CAA的灵敏度（图3a）和特异性（图3b），以评估对先验规范和截断假设的稳健性。尽管这三种测试之间的结果相似（表S3），但在所有测试中qPCR的灵敏度最高（68.6–74.0%），其次是UCP-LF CAA（60.0–65.7%），最后是尿液过滤显微镜检查（57.1–60.7%）。对于特异性，顺序则相反（图3b）。BLCA还估计了患病率为22.5–27.1%，具体取决于使用的模型（图3c）。鉴于模型间的估计结果稳定，选择Model 2作为后续分析的模型，因为它是一个更简单的、没有截断的规范，并保留了特异性的信息性先验。为了评估我们的诊断方法中哪种最接近BLCA模型的结果，我们计算了BLCA Model 2与每种诊断方法之间的Cohen’s kappa（图3d）。在三种诊断方法中，显微镜检查与BLCA模型的吻合度最高（0.68），这可能反映了特异性对准确诊断血吸虫病的重要性。使用随机森林分类器评估模型时也体现了这一点（图S3a, b）。个别案例的分类（图S4）还显示，所有测试的连续数据可以用来区分BLCA阴性和阳性参与者。三种诊断方法的实用性也在ROC分析中得到了体现，该分析用于评估与BLCA Model 2相比的诊断方法的灵敏度和特异性（图4a，表2）。再次，qPCR、UCP-LF CAA和尿液过滤显微镜检查的性能相似（AUC 0.837–0.868）；然而，结合任何两种测试都能显著提高性能（AUC 0.908–0.931）（图4b，表2）。

图中：此图像的替代文本可能是使用AI生成的。

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使用BLCA评估诊断性能。基于显微镜检查、UCP-LF CAA和qPCR的BLCA模型使用Gibbs采样（runjags）构建。包括3种模型进行诊断评估，分别使用关于测试特异性的信息性先验（Model 1和2）或平先验（Model 3）。Model 1：包含截断。Model 2：不包含截断。Model 3：包含截断。A. 使用每种模型计算的qPCR、UCP-LF CAA和显微镜检查的灵敏度和特异性（估计值和95%置信区间）。C. 使用BLCA Model 2计算的患病率（及其95%置信区间）。D Cohen的kappa系数用于衡量每种诊断测试与BLCA结果之间的相关性。qPCR：定量聚合酶链反应；UCP-LF CAA：上转换报告颗粒侧向流循环阳极抗原；BLCA：贝叶斯潜在类别分析；CrI：可信区间。图4：此图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。

评估单个诊断方法的性能与测试组合的性能。A. 每种诊断测试与LCA结果（模型2）的ROC分析。B. 测试组合（任一测试呈阳性）与LCA结果（模型2）的ROC分析。

表2：将单独和组合诊断方法与LCA模型2进行比较，使用ROC计算得出。全尺寸表格。

最后，利用我们定义的BLCA感染状态，我们评估了血吸虫感染与其他变量（如年龄或STH或微丝蚴感染）之间的关联。总体而言，没有发现显著的协变量（图S3c），尽管在年轻女性和其他已有感染者中观察到血吸虫感染增加的趋势。

