枯草芽孢杆菌对锌毒性胁迫下番茄（Solanum lycopersicum L.）生长特性和抗氧化防御能力的改善作用：一种卓越的植物根际益生菌（PGPR）用于实现重金属抗性

《Journal of Soil Science and Plant Nutrition》：Ameliorative Effect of Bacillus subtilis on Growth Attributes and Antioxidant Defense Capacity in Tomato (Solanum lycopersicum L.) Under Zinc Toxicity: An Outstanding PGPR to Achieve Heavy Metal Resistance

　　摘要
农业土壤中重金属污染日益严重，对全球构成了严重威胁。土壤中锌（Zn）的积累会导致植物受到锌胁迫，抑制其生长和生产力。为了缓解重金属胁迫，使用促进植物生长的根瘤菌（PGPR），如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），是一个有吸引力的选择，因为它对植物生理和生化有积极影响。本研究评估了PGPR菌株B. subtilis (Bs) IMG22的潜力，该菌株被用作有益接种剂，以增强暴露于不同浓度锌毒性（0.5和5 mM）下的番茄（Solanum lycopersicum L.）植物的生长和抗逆性。结果表明，锌胁迫对番茄的生理和生化参数产生了不利影响。受锌胁迫的植物表现出生长性状下降、叶片相对含水量（RWC）降低以及光合色素含量减少。在锌胁迫下，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）的酶活性增加；蛋白质和脯氨酸的含量上升；同时，丙二醛（MDA）和过氧化氢（H2O2）的水平也升高。另一方面，与未接种的植物相比，B. subtilis IMG22的接种显著降低了氧化应激指标的水平，并显著增强了锌胁迫下植物的生长性状、光合色素含量、蛋白质含量和抗氧化酶活性。因此，研究表明B. subtilis是缓解锌诱导的重金属胁迫的理想候选菌株，因为它促进了番茄的生长，并提高了面对锌诱导的氧化应激时的抗氧化酶活性和脯氨酸含量。

图形摘要
农业土壤中重金属污染日益严重，对全球构成了严重威胁。土壤中锌（Zn）的积累会导致植物受到锌胁迫，抑制其生长和生产力。为了缓解重金属胁迫，使用促进植物生长的根瘤菌（PGPR），如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），是一个有吸引力的选择，因为它对植物生理和生化有积极影响。本研究评估了PGPR菌株B. subtilis (Bs) IMG22的潜力，该菌株被用作有益接种剂，以增强暴露于不同浓度锌毒性（0.5和5 mM）下的番茄（Solanum lycopersicum L.）植物的生长和抗逆性。结果表明，锌胁迫对番茄的生理和生化参数产生了不利影响。受锌胁迫的植物表现出生长性状下降、叶片相对含水量（RWC）降低以及光合色素含量减少。在锌胁迫下，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）的酶活性增加；蛋白质和脯氨酸的含量上升；同时，丙二醛（MDA）和过氧化氢（H2O2）的水平也升高。另一方面，与未接种的植物相比，B. subtilis IMG22的接种显著降低了氧化应激指标的水平，并显著增强了锌胁迫下植物的生长性状、光合色素含量、蛋白质含量和抗氧化酶活性。因此，研究表明B. subtilis是缓解锌诱导的重金属胁迫的理想候选菌株，因为它促进了番茄的生长，并提高了面对锌诱导的氧化应激时的抗氧化酶活性和脯氨酸含量。

