本土接种剂减轻了重金属污染土壤修复对丛枝菌根真菌群落的影响

《Mycorrhiza》：Indigenous inoculant dampens the impact of remediation of heavy metal polluted soil on arbuscular mycorrhizal fungal communities

　　摘要
肥沃土壤这种有限资源需要数千年时间才能形成。不可降解的有毒金属（重金属）由于在环境中的持久存在，对健康构成了重大威胁。使用EDTA（乙二胺四乙酸）清洗土壤已被证明可以去除有毒金属（如铅、锌、镉），但这一过程也会对土壤微生物多样性产生显著影响。在本研究中，我们利用分子生物学方法（18S rRNA扩增子测序）研究了使用EDTA进行土壤修复处理后，多年生黑麦草（Lolium perenne）根部丛枝菌根（AM）真菌群落的发展情况。实验在两种类型的土壤（石灰质和酸性土壤）上进行，包括修复后的土壤和未修复的受污染土壤，并考虑了是否添加本地环境接种剂（草原土壤和根系）。添加接种剂增加了AM真菌的丰富度和均匀性，减少了修复土壤与未修复土壤之间群落组成的差异。修复过程和接种带来的干扰导致优势菌类群落的身份发生变化，反映出不同菌类之间的特征差异。这提示了修复土壤中群落发展的两个主要机制：优先效应和优势菌类之间的竞争排斥。这些发现强调了基于自然解决方案（本地环境接种剂）和AM真菌在可持续土壤管理实践中的重要性，尤其是在遭受多重干扰的场地（包括受污染场地、土壤修复区域以及传统农业系统和城市土壤）中恢复土壤生物多样性的过程中尤为重要。

引言
肥沃土壤是一种有限且宝贵的资源，其形成过程极为缓慢，需要数千年时间。被不可降解的有毒金属（重金属）污染的土壤由于这些金属在环境中的持久性而成为严重问题（Amundson等人，2015年）。这些受污染的土壤通常变得不再适合其原本用途，对人类和环境健康构成严重威胁（Hartley和Lepp，2008年）。包括斯洛文尼亚在内的许多国家都有因20世纪工业活动而受到重金属污染的耕地（欧洲环境署，2020年；粮农组织，2021年）。在斯洛文尼亚，梅扎谷地（Meza Valley）受到铅（Pb）、锌（Zn）和镉（Cd）的污染，面积约50平方公里，其中包含一个已关闭的铅矿和冶炼工业设施。独特的地形加上五个世纪的矿物开采排放导致该地区土壤广泛污染（Finzgar等人，2014年）。尽管存在重金属污染，城乡地区仍在进行园艺和粮食种植等活动，使脆弱人群（特别是儿童）面临严重的健康风险（Jez和Lestan，2015年）。本研究专注于两种类型受铅、镉和锌污染的土壤（石灰质和酸性土壤），以评估基于EDTA的修复技术对土壤微生物群落的影响。具体来说，我们关注植物共生的丛枝菌根（AM）真菌，并跟踪其在修复土壤中的群落发展情况。

土壤生物多样性在维持土壤健康和调节土壤功能方面起着关键作用（Delgado-Baquerizo等人，2016年；Griffiths和Philippot，2013年）。特别是土壤真菌由于其丝状结构，容易受到机械和化学干扰的影响，其群落常受到如土壤耕作等活动的损害（Helgason等人，1998年；Oehl等人，2010年）。古老的丛枝菌根真菌群（Glomeromycotina/Glomeromycota）（Spatafora等人，2016年；Tederoo等人，2018年）与超过70%的植物物种形成共生关系（Brundrett和Tederoo，2018年），包括作物和果树，在可耕作土壤中具有重要意义，因为它们在可持续粮食生产和农业中具有潜在作用。这种共生关系带来的好处，如改善养分和水分吸收以及保护植物免受病原体侵害，取决于AM真菌与其宿主植物之间的具体相互作用，因为AM真菌共生体的身份和多样性对菌根系统的功能有显著影响（Bla?ková等人，2021年）。