讨论

在这项研究中，我们描述了一种基于cfDNA的qPCR新方法，用于通过血浆样本诊断血吸虫病，并将其与其他测试方法（包括尿液过滤显微镜检查和UCP-LF CAA）进行了比较。鉴于缺乏100%敏感性的S. haematobium诊断参考标准，以及不同测试方法之间存在明显差异，我们采用了类似其他近期研究的贝叶斯潜在类别分析[29,30,31,32,33]。通过这项评估，cfDNA qPCR的表现与尿液过滤显微镜检查和UCP-LF CAA相当。虽然cfDNA qPCR的敏感性最高，但这也牺牲了特异性。最终，发现两种测试的组合效果更佳。鉴于学术研究中倾向于使用组合参考标准[34,35,36]，这一结果可能是可以预期的。先前的研究已经确定UCP-LF CAA和其他qPCR方法是检测S. haematobium感染的高敏感方法[14,28,36,37]，但由于技术和资源需求的原因，这两种方法的普及程度有限。在这项研究中，我们进一步改进了一种现有的通用DNA提取方法，用于提取20 μl的极少量血清或血浆中的cfDNA，并取得了优异的结果，其敏感性和特异性与尿液过滤显微镜检查和UCP-LF CAA等-established方法相当。这种方法朝着世界卫生组织（WHO）提出的使用指尖血滴进行诊断的目标努力，尽管这还需要进一步的发展。尽管使用的样本量在合理范围内[38]，但我们尚未直接测试从指尖血中提取cfDNA的方法。此外，这种方法不需要离心机，成本效益较高（每个样本约1美元），从而降低了qPCR的一些技术和经济障碍。从通常在qPCR研究中使用的500 μl–1 ml样本量中进一步减少样本量[39,40,41,42]，突显了该方法的敏感性，并有助于在现有研究中的应用。总体而言，虽然新的、敏感的、快速的、适用于现场的诊断方法仍是优先考虑的方向，但组合使用现有的诊断方法也可能是一个有效的方法。此外，改进样本处理流程可以进一步提升现有诊断方法的能力，使其更符合WHO的目标，这包括减少样本量、缩短处理时间和降低设备需求。

尽管基于PCR的S. haematobium检测方法已得到广泛评估，但只有少数研究使用血清/血浆cfDNA进行了评估。在输入性血吸虫病研究中，Guegan等人报告了一种双链血清qPCR方法的总体敏感性为72.7%，特异性为98.9%[43]。同时，在类似的研究中，Frickmann等人估计血清双链实时PCR的敏感性为94.9%，特异性为98.4%，使用了LCA[44]。在地方性血吸虫病环境中，Lorenz等人报告了马达加斯加农村地区基于血清的物种特异性cfDNA检测方法，BLCA衍生的诊断准确率估计为95.2%的敏感性和60.3%的特异性[29]。Ouédraogo等人在布基纳法索报告了S. haematobium血浆cfDNA的LCA估计，敏感性为76%，特异性为97%[45]。在本研究中，cfDNA qPCR方法的BLCA衍生敏感性估计为68.6–74.0%，特异性为89.3–91.6%，这与地方性人群中报告的血浆cfDNA性能大体一致，尽管其准确性低于某些输入性疾病的血清PCR研究结果，反映了由于研究和传播环境差异可能导致的重要差异。

还需要进一步探讨所评估的三种测试方法之间的一致性不足问题。这些差异可能部分由样本类型（尿液 vs. 血浆）、分析物（cfDNA、CAA、卵）及其潜在生物学来源（成虫、幼虫、卵）的不同所解释。然而，迫切需要一种能够不受感染阶段或样本类型限制而识别感染的测试方法，而qPCR在样本类型和感染阶段的通用性可能是一个潜在解决方案。

本研究中使用的样本来自一项关于妊娠期间血吸虫病及其他感染及其对新生儿免疫系统影响的现场研究（HelmVit研究）[46]，该研究在加蓬的Lambaréné进行。据估计，该地区的患病率约为23%[47,48]，这与我们的BLCA估计值（22.5–27.1%）相符（取决于所使用的模型）。在加蓬人群中，很少有研究评估诊断准确性，最近发表的研究包括在Lambaréné进行的一项关于Schistoscope的研究[49]，这种基于人工智能的显微镜显示出比传统尿液过滤显微镜更好的敏感性。另一项在加蓬东南部进行的研究发现，尿液PCR的敏感性为99.0%，特异性为93.3%，优于显微镜检测方法（敏感性为74.8%，特异性为93.3% [50]）。值得注意的是，这项研究使用了尿液样本进行PCR检测，尽管其敏感性很高，但仅适用于检测S. haematobium，无法满足WHO关于样本量<100 μl的要求[23]。