1 引言
锌（Zn）是一种生物可利用性和移动性最强的金属之一，是植物正常生理过程所必需的微量营养素（Kaur等人，2024年）。锌在植物代谢中起着关键作用，它通过影响各种酶的催化部分来发挥作用。这些由锌激活的酶参与碳水化合物代谢、蛋白质合成、细胞膜完整性的维持、生长素合成的调节以及花粉的形成。此外，锌还调节和维持植物对非生物胁迫的抵抗力所需的基因表达（Hafeez等人，2013年；Barrameda-Medina等人，2014年）。锌作为一种重金属离子，在正常浓度范围内是微量元素；然而，在较高浓度下，它对植物的代谢活动具有高度毒性（Kalaivanan和Ganeshamurthy，2016年；Zajaczkowska等人，2020年）。除了其毒性作用外，低浓度下的锌也会限制植物生长。因此，作为许多植物生理过程中辅因子的锌离子的稳态必须通过将其浓度保持在一定阈值来维持（Hamzah Saleem等人，2022年）。锌浓度达到100–400 mg kg?1干重（DW）被认为是对植物有毒的阈值（Natasha等人，2022年）。锌金属毒性在植物细胞中的后果包括叶片黄化、叶片出现坏死性斑点、根系生长减缓、脂质过氧化、核酸损伤，最终导致氧化应激引起的细胞死亡（DalCorso，2012年；Angulo-Bejarano等人，2021年；Dobrikova等人，2021年）。
植物已经进化出有效调节金属稳态的机制，以应对金属离子毒性的不利影响。排除、隔离、螯合和上调抗氧化防御系统是维持金属稳态的关键机制（Angulo-Bejarano等人，2021年）。为了进一步支持暴露于重金属胁迫下的植物的生存，应用促进植物生长的根瘤菌（PGPR）是一种具有成本效益且环保的生物方法（Singh等人，2018年；Jain等人，2020年；Mushtaq等人，2020年；He等人，2024年）。多属细菌，如固氮菌属（Azotobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、阿佐斯皮里尔姆属（Azospirillum）、根瘤菌属（Rhizobium）、克雷伯菌属（Klebsiella）和沙雷菌属（Serratia），都属于被称为PGPR的有益微生物（Saini等人，2023年）。它们通过直接或间接机制促进植物的生长和发育（Parray等人，2016年；Iqbal等人，2021年）。直接机制包括固氮、养分吸收、复杂养分的溶解、铁载体物质的产生、植物激素的生物合成以及抗氧化系统的改善（de Lima等人，2019年；Chaffai等人，2024年）。诱导对病原体的系统抗性是PGPR作为生物控制剂的作用之一（Nazir等人，2018年）。枯草芽孢杆菌（Bacillus）是众所周知的PGPR中最突出的分类群之一（Patel等人，2023年）。枯草芽孢杆菌是一种革兰氏阳性、杆状、需氧细菌，具有产生多种酶和代谢产物的能力，可在胁迫条件下支持植物生长（Sagar等人，2022年）。
番茄（Solanum lycopersicum L.）是全球种植和消费最广泛的蔬菜作物之一（Singh等人，2018年）。众所周知，由于土壤中高浓度的金属（如锌），番茄的产量和生产力面临挑战。尽管已知过量锌对番茄生长和发育有负面影响，但关于使用PGPR作为生物剂来缓解这些负面影响的研究仍然有限。本研究的目的是探索枯草芽孢杆菌（Bs）在支持并刺激受锌金属胁迫的番茄植物生长方面的潜力。基于使用PGPR减轻植物重金属毒性的有害影响的研究，我们提出以下假设：（1）枯草芽孢杆菌的接种将改善受过量锌影响的生长特性和光合色素含量；（2）枯草芽孢杆菌将降低过量锌导致的高MDA和H2O2含量；（3）枯草芽孢杆菌的接种将通过增加脯氨酸含量和抗氧化酶活性（SOD、POD、CAT和APX）来提供胁迫保护；（4）因此，接种PGPR菌株Bs IMG22将减轻番茄的锌毒性。为了验证这些假设，我们检查了未接种和接种枯草芽孢杆菌的番茄植物在0.5和5 mM锌浓度下的形态生理和生化特性，包括叶片和根系的发育、氧化损伤、光合作用以及抗氧化防御能力。此外，本研究的结果为PGPR菌株Bs IMG22在农业土壤中的实际应用提供了新的视角，作为一种可持续且环保的方法，以提高在受锌污染土壤中种植的植物的抗锌毒性能力。