使用EDTA（乙二胺四乙酸）这种螯合剂清洗土壤已被证明能有效去除受污染土壤中的有毒金属（Pb、Zn、Cd）（例如Finzgar和Lestan，2007年；Pociecha和Lestan，2012年；Voglar和Lestan，2013年），但这一过程也会对土壤微生物活动产生显著影响（Jelusic和Lestan，2014年；Suhadolc等人，2026年），尤其是对真菌群落（Ma?ek等人，2016年、2022年；Kaurin等人，2021年）。研究表明，EDTA清洗对共生AM真菌有负面影响，会长期影响它们在植物根部的定殖（Kaurin等人，2021年；Ma?ek等人，2022年）。然而，在户外花园中也有证据表明修复土壤中的AM真菌群落有可能恢复（Kaurin等人，2021年；Ma?ek等人，2022年）。在一项针对菜园的研究中，研究人员検查了用EDTA处理过的土壤对各种酶和微生物指标的影响，包括AM真菌在根部的定殖情况（Kaurin等人，2021年）。虽然传统的园艺方法成功恢复了处理过的土壤的生物功能，但对共生AM真菌的影响最为显著且持久。根据总真菌群落的丰度（针对ITS基因的qPCR检测）和AM真菌在根部的定殖情况，我们也证明了修复土壤中真菌群落的恢复潜力，显示了植物存在的重要性（Ma?ek等人，2022年）。尽管上述研究中发现真菌在根部的定殖有所恢复，但目前仍缺乏关于处理系统中AM真菌群落组成和多样性的数据。同时，也缺乏关于针对不同土壤类型定制的特定修复技术或使用不同接种剂以加速菌根形成的影响的数据。鉴于最近的研究发现，许多商业AM真菌接种剂效率低下、质量控制不足、可能含有病原体，并对本地AM真菌群落和作物生长产生负面影响（例如Hart等人，2018年；Vahter等人，2023年；Koziol等人，2024年），这一点尤为重要。

在这里，我们迈出了理解修复土壤中AM真菌群落恢复的重要一步，提出了可以改善这一过程的措施（例如使用本地接种剂），并强调了AM真菌在可持续土壤管理和利用基于自然的解决方案恢复土壤多样性中的重要性。在研究中，我们使用土壤中试生态系统来观察在两种类型土壤（石灰质和酸性土壤）上生长的多年生黑麦草根系中的AM真菌群落的多样性和发展情况，这些土壤分别在未修复和修复后进行了EDTA清洗处理，并考虑了是否添加本地环境（本地）接种剂（草原根际土壤和根系）。我们测试以下假设：
(H1) EDTA清洗（修复）和接种以不同方式影响不同类型土壤中的AM真菌群落组成，在添加接种剂后修复后的群落组成效应较低。
(H2) 修复减少了AM真菌的多样性，而土壤接种增加了所有修复和受污染土壤中的多样性，并且随着时间的推移多样性逐渐增加。
(H3) 修复过程和接种导致优势菌类身份发生变化，反映出研究土壤中AM真菌之间的不同特征。

材料与方法
**实验设置和土壤修复**
用于中试实验的土壤采自斯洛文尼亚梅日卡（Me?ica）的一个菜园（SI - 石灰质土壤）和奥地利阿诺尔丁斯坦（Arnoldstein）的一个农田（AT - 酸性土壤）的表层30厘米土壤。修复前的Pb、Cd和Zn含量（表S1）在SI土壤中较高，分别为1131.2 ± 27.12 mg kg^-1 Pb、6.74 ± 0.08 mg kg^-1 Cd和755.97 ± 14.75 mg kg^-1 Zn（平均值±标准误差），而AT土壤分别为756.04 ± 12.09 mg kg^-1 Pb、4.28 ± 0.07 mg kg^-1 Cd和452.95 ± 7.06 mg kg^-1 Zn。由于pH值是影响土壤中金属可利用性的最重要参数，因此选择了pH中性（SI）和酸性（AT）土壤（pH分别为6.9和5.0）。

两个地点的土壤中有一半使用Lestan（2017年）和Gluhar等人（2021年）描述的基于EDTA的技术进行修复；AT土壤使用60 mM Ca-EDTA/kg，SI土壤使用100 mM Ca-EDTA/kg（修复后的土壤），另一半未经处理（未修复的土壤）。修复后的Pb、Cd和Zn含量（表S1）在SI土壤中仍然较高，分别为479.54 ± 13.86 mg kg^-1 Pb、3.07 ± 0.15 mg kg^-1 Cd和513.64 ± 20.84 mg kg^-1 Zn（平均值±标准误差），而AT土壤分别为202.72 ± 1.25 mg kg^-1 Pb、0.83 ± 0.06 mg kg^-1 Cd和262.08 ± 2.22 mg kg^-1 Zn。未经处理和修复的土壤于2016年6月23日放置在35升的中试生态系统中（共32个生态系统；直径24厘米，高度42厘米），底部铺设5厘米厚的石英砂（1-3毫米），并用0.2毫米的塑料网覆盖。

实验中根据两个因素考察了受污染的石灰质和酸性土壤：第一个因素是修复程度（未修复和修复）。第二个因素是接种剂（未受污染的半自然草原根际土壤含植物根系）：无接种剂或接种剂存在。每种处理在四个中试生态系统中重复进行（n=4）。