我们研究的另一个重要特点是聚焦于孕妇群体，尽管孕妇特别容易感染血吸虫病，但相关研究却相对较少。已有研究表明，孕妇的卵负荷较低[51]，同时也有研究指出孕妇的免疫反应受到抑制[52]，这可能影响卵的排出，因此可能需要更敏感的检测方法。此外，妊娠相关的血浆体积增加和血液稀释可能会降低循环中的寄生虫生物标志物（包括cfDNA）的浓度[53]，尤其是在低强度感染情况下。这些生理变化可能会独立于寄生虫负荷影响基于血液的诊断方法的敏感性。尽管我们的研究并未能够正式量化妊娠对诊断性能的具体影响，但这突显了使用可靠的参考框架进行孕妇与非孕妇（以及男性）之间专门比较的必要性。值得注意的是，在加蓬Lambaréné进行的freeBILy研究[54,55]，专门评估了UCP-LF CAA在孕妇中的准确性，初步发现其敏感性为69%，高于尿液qPCR、UCP-LF CAA和尿液过滤显微镜的综合参考标准（分别为59%和47% [Honkpèhedji等人手稿待发表]）。除了PCR之外，这些发现也与本研究的结果相似，进一步强调了持续优化分子方法敏感性和特异性的必要性。总体而言，妊娠期血吸虫病与孕妇贫血、低出生体重以及母婴发病率增加有关[56,57,58]。因此，采用更敏感的诊断方法可以促进早期治疗，可能有助于改善母婴健康和胎儿生长结果。

限制

本研究的主要局限性在于样本群体仅由孕妇组成，这可能限制了诊断准确性估计的普遍适用性。尽管一些先前的研究报告称标准诊断方法（如尿液过滤显微镜检查）在妊娠期间的性能下降，但同一研究也发现qPCR的性能较为稳健，表明这可能不会显著影响我们的研究结果[59]。第二个局限性是分析仅包括了具有完整匹配诊断数据的参与者，这可能会引入选择偏差。排除标准主要是基于后勤因素，包括缺失的诊断结果或不足以进行回顾性cfDNA qPCR分析的血浆体积，而不是预定义的临床或寄生虫学特征。因此，认为比较测试性能之间的显著偏差不太可能；然而，不能完全排除对患病率和敏感性估计的一些影响。另一个局限性是在没有真正金标准的情况下使用BLCA。尽管BLCA减轻了不完美参考测试的局限性，但它依赖于相同的诊断方法来推断潜在感染状态，从而引入了循环性因素。因此，敏感性和特异性估计并不能完全独立于所评估的测试，并可能受到共享信息或残余依赖性的影响，这可能会影响绝对准确性估计。此外，BLCA的结果取决于关于模型结构和先验假设的假设，虽然我们探索了多种模型配置以评估稳健性，但这些假设对敏感性估计的影响仍不能完全排除。最后，cfDNA qPCR方法仅使用了20 μl的血浆，理论上可能会低估敏感性。然而，我们的内部评估（数据未显示）并未表明性能下降，而且在本研究中观察到的出色诊断准确性进一步支持了该方法的稳健性。尽管这种简化的工作流程在当前评估中表现良好，但所使用的提取方法尚未经过正式验证用于血浆cfDNA的回收，高度碎片化的DNA的回收效果不佳也不能完全排除；进一步的cfDNA特异性验证和优化可能会提高诊断性能。此外，由于本研究中缺乏正式的内部扩增对照，因此无法完全排除PCR抑制或提取失败的情况，特别是在目标浓度较低的样本中，这可能会增加假阴性的可能性，从而低估qPCR的敏感性。

结论

在这项研究中，我们通过将基于20 μl血浆的cfDNA qPCR方法与尿液过滤显微镜检查和UCP-LF CAA（使用BLCA）进行比较，评估了其性能。通过这项评估，我们发现qPCR方法的表现稳健，与其他已建立的方法相当，且具有更高的敏感性。特别是，将高敏感性测试（UCP-LF CAA、qPCR）与高特异性测试（尿液过滤显微镜检查）结合使用，如预期的那样取得了更好的结果，但代价是增加了复杂性和资源需求。这些发现表明，进一步改进cfDNA qPCR方法的特异性，以及验证用于指尖血和其他样本（如宫颈阴道灌洗液或FGS拭子）的DNA提取和样本处理方法，可以使该方法更易于应用于分布式或POC（便携式诊断）平台。