2 材料与方法
2.1 细菌悬浮液的制备和土壤接种
在本研究中，选择了PGPR菌株枯草芽孢杆菌IMG22进行使用。枯草芽孢杆菌在37°C下，在160 rpm的摇床中于50 mL营养肉汤培养基中培养18小时。用于细菌接种的是含有10? cfu/mL菌液的水悬浮液（Mushtaq等人，2020年）。
2.2 植物材料和实验设计
本研究中使用的实验材料是番茄（Solanum lycopersicum L.）品种“H-2274”。番茄种子首先浸泡在10%次氯酸钠溶液中表面消毒，然后用蒸馏水冲洗三次。细菌接种土壤后的第五天，将番茄种子播种在每个盆中（24.5 cm × 16 cm）。盆中使用的土壤是泥炭土。土壤的物理化学性质为：pH 5.9，含水量45%，电导率（EC）335 μS/cm，氮（N）3.07%，钾（K）1163 mg kg?1，磷（P）7.396 mg kg?1，锌（Zn）24.13 mg kg?1。实验采用完全随机设计，有三个生物学重复。实验处理如下：对照组（无细菌接种，无锌施加）、Bs（仅细菌接种；枯草芽孢杆菌）、0.5 mM Zn、0.5 mM Zn + Bs、5 mM Zn和5 mM Zn + Bs。选定的锌浓度基于污染农业土壤中的报告水平（Kaur和Garg，2021年）。施加锌（Zn）时使用了硫酸锌（ZnSO4·7H2O），并在植物播种土壤一个月后开始施用。植物在生长室（DigiTech，PG34-3）中每两天灌溉一次，条件为16/8小时光照/黑暗制度，24/20°C昼夜温度和60%湿度。经过一个月的锌处理期后，收获番茄植物。收获当天测量根部和茎部的长度（cm）以及根部和茎部的鲜重和干重（g）。
2.3 相对含水量的测定
番茄叶片的相对含水量（RWC）根据Smart和Bingham（1974年）描述的方法测定。在确定叶片的鲜重（FW）后，将其浸泡在蒸馏水中6小时以测量膨胀重量（TW）。然后在70°C下烘干后，测定干重（DW）。
2.4 光合色素含量的测定
光合色素（叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素）的含量根据Arnon（1949年）和Lichtenthaler与Buschmann（2001年）描述的方法进行测定。新鲜叶片样本（0.05 g）与80%（v/v）丙酮（15 mL）混合均匀，使用分光光度计（AgileSpec?，Metertech Inc.）在470、645和663 nm波长处读取上清液的吸光度。
2.5 氧化应激指标的评估
作为植物氧化应激引起脂质过氧化的指标，通过Cakmak和Horst（1991年）的技术，通过硫代巴比妥酸测定法分析叶片和根部的丙二醛（MDA）含量。具体步骤为：将0.25 g植物组织与0.1%（w/v）三氯乙酸（TCA）（5 mL）混合均匀，并在10,000 g下离心5分钟。随后，将上清液（500 μL）与0.5%（w/v）TBA（溶解在20%（w/v）TCA中的2 mL）反应。混合物在95°C下加热30分钟，然后在冰浴中快速冷却后，在10,000 g下离心10分钟。使用分光光度计在532 nm和600 nm波长处读取上清液的吸光度。
2.6 蛋白质含量和脯氨酸含量的测定
叶片组织中的蛋白质含量根据Bradford（1976年）的方法测定，使用牛血清白蛋白（BSA）作为标准品。提取缓冲液（2 mL）含有50 mM磷酸盐缓冲液、1 mM EDTA和1% PVP，用于匀浆0.1 g叶片组织。将组织匀浆液在+4°C下以20,000 g的离心力离心20分钟，以获得上清液，然后使用该上清液进行抗氧化酶活性测定。脯氨酸含量的测定基于Bates等人（1973年）描述的技术。0.5克的叶片组织在3%（w/v）的磺osalicylic酸（10 mL）中匀浆，然后将匀浆液以10,000 g的离心力离心15分钟。将上清液（2 mL）与酸 ninhydrin（2 mL）和冰醋酸（2 mL）在100°C的水浴中孵育1小时后，迅速在冰浴中冷却以终止反应。用甲苯（4 mL）提取反应混合物，并在分光光度计上记录吸光度值，波长为520 nm。