**中试生态系统中的植物种植**
2016年7月11日，在每个中试生态系统中种植了70毫升经过消毒（10%漂白剂处理2分钟）的多年生黑麦草（Lolium perenne L.）种子。我们向16个处理组的中试生态系统添加了环境接种剂（根际土壤和根系），以研究其对土壤微生物群落的影响（每个处理组中添加100毫升接种剂）。根际接种剂来自斯洛文尼亚卢布尔雅那（Ljubljana）的未受污染半自然草原，仅混入中试生态系统顶部5厘米的土壤层中。

**土壤和植物采样**
在中试生态系统实验开始时（2016年6月），在将土壤放入生态系统之前采集了土壤样本。在植物种子和接种剂加入中试生态系统四个月后（2016年11月2日），采集植物样品以测量重金属含量（表S2）。土壤样品在40°C下干燥24小时，然后通过2毫米筛子筛选以去除根和石头。筛选后的土壤用于化学物理分析和重金属含量测量。植物生物质样品从中试生态系统收集，均匀处理后，在40°C下干燥24小时（表S3）。

**植物根系采样**
2016年8月2日、11月3日（2016年）、6月6日、11月18日（2017年）以及2018年4月5日和6月4日采集了植物根系样本，以检测AM真菌的定殖情况。此外，还从接种剂中采集了三个根系样本。从每个中试生态系统中取3×15厘米的土壤芯样，用自来水清洗后，在70°C下干燥，随后室温储存。关于植物根系丛枝菌（AM真菌）定植的结果可以在Ma?ek等人（2022年）的研究中找到。

### 土壤分析
对于土壤分析，样品经过风干后筛分成2毫米颗粒大小（ISO11464, 2006）。总金属含量（铅、镉和锌）通过电感耦合等离子体质谱法（ICP-ES/MS）测定，样品需先在王水中消化（Bureau Veritas Mineral实验室，加拿大）。土壤有机碳（SOC）和总氮（TN）通过干燃烧法测定（ISO 10694, 1996；ISO 13878 1995），使用的是Elementar vario MAX分析仪（德国）。碳酸盐的含量通过土壤与盐酸反应后用压力法测定（ISO 10693 1996），土壤质地则采用移液管法测定（ISO 11277, 2009）。土壤pH值是在1/2.5（重量/体积）的土壤与0.01 M CaCl2悬浮液比例下测定的（ISO 10390 2005）。

### 丛枝菌群落评估的分子方法
为了量化丛枝菌群落，使用Retsch搅拌器将混合的植物根系进行均质化处理。从均质化根系的50毫克干样本中提取DNA，使用DNeasy Plant Pro DNA分离试剂盒（Qiagen），按照制造商的说明进行操作。丛枝菌群落的量化是通过Illumina MiSeq NGS技术对SSU（小亚基）rRNA基因的扩增子进行测序实现的，该基因是研究丛枝菌多样性的常用标记基因（Cotton等人2014；Davison等人2015；Dumbrell等人2010a；Ma?ek等人2011）。

为了生成Illumina MiSeq NGS所需的扩增子文库，首先使用AppTaq RedMix（2X）（Appleton Scientific）、通用真核生物引物NS31（Simon等人1992）和引物AM1（该引物可排除植物、扩增主要丛枝菌科，并确保无可检测的PCR偏差，Cotton等人2014）通过PCR扩增SSU rRNA基因的550-bp片段。正向和反向引物经过修改，包含Illumina特有的接头序列（Sigma）。PCR反应体积为25微升，包括1微升DNA模板、12.5微升AppTaq RedMix（2X）、0.05微升T4 Gene 32蛋白（Invitrogen）以及每条引物2微摩尔（PCR条件：95°C加热3分钟；95°C循环30次，每次15秒；64°C循环15秒；72°C循环15秒；最后72°C加热10分钟），使用Applied Biosystems Veriti Thermal Cycler（Thermo Fisher Scientific）进行。PCR产物使用Agencourt AMPure XP磁珠纯化（Beckman Coulter）。随后进行二次PCR，使用Nextera XT Index Kit（Illumina）和Illumina推荐的协议附加Illumina测序接头和多重索引。二次PCR产物同样使用Agencourt AMPure XP磁珠纯化（Beckman Coulter），然后通过FLUOstar Omega Microplate Reader（BMG Labtech）上的PicoGreen Assay进行定量。159个成功扩增的样本以等摩尔浓度混合后，在英国埃塞克斯大学的Illumina MiSeq仪器上使用V3 2×300 bp配对末端化学方法进行测序。