2.7 抗氧化酶活性的测定
超氧化物歧化酶（SOD）活性通过分析其在560 nm处抑制硝基蓝四唑（NBT）光化学还原的能力来确定，方法遵循Giannopolitis和Ries（1977年）的协议。过氧化物酶（POD）活性通过在470 nm处测定邻苯二酚的氧化程度来估算，方法基于Hammerschmidt等人（1982年）的研究。过氧化氢酶（CAT）活性通过观察240 nm处H2O2的分解来评估，采用Lima等人（2002年）的程序。抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性通过监测290 nm处的吸光度下降程度来测量，方法由Nakano和Asada（1981年）首次定义。

2.8 统计分析
实验在生物学上重复三次，数据经过方差分析（ANOVA），然后在GraphPad程序（GraphPad Prism 9）中进行了Tukey多重比较测试。数值为平均值±标准差（SD），处理之间的差异在p<0.05的水平上被认为是统计学上显著的。统计学上显著的值用不同的字母表示，标准差（SD）用“±”符号表示。

3 结果
3.1 短杆菌（B. subtilis）和锌胁迫对番茄生长特性和相对含水量的影响
锌胁迫对番茄植株有显著毒性作用；因此，在0.5 mM和5 mM的锌浓度下，番茄的生长受到显著限制。与对照组相比，处于0.5 mM和5 mM锌胁迫下的植株的茎长分别减少了6.1%和11.9%。在无胁迫条件下，短杆菌处理使茎长显著增加了13.4%。此外，在0.5 mM锌胁迫下，短杆菌接种使茎长增加了13.6%，在5 mM锌胁迫下增加了12.2%，相比于未接种的植株。同样，在两种锌浓度下，锌胁迫导致根长分别急剧减少了29.1%和39.2%。与未接种的植株相比，短杆菌接种在两种锌浓度下均提高了根长（分别为31.3%和49.6%）（表1）。

表1 短杆菌接种对锌胁迫下番茄植株茎和根参数的影响
随着锌浓度的增加，茎的鲜重分别减少了30.5%和39.4%，与对照组相比。另一方面，未受任何胁迫处理的接种了短杆菌的植株的茎鲜重（12.7%）高于对照组。在5 mM锌胁迫下，短杆菌接种还显著增加了茎的鲜重，比仅暴露于5 mM锌胁迫的植株高出26.4%。尽管在两种锌浓度下，暴露于锌的植株的茎干重均有所下降（分别为24%和33.1%），但接种了短杆菌的组与未接种的组之间没有显著差异（表1）。
在两种锌浓度下，根的鲜重均显著减少（分别为70.7%和85.2%，与对照组相比）。然而，接种了短杆菌的植株的根鲜重高于相同胁迫水平下的未接种植株。此外，两种锌浓度下根的干重分别减少了39.3%和51.7%，与对照组相比。此外，未受胁迫且接种了短杆菌的植株的根干重高于对照组（分别为47.1%和49.6%）。接种了短杆菌的植株在锌胁迫下的根干重与未接种的胁迫植株没有显著差异，但呈现增加趋势（表1）。
虽然0.5 mM锌胁迫没有改变相对含水量，但5 mM锌胁迫显著降低了它。然而，与相同胁迫水平的未接种植株相比，短杆菌接种导致相对含水量升高（图1）。

图1 短杆菌接种对锌胁迫下番茄叶片相对含水量（RWC）的影响。数值为平均值（n=3）±标准差（SD）。条形图上的不同字母表示根据Tukey多重比较测试处理均值之间的显著差异（p<0.05）。

3.2 短杆菌和锌胁迫对光合色素含量的影响
两种锌浓度均降低了叶绿素a（分别减少了38.6%和42%）、叶绿素b（分别减少了33.7%和38%）、总叶绿素（分别减少了36.9%和40.4%）和类胡萝卜素（分别减少了37.7%和39%）的含量。另一方面，在0.5 mM锌浓度下接种短杆菌的植株在光合色素含量方面表现出相当不错的结果。与相同锌浓度下的未接种植株相比，接种了短杆菌的植株的光合色素含量更高，包括叶绿素a（58.1%）、叶绿素b（24.6%）、总叶绿素（43.4%）和类胡萝卜素（51.9%）。此外，在5 mM锌浓度下，短杆菌接种显著增加了叶绿素a的含量（28.3%），而在叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素含量上没有显著变化（图2A-D）。