### 生物信息学
首先，我们使用cutadapt 4.4（Martin 2011）从序列中去除引物，丢弃那些引物序列有错配的序列。接着使用fastp v 0.21.0（Chen 2023）对正向和反向序列进行质量过滤、修剪，并进行配对末端比对。过滤掉读长超过20%低于Q20的序列，并采用“滑动窗口”方法进行修剪，从5'端向3'端移动，只保留修剪后长度超过200个核苷酸的序列。通过质量过滤和修剪步骤后的序列进行配对末端比对，最小检测重叠长度为15个碱基对。我们使用Bash函数实现了一个额外的重叠长度过滤，以保留长度在500到527个核苷酸之间的序列。然后使用VSEARCH v 2.7.1（Rognes等人2016）合并所有样本的序列并去除重复序列。剩余序列使用VSEARCH在97%相似度下聚类为OTUs。由于在SSU序列上应用扩增子序列变异方法存在多个问题（参见Kauserud 2023），我们采用了基于OTU的方法。中心序列使用VSEARCH中的‘uchime3’算法进行嵌合体检查，然后将序列映射到97%相似度的剩余中心点上以创建OTU表。通过将分类信息与SILVA nr数据库（v132）进行比对，移除了非丛枝菌的OTUs，仅保留鉴定为球囊菌门的OTUs。为了更精细地分配分类信息，我们使用BLAST（Altschul等人1990）将OTU中心序列与MaarjAM数据库（Opik等人，2010）进行比对，为每个OTU分配一个虚拟分类单元（VT）标识符。

### 数据分析
OTU表被导入R（版本4.40；R核心团队，2024）中，并随机降采样至每个样本1,152个序列，丢弃序列数量较少的样本（n = 14）。然后使用Hill R包中的函数计算每个样本的alpha多样性，表现为OTU丰富度和均匀度（Simpson指数的倒数）。使用MASS和lme4包（Venables和Ripley 2002；Bates等人2015）的负二项广义线性模型或线性混合效应模型，量化研究过程中以及不同处理之间的群落丰富度和均匀度的变化。使用betapart R包中的Sorensen指数量化成对beta多样性，并通过NMDS分析进行可视化。使用PERMANOVA（adonis2）和vegan R包中的permutational homogeneity of variances测试（betadisper）分析实验处理之间beta多样性的位置和分散效应。使用data.table函数计算等级-丰度曲线。所有数据可视化都是使用ggplot2和patchwork R包（Wickham 2016；Pedersen, 2024）构建的。

我们分析了3,061,284个序列，这些序列来自最初的201个样本，总共有3,276,857个原始序列，其中不符合质量控制标准的序列被剔除，且序列数量少于1,152的样本也被移除（更多细节见方法部分）。剩余序列共包含55个OTUs（GenBank访问号BioProject ID PRJNA1347864），其中36个被鉴定为球囊菌门。稀释曲线（图S4）显示，经过降采样后，社区得到充分测序，能够捕捉到大部分丛枝菌的多样性。这些OTUs被分配到33个独特的MaarjAM虚拟分类单元（VT），最小识别相似度为94.6%（第一四分位数=98.1，中位数=99%，第三四分位数=99.4%）。

#### 丛枝菌群落组成
在受污染的土壤（酸性和石灰质土壤）中，无论是修复处理还是接种处理，丛枝菌群落组成都有显著差异。在酸性土壤中，修复处理对群落组成有较大影响，解释了32%的组成变异（PERMANOVA；F1, 73 = 41.16，R2 = 0.32，P < 0.001），而接种剂的添加进一步解释了8%的变异（F1, 73 = 10.64，R2 = 0.08，P < 0.001），修复处理和接种剂添加的交互作用解释了较少的变异（F1, 73 = 5.67，R2 = 0.04，P < 0.01）。相比之下，在石灰质土壤中，接种剂的添加对组成的影响最大（PERMANOVA；F1, 65 = 21.68，R2 = 0.20，P < 0.001），修复处理的效应较小（F1, 65 = 11.42，R2 = 0.10，P < 0.01），修复处理和接种剂添加的交互作用也解释了较少的变异（F1, 65 = 12.90，R2 = 0.12，P < 0.001）。值得注意的是，接种剂的添加不仅减少了修复处理和未修复石灰质土壤之间的组成差异，还减少了修复处理土壤中组成变异的离散度（F3, 65 = 4.16，P < 0.01）（图1），表明使用“本地”土壤类型的接种剂可以有效减少修复处理的组成效应。在酸性土壤中，修复处理和接种处理之间的组成离散度没有差异（F3, 73 = 1.02，P = 0.39）。