图2 短杆菌接种对锌胁迫下光合色素的影响，包括叶绿素a（A）、叶绿素b（B）、总叶绿素（C）和类胡萝卜素（D）。数值为平均值（n=3）±标准差（SD）。条形图上的不同字母表示根据Tukey多重比较测试处理均值之间的显著差异（p<0.05）。

3.3 短杆菌和锌胁迫对氧化应激指标的影响
通过检测内源性过氧化氢（H2O2）和丙二醛（MDA）含量的变化，可以发现锌胁迫对番茄植株造成的氧化损伤。MDA含量反映了由于ROS积累导致的植物膜脂质过氧化的程度。在0.5 mM和5 mM锌处理下，叶片MDA含量分别比对照组增加了41.4%和71.4%。另一方面，在0.5 mM锌浓度下，短杆菌接种使叶片MDA含量减少了20%；在5 mM锌浓度下减少了19.2%（图3A）。在根部，对照组和0.5 mM锌胁迫下的MDA含量没有变化，但在5 mM锌胁迫下增加了87.3%。然而，在5 mM锌胁迫下，短杆菌接种使根部MDA含量减少了24.1%（图3B）。
图3 短杆菌接种和锌胁迫对氧化应激指标的影响，包括叶片MDA（A）、根部MDA（B）、叶片H2O2（C）和根部H2O2（D）。数值为平均值（n=3）±标准差（SD）。条形图上的不同字母表示根据Tukey多重比较测试处理均值之间的显著差异（p<0.05）。
锌胁迫和短杆菌接种引起的叶片H2O2含量的变化与叶片MDA含量的变化非常相似。与对照组相比，两种锌浓度均使叶片H2O2含量分别增加了100.9%和314.3%，且随着锌浓度的升高，这种增加更为明显。在两种锌浓度下，短杆菌接种使叶片H2O2含量分别减少了45.9%和41.4%，与未接种的植株相比（图3C）。同样，暴露于0.5 mM和5 mM锌的植株使根部H2O2含量分别增加了117.1%和127.9%，与对照组相比。在0.5 mM锌浓度下，接种了短杆菌的植株的根部H2O2含量比未接种的植株低25.4%；在5 mM锌浓度下低32.7%（图3D）。

3.4 短杆菌和锌胁迫对蛋白质量和脯氨酸含量的影响
暴露于0.5 mM和5 mM锌浓度的植株的总蛋白质含量高于对照组。在0.5 mM锌浓度下，总蛋白质含量的增加（97.2%）比在5 mM锌浓度下的增加（55.9%）更为显著。在0.5 mM锌浓度下，短杆菌接种进一步增加了总蛋白质含量（21.1%），相比于相同锌浓度下的未接种植株。此外，虽然在5 mM锌胁迫下，接种了短杆菌的植株与未接种的植株之间的总蛋白质含量没有显著差异，但接种了短杆菌的植株显示出增加趋势（图4A）。

图4 短杆菌接种对锌胁迫下番茄叶片中蛋白质量（A）和脯氨酸含量（B）的影响。数值为平均值（n=3）±标准差（SD）。条形图上的不同字母表示根据Tukey多重比较测试处理均值之间的显著差异（p<0.05）。
与对照组相比，两种锌浓度均显著增加了脯氨酸含量，分别增加了28.2%和18.5%。除此之外，短杆菌接种进一步增强了0.5 mM和5 mM锌浓度下已经升高的脯氨酸含量（图4B）。

3.5 短杆菌和锌胁迫对抗氧化酶活性的影响
在锌胁迫下，研究了短杆菌对SOD、POD、CAT和APX活性的影响，这些酶是植物抗氧化防御系统的主要组成部分。与对照组相比，两种锌浓度均显著增加了SOD活性，分别增加了33.9%和47.7%。此外，在0.5 mM锌浓度下，短杆菌接种使SOD活性增加了28.5%；在5 mM锌浓度下增加了40.3%（图5A）。
图5 短杆菌接种和锌胁迫对番茄叶片抗氧化酶活性的影响，包括SOD（A）、POD（B）、CAT（C）和APX（D）。数值为平均值（n=3）±标准差（SD）。条形图上的不同字母表示根据Tukey多重比较测试处理均值之间的显著差异（p<0.05）。
与SOD活性类似，0.5 mM和5 mM锌浓度分别使POD活性增加了98.7%和76.9%。此外，在两种锌浓度下接种了短杆菌的组比未接种的组具有更高的POD活性（分别为35.4%和24.3%）（图5B）。
随着锌浓度的增加，CAT活性显著增加了100%和326.7%。在无胁迫条件下，短杆菌接种也使CAT活性增加了73.4%。同样，在两种锌浓度下，短杆菌接种进一步使CAT活性分别增加了46.7%和26.6%，与相同锌浓度下的未接种植株相比（图5C）。
在0.5 mM锌浓度下，APX活性没有显著变化；而在5 mM锌胁迫下，APX活性显著增加了98.2%。未受胁迫且接种了短杆菌的植株的APX活性也高于对照组（66.8%）。此外，在0.5 mM锌胁迫下，短杆菌接种使APX活性增加了141.4%；在5 mM锌胁迫下增加了50.7%，与未接种的植株相比（图5D）。

4 讨论
促进植物生长的根际细菌（PGPR）是一类能够在各种恶劣环境条件下增强植物生长的根际细菌（Kumar等人，2019年）。由于锌污染的土壤对植物的有害影响，用PGPR接种这些土壤可以促进植物生长并减轻锌的毒性作用（Islam等人，2014年；Jain等人，2020年）。众所周知，锌的毒性会阻碍植物的生长和发育（Ramakrishna和Rao，2015年；Zajaczkowska等人，2020年）。在我们的研究中，0.5 mM和5 mM的锌金属胁迫表现出抑制茎和根生长的毒性症状，并对番茄生长产生了负面影响。锌的毒性主要与根部生理变化有关。在锌毒性作用下，根部增厚、根端钝化以及根细胞分裂和伸长的限制导致根生长受阻（Rout和Das，2009年）。我们的结果也支持这一点，表明锌浓度的增加会抑制根的伸长。此外，过量的锌（Zn）胁迫会导致番茄叶片出现紫红色，这种现象与锌胁迫引起的磷缺乏有关（Emamverdian等人，2015年）。然而，如前所述，植物促生长根际细菌（PGPR）可以通过诱导根系伸长、调节内源性植物激素水平以及增强矿物质和水分吸收，在恶劣的环境条件下促进植物的生长和发育（He等人，2024年）。在本研究中，接种PGPR菌株B. subtilis IMG22提高了番茄在锌毒性作用下的生长表现。先前的研究也得到了类似的结论，证明了PGPR能够改善植物在多种非生物胁迫条件下的生长受阻情况，例如重金属（El-Meihy等人，2019年）、干旱（Begum等人，2022年）和盐碱化（Sapre等人，2022年）。过量的锌还会影响植物的水分关系，降低植物组织的相对含水量（RWC），从而减缓蒸腾速率。此外，由于锌在地上部分的过度积累，还会导致严重的脱水现象，即生理性干旱（Kaur和Garg，2021年）。与之前的研究结果一致（Sood等人，2020年；Li等人，2023年），我们的研究表明5 mM的锌胁迫会降低番茄的RWC。叶片RWC的下降可能是由于根系吸收表面的减少，或者是由于木质部导管堵塞导致的水分运输过程受阻。随着水分含量的降低，细胞膨胀能力下降，进而抑制了植物的生长（Kaur和Garg，2021年）。另一方面，正如之前关于玉米（Ali等人，2022年）和萝卜（Ahmad等人，2025年）的研究所显示的那样，我们的研究表明B. subtilis接种提高了番茄在两种锌浓度下的RWC，甚至超过了对照组水平。因此可以推断，B. subtilis IMG22可能通过刺激根系伸长来增强番茄的水分吸收。