### 丛枝菌多样性
土壤修复对丛枝菌OTU丰富度的影响（图2）受到接种处理的调节。在没有接种剂的酸性土壤中，修复处理降低了OTU丰富度（coef = 0.66，z = -3.48，P < 0.001）。相比之下，接种剂的添加消除了修复处理和未修复土壤之间的丰富度差异（coef = 0.89，z = -1.37，P = 0.17），并且使两种处理下的丰富度增加了约43%（coef = 1.43，z = 4.66，P < 0.001）。在受污染的石灰质土壤中，修复处理对两种接种处理下的OTU丰富度都没有影响（未接种剂时；z = -1.50，P = 0.13；接种剂时；z = -0.32，P = 0.75），尽管接种剂仍减少了修复处理和未修复土壤之间的OTU丰富度差异（未接种剂时；coef = 0.81；接种剂时；coef = 0.97）。

### 丛枝菌群落的时间动态
在未接种的土壤中，修复处理没有改变丛枝菌社区的均匀度（图3；酸性土壤；coef = 0.32，t统计量 = 1.22，P = 0.23；石灰质土壤；coef = -0.33，t统计量 = -1.24，P = 0.22）。然而，接种剂的添加增加了修复处理土壤中丛枝菌社区的均匀度，相对于未修复的土壤（酸性土壤；coef = 0.84，t统计量 = 3.48，P < 0.001；石灰质土壤；coef = 1.29，t统计量 = 5.16，P < 0.001），这与OTU丰富度的动态相反，接种剂减弱了修复处理的效果。

#### 主要分类单元的年度波动
尽管修复处理和未修复土壤中的丛枝菌社区均匀度没有总体差异，但检查研究期间的物种等级-丰度曲线显示，未修复的社区通常由单一OTU主导，这在石灰质土壤中尤为明显。此外，接种剂的添加增加了社区中中等排名OTU的相对丰度，从而导致整体上更均匀的社区（图3）。

为了进一步研究修复处理和接种处理对社区结构的差异，我们检查了占据最低排名的OTUs的身份和丰度。值得注意的是，接种剂的添加导致修复处理和未修复社区之间的平均排名变化较小（酸性土壤 = 3.09；石灰质土壤 = 1.81），特别是在石灰质土壤中，四个最丰富的OTU的排名在修复前后保持不变（图4）。相比之下，未接种的社区显示出更大的平均排名变化（酸性土壤 = 3.19；石灰质土壤 = 2.33），尤其是石灰质土壤中，最丰富的OTU的排名变化较大（图4）。

#### 详细分析
（A）每个处理组中丛枝菌社区的等级-丰度曲线。为了计算这些曲线，将每个处理组内各个时间点的丛枝菌社区进行了求和。
（B）修复处理和未修复土壤类型及接种处理之间OTU排名的变化。平均排名变化显示了修复处理和未修复社区之间OTU排名的平均变化。

更详细的单个OTU丰度分析显示，特定的优势OTU受到修复处理和接种处理的影响（图5）。特别是OTU 1（100%与VT114 - Glomus MO-G17 AM849267相同 - 本研究中最为丰富的OTU），在未修复的土壤中比在修复处理的土壤中更为丰富（系数 = 1.69，z统计量 = 36.93，P < 0.001；在石灰质土壤中也为1.69，但系数 = 24.70，z统计量 = -94.99，P < 0.001）。在酸性土壤中，接种剂的添加对修复处理土壤中OTU 1的相对丰度没有显著影响（系数 = 1.01，z统计量 = 0.56，P = 0.57），但在未修复的土壤中增加了其相对丰度（系数 = 1.25，z统计量 = 11.11，P < 0.001）。相反，在未修复的石灰质土壤中添加接种剂略微降低了OTU 1的相对丰度（系数 = 0.70，z统计量 = -15.68，P < 0.001），但在未修复的石灰质土壤中显著增加了其相对丰度（系数 = 42.03，z统计量 = 58.65，P < 0.001），表明使用“本地”土壤类型的接种剂可以恢复修复处理后自然优势OTU的丰度。