为了捕捉光能——光合作用中将太阳能转化为化学能的关键步骤——植物具有两种类型的光合色素：叶绿素（Chl）和类胡萝卜素（Car）（Rai等人，2016年）。因此，如果这些吸收光线的色素受损，光合作用将直接受到影响。由于锌等二价金属取代了叶绿素结构中的镁（Mg2+），植物中的叶绿素含量会下降。由于锌取代后的叶绿素释放电子的能力较低，光合电子传递链以及整个光合作用机制可能会受到干扰（Souri等人，2019年）。此外，过量的锌还会降低光系统II（PSII）的效率，并通过降低RuBisCO（核糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶）的活性来阻碍二氧化碳的固定（Mousavi等人，2013年；Ghori等人，2019年）。与之前关于棉花（Anwaar等人，2015年）、水稻和玉米（Janeeshma等人，2021年）以及白芥菜（Repkina等人，2023年）的研究结果一致，本研究表明锌胁迫下番茄的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素含量均有所下降。然而，B. subtilis IMG22的接种改善了锌胁迫下受干扰的光合色素含量，这种效果在0.5 mM锌浓度下尤为明显。与我们的发现类似，Yasmin等人（2020年）报告称B. subtilis SRM-3和Pseudomonas pseudoalcaligenes SRM-16的接种在盐碱胁迫下提高了大豆中的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量。Desoky等人（2020年）也指出，在铅和镉胁迫下，B. subtilis的接种增加了菠菜中的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量、净光合速率、蒸腾速率和气孔导度。

铁（Fe）之后，锌是生物体内第二常见的过渡金属，参与大多数酶的功能（Broadley等人，2007年）。锌通过与膜蛋白的磷脂和巯基团相互作用，保持细胞膜的完整性和大分子的结构（Tsonev和Cebola Lidon，2012年）。尽管锌具有有益的作用，但其毒性浓度会增加植物中活性氧（ROS）的产生。MDA是在ROS攻击引发的脂质过氧化过程中产生的，它是细胞内氧化损伤程度的标志物（Anjum等人，2015年）。在本研究中，锌的毒性通过增加MDA和H2O2的含量导致了氧化损伤，这些发现得到了Goodarzi等人（2020年）和Dobrikova等人（2021年）的研究支持。另一方面，PGPR可以通过增强ROS解毒酶的活性来减轻非生物胁迫引起的氧化损伤（Nivetha等人，2021年）。我们的研究表明，B. subtilis IMG22的接种在0.5和5 mM锌胁迫下降低了MDA和H2O2的含量。Patel等人（2023年）也指出，B. subtilis ER-08的接种在盐和干旱胁迫下降低了葫芦中的MDA和H2O2含量。Maslennikova等人（2023年）还记录了B. subtilis 10?4在镉胁迫下降低了小麦中的电解质泄漏、MDA和H2O2含量。

重金属（如锌）引起的胁迫通常会减少植物中的蛋白质含量（Ramakrishna和Rao，2012年），同时通过提高蛋白酶和RN酶等水解酶的活性触发分解代谢反应。暴露于高浓度的锌会破坏植物的蛋白质合成机制，进一步减少蛋白质合成所需的氨基酸，最终导致蛋白质水平下降（Sidhu，2016年）。然而，在本研究中，0.5和5 mM的锌胁迫反而增加了总蛋白质含量。为了应对重金属胁迫，植物常用的策略是合成膜转运蛋白和含硫醇的螯合化合物（Hossain和Komatsu，2013年）。这包括增加分子伴侣蛋白、植酸螯合蛋白和金属硫蛋白的丰度，以及合成有效的ROS清除防御蛋白（Hasan等人，2017年；Sevgi和Leblebici，2025年）。因此，为了抵御重金属胁迫，植物通过合成这些应激响应蛋白来提高内源性蛋白质水平（Anjum等人，2015年）。此外，在我们的研究中，PGPR菌株B. subtilis IMG22的接种在锌胁迫下进一步增加了总蛋白质含量。同样，Ilyas等人（2022年）指出B. subtilis接种在铬胁迫下提高了小麦中的蛋白质含量。Sahile等人（2021年）也报告称，Bacillus cereus的接种在镉胁迫下提高了大豆中的总蛋白质含量。这些结果表明，PGPR可能通过增强应激响应蛋白来帮助植物应对重金属胁迫的影响。

脯氨酸是一种水溶性氨基酸，在受到干旱、高温、低温和重金属等非生物胁迫的植物组织中积累（Siddique等人，2018年）。作为植物中最常见的化合物之一，脯氨酸既是一种优良的渗透调节剂，也是一种抗氧化防御分子，可以清除ROS（Kaur和Asthir，2015年）。此外，它还作为一种分子伴侣蛋白，稳定蛋白质结构并保持其完整性，并作为金属螯合剂，通过与金属形成无毒的金属-脯氨酸复合物来螯合重金属（Ghosh等人，2022年）。与Khan等人（2019年）和Badiaa等人（2020年）的研究结果一致，本研究表明0.5和5 mM的锌浓度增加了脯氨酸含量。此外，PGPR菌株B. subtilis IMG22的接种在锌胁迫下进一步提高了脯氨酸含量。还有研究表明，PGPR接种在镉（Shah等人，2020年）和铬（Akhtar等人，2021年）胁迫下也提高了植物中的脯氨酸含量。因此，PGPR可能通过积累脯氨酸等渗透调节物质来帮助植物在重金属污染的土壤中生长。值得注意的是，PGPR还可以通过分泌铁载体来缓解重金属胁迫。铁载体是低分子量的螯合剂，可以与多种重金属（包括Cd、Fe、Pb和Zn）形成复合物（He等人，2024年）。

在植物中，重金属通过触发过量的ROS产生来损害细胞生物分子。植物利用SOD、POD、CAT和APX等多种抗氧化酶在细胞和亚细胞水平上发挥作用，以对抗这些损害细胞新陈代谢、性能和活力的胁迫因素（Maleki等人，2017年）。植物对重金属胁迫的适应性与抗氧化酶（如SOD、POD、CAT和APX）活性的增强以及较高的脯氨酸水平有关。与dos Santos等人（2020年）和Du等人（2020年）的研究结果一致，我们的研究表明过量的锌增强了SOD、POD、CAT和APX的活性。此外，我们的研究还发现B. subtilis IMG22的接种进一步增强了过量锌引起的SOD、POD和APX的活性。Mushtaq等人（2020年）也指出，B. subtilis S4在砷胁迫下提高了南瓜中的SOD、CAT和APX活性。Fatima等人（2025年）还记录了B. subtilis IAGS174在盐和铅胁迫下的向日葵中提高了SOD、POD和CAT的活性。因此可以推断，B. subtilis激活了植物的抗氧化防御系统，包括SOD、POD、CAT和APX，以对抗重金属胁迫。

综上所述，这些研究机制——更高的光合色素含量、较少的膜脂质损伤以及增强的抗氧化酶活性和脯氨酸含量——解释了接种B. subtilis IMG22的番茄植株在锌胁迫下的生长表现和抗逆性增强。这些发现突显了B. subtilis IMG22作为生物接种剂在减轻锌毒性方面的有效性。

**5 结论**
本研究显示，锌（Zn）胁迫对番茄植株的生长和生化特性具有毒性作用。然而，植物与细菌的相互作用显著促进了植物生长并帮助其克服了恶劣的环境条件。Bacillus subtilis IMG22的接种通过提高光合色素含量、脯氨酸含量和抗氧化酶活性，以及降低过氧化氢（H2O2）和丙二醛（MDA）的水平，调节了番茄植株的基本生态生理和生化过程。总之，本研究的结果表明，Bacillus subtilis IMG22作为一种经济高效且环保的方法，具有很大的潜力，可以促进番茄生长并减轻锌毒性的负面影响。植物促生长根际细菌（PGPR）作为化学肥料的替代品，可能是下一次绿色革命的先驱，但这些细菌对土壤微生物群结构的长期影响仍需仔细评估。我们的研究提供了关于Bacillus subtilis接种如何在生理和生化层面上减轻番茄锌毒性的宝贵知识。然而，未来的研究应进一步探讨其对分子途径和土壤微生物群的影响，以阐明其在促进植物生长和减少锌毒性方面的潜在益处。