### 结论
修复处理未涉及的石灰质土壤中，OTU 1的优势降低意味着其他OTU在修复处理后相对变得更加丰富。例如，OTU 18（与VT143 - Glomus MO-G20 AM849290有98.6%的相似性）在修复处理的未接种土壤中比在所有其他处理组合中的丰度都更高（系数 > 15.26，z统计量 > 75.96，P < 0.001）。同样的趋势也观察到了在OTU 5中（与VT67 - Glomus mosseae AJ306438的相似度为99.4%），它与OTU 18一起，在未接种的修复土壤中占主导地位（系数＞64.97，z统计量＞75.98，P＜0.001，适用于所有成对比较）。在接种剂中检测到的OTUs中（表S5），只有少数在经过处理的土壤中显著增加。OTU 8（与VT165 - Glomus sp. EF154349的相似度为99.8%），虽然是接种剂群落中相对较小的组成部分（接种剂中的平均相对丰度为0.3±0.2%），但在接种后的土壤中显示出更高的相对丰度，无论其修复处理方式如何——在酸性土壤（修复后；系数=132，z统计量=20.63，P＜0.001；未修复；系数=138，z统计量=9.82，P＜0.001）和石灰质土壤（修复后；系数=1096.6，z统计量=17.13，P＜0.001；未修复；系数=1.79，z统计量=15.72，P＜0.001）中均是如此。OTU 2008（与VT108 - Glomus Whitfield type 7 AY330278的相似度为98.6%）作为接种剂群落中的较大组成部分（接种剂中的平均相对丰度为23±15%），在各种处理组合下的接种土壤中也显示出相似的较高丰度（酸性土壤 - 修复后；系数=588.2，z统计量=12.74，P＜0.001；未修复；系数=2.41，z统计量=22.71，P＜0.001；石灰质土壤 - 修复后；系数=167.1，z统计量=11.42，P＜0.001；未修复；系数=24.7，z统计量=13.43，P＜0.001），尽管其丰度随时间的推移有所下降。图5的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。特定AM真菌操作分类单元（OTUs）的平均相对丰度的时间动态变化，涉及修复和处理接种过程。

**讨论**
本研究首次尝试通过重新引入土壤生物群落中的关键功能组成部分——AM真菌（作为本地（原生）接种剂），并详细评估重新引入的AM真菌的多样性，来恢复和跟踪两种修复土壤中AM真菌群落的发展。在与宿主植物共生的情况下建立多样化的AM真菌群落对于修复土壤的生物活性和结构完整性至关重要，因为只有多样的土壤生物群落才能恢复原始基质的全部生态系统功能。此外，使用本地（原生）菌根真菌而不是商业菌根接种剂具有多个优势，包括成本效益以及避免了最近报告中提到的所有负面方面（例如Hart等人2018年；Vahter等人2023年；Koziol等人2024年）。因此，在本研究中，我们测试了使用本地接种剂是否可以成为修复土壤恢复的有效自然解决方案。在我们的实验中，在实验开始的第一个生长季节，仅在实验开始一个月后，就已在两个实验中检测到AM真菌首次在Lolium perenne根系中定殖的迹象（Ma?ek等人2022年）。实验开始一年零五个月后，所有处理组的Lolium根系中都可见并存在菌根定殖现象。与非修复土壤（石灰质和酸性土壤）相比，修复土壤中的菌根定殖强度存在显著差异，这清楚地显示了修复过程对AM真菌根系定殖的影响。Illumina测序技术在实验处理中发现了36个OTUs，这些OTUs与33个独特的MaarjAM虚拟分类单元（VT）相匹配（?pik等人2010年），其中大多数（81%）属于Glomeraceae科，Acaulosporaceae科和Claroideoglomeraceae科各占6%，Diversisporaceae科、Paraglomeraceae科和Archaeosporaceae科各有一个OTU。类似的多样性（分类单元丰富度）也存在于半自然温带草原系统中（例如Ma?ek等人2019年），而在本研究中用作本地接种剂的草原根际中鉴定出了17个OTUs（表S5），其中包括14个Glomeraceae OTUs，一个Acaulosporaceae OTU，一个Archaeosporaceae OTU和一个Claroideoglomeraceae OTU）。这表明，22个未在本地接种剂中鉴定的OTUs要么存在于未修复的土壤中，要么是通过不同的潜在传播方法（例如风、水和/或动物媒介）引入到处理组中的。

**AM真菌群落组成**
我们研究的第一个假设是测试EDTA清洗（修复）和接种是否以不同的方式影响不同类型土壤中AM真菌群落的组成，从而导致不同的AM真菌群落，并且当添加接种剂时，修复后对群落组成的影响是否较小。在两种受污染的土壤类型中，AM真菌群落的组成在修复和处理接种之间有显著差异（图1）。在酸性土壤中，修复对群落组成有显著影响（P＜0.001），解释了组成变化的31.5%，而在石灰质土壤中，修复对AM真菌群落组成的影响较小但仍然显著（P＜0.01）。先前的研究表明，环境样本中AM真菌群落的组成在很大程度上由土壤因素决定，特别是土壤pH值和土壤类型（Dumbrell等人2010a；Hazard等人2013年）。温度和pH值被认为是影响AM真菌全球分布的最重要的非生物因素，而AM真菌的生态位仍然知之甚少（Davison等人2021年）。在我们的实验中，土壤pH值可能影响了修复和未修复土壤中AM真菌群落组成的发展，酸性土壤中初始（修复前，pH=5.0）和最终（修复后，pH=6.2；表S1）土壤pH值之间的差异更大。此外，未修复的土壤在采样时具有不同的原始用途，即斯洛文尼亚石灰质土壤为活跃的菜园，而奥地利酸性土壤为废弃的田地（次生草原），这可能会影响未修复处理中的AM真菌群落。然而，关于AM真菌分类单元与环境之间的生物-环境关系的详细信息仍然很少（Davison等人2021年），这需要进一步研究。添加本地接种剂减少了修复和未修复土壤之间的组成差异，无论是在石灰质土壤还是酸性土壤中（后者的程度较小），从而减少了修复的效果（图1）。只有在石灰质土壤中，添加接种剂还减少了修复土壤中群落的组成分散。接种剂在石灰质土壤中的效果更为明显的原因可能是接种剂来自实验现场附近的未受污染的石灰质草原，因此接种剂的土壤性质，特别是pH值，更接近用于修复的石灰质土壤。引入物种与当地条件的兼容性被认为是决定接种成功的重要因素之一，还有优先效应和土壤的承载能力（栖息地质量）、AM真菌的频率以及物种的兼容性（Verbruggen等人2013年）。

**AM真菌多样性**
为了测试我们的第二个假设，分析了修复和接种对两种不同类型土壤中AM真菌多样性的影响，以及修复后随时间变化的多样性。在没有接种的酸性土壤中，修复减少了OTU的丰富度（P＜0.001）（图2）。添加接种剂消除了修复和未修复土壤之间的丰富度差异，并使两种土壤处理中的丰富度增加了约43%（P＜0.001）。然而，在石灰质土壤中情况有所不同，修复对两种接种处理中的OTU丰富度都没有影响，尽管接种仍然减少了修复和未修复土壤之间的OTU丰富度差异（图2）。与OTU丰富度不同，修复并没有改变整个群落的均匀性（图3）。然而，添加接种剂提高了修复土壤中AM真菌群落的均匀性，这与OTU丰富度的观察结果相反，即接种减少了修复的效果。先前已经测量了物理干扰对AM真菌群落的影响（Lekberg等人2012年），并且在不同土壤处理中对耕地进行的干扰并没有影响AM真菌群落的组成，但提出优先效应可能是干扰后群落差异的原因。在未接种的修复土壤中，初始的AM真菌OTU数量仅限于那些能够从环境中有效传播的物种，可能是主要通过风传播，因为任何AM真菌都不太可能存活EDTA清洗处理。因此，修复和非接种处理中群落组成的发展可能完全取决于优先效应（到达顺序），即首先到达并能够有效与植物根系结合的真菌分类单元将主导群落。先前的研究表明，在植物生长期间，AM真菌群落始终表现出接近对数正态的物种丰富度分布，这很可能是由于基于生态位的群落组装机制，但最丰富的分类单元平均占群落总丰度的40%（Dumbrell等人2010b）——这一模式也在我们的研究中观察到（图4）。这种情况在下一个季节可能会发生变化，假设群落均匀性的季节性变化可能是由于AM真菌在较暖和的生长季节中碳供应增加所导致的竞争动态变化（Dumbrell等人2010b）。然而，在自然生态系统中获得主导地位的分类单元的身份可能在很大程度上是随机的（Dumbrell等人2010b），在未接种的修复土壤中，可能在很大程度上取决于优先效应和来自周围生态系统的传播。在几项关于AM真菌群落的研究中，到达顺序的随机性被认为是一个重要的决定因素（例如Dumbrell等人2011年；Caruso等人2012年）。这一原则可能对修复土壤特别重要，因为根据苛刻的EDTA清洗协议，修复土壤或多或少是一个没有或原始群落非常有限的空间。因此，如果引入的AM真菌能够通过接种剂或不同的传播方法（例如风或动物传播）比其他竞争物种更早到达未占据的区域，它们可能会从优先效应中受益（见图4中AM分类单元的顺序变化）。这意味着优先效应可以显著影响修复土壤中AM真菌群落的组成，尤其是在群落建立的第一个年份（图5），因为到达顺序影响不同AM真菌物种在宿主植物上的定殖成功。优先效应的强度可能取决于宿主植物的身份和邻近植物物种，表明植物相互作用在AM真菌群落形成中起着关键作用（Hausmann和Hawkes，2010年；Werner和Kiers，2015年）。在我们的实验中，选择了草地物种Lolium perenne作为单一宿主植物，以确保所有处理中的根际均匀，并最小化植物物种的影响。

**AM真菌分类单元的身份**
我们部分证实了第三个假设，即干扰（修复）和接种导致了所研究的土壤中AM真菌的优势分类单元身份的变化，反映了不同的特征。我们在实验处理中识别出36个OTUs，这些OTUs与33个独特的MaarjAM虚拟分类单元（VT）相匹配，其中大多数分类单元属于Glomeraceae科（81%）。未修复的群落通常由一个OTU主导，而经过修复的群落则不然，这一点通过整个研究期间的等级-丰度曲线得到证实。添加接种剂增加了群落中处于中间等级的OTUs的相对丰度，可能使得群落分布更加均匀，如图3所示。对个别OTU丰度的更详细分析显示，某些优势OTU受到了修复和接种处理的影响（图4和5）。特别是OTU 1（与Rhizophagus irregularis的簇，与VT 114 - Glomus (MO-G17) AM849267完全相同），在未修复的土壤中的丰度显著高于修复土壤。在石灰质土壤中，添加接种剂并未显著改变未修复土壤中OTU 1的丰度，但在修复土壤中显著增加了其相对丰度（图4）。正如预期的那样，由于OTU 1在接种剂中的相对丰度最高（0.42±0.21，见表S5），它在实验开始时能够在修复后的土壤中生长，因为修复后的基质中的竞争较少。因此，使用“本地”土壤进行接种可以恢复修复处理后自然丰富的OTU的丰度。这一点尤为重要，因为OTU 1（R. irregularis）此前被报道为一种对干扰敏感的AM分类单元，通常存在于受人为活动影响较小的土壤中（例如Helgason等人，1998年）。在一项研究探讨菌根功能是否受真菌群落定量组成的影响时，Bla?ková等人（2021年）发现，从人工接种池（合成群落）中形成的大多数AM真菌群落在组成和功能上都不同于自然形成的菌根真菌群落。唯一的例外是富含有R. irregularis的合成群落，其组成与自然建立的AM真菌群落几乎相同，并且在宿主植物中诱导出非常相似的反应。Bla?ková等人（2021年）还发现，R. irregularis富集群落的根系定殖程度高于其他群落，这强烈表明其他分离株在根内的生物量发育低于R. irregularis。这也解释了为什么从根样本（而不是土壤样本）评估时，R. irregularis在群落中的优势地位和较高物种排名，在我们的研究中也是如此。

在我们的实验中，未使用接种剂的石灰质土壤中，OTU 5和OTU 18在群落中占主导地位，尤其是在实验接近尾声时（见图4和图5）。有趣的是，在OTU 1没有占主导地位的情况下（例如，在未添加接种剂的修复石灰质土壤中），其他OTU相对较为丰富，尽管在其他处理条件下它们较少见。特别是OTU 18（与VT143 - Glomus MO-G20 AM849290有98.6%的相似性），在未接种处理的修复土壤中的丰度显著高于所有其他处理组合。OTU 5（与VT67 - Funneliformis mosseae AJ306438有99.4%的相似性）也表现出同样的趋势，它与OTU 18共同在未接种处理的修复土壤中占主导地位。F. mosseae被认为是一种生命周期较快的AM真菌（Chagnon等人，2013年；Oehl等人，2004年、2009年）。Bla?ková等人（2021年）报告称，F. mosseae在土壤中的感染性平台期低于R. irregularis，或者在同一密度感染性繁殖体下，它的根系定殖程度低于Rhizophagus。这一假设得到了多项早期研究的支持（Janou?ková等人，2013年；Thonar，2009年；Wagg等人，2011年），这些研究表明，从标准化数量的感染性繁殖体来看，F. mosseae和Claroideoglomus claroideum的根系定殖程度低于R. irregularis。

因此，实验第一年修复土壤中群落发展可能的两个主要机制是：（1）优先效应或到达顺序；（2）主要分类单元（即OTU 5、OTU 18和OTU 1）之间的竞争排斥。已知F. mosseae是一种高效的磷供应者，但由于共定殖的AM真菌群落中来自宿主植物的碳供应较高，它不会因此变得更加丰富。答案可能与R. irregularis的快速增长和/或高土壤感染性有关，因为共定殖的AM真菌物种之间的生长速率差异可能会降低优先碳分配的效率（Werner和Kiers，2015年）。R. irregularis的特性可能使它能够从植物对共生关系的初始投资中获得大量碳（Bever，2015年；Christian和Bever，2018年），并通过竞争排斥机制在群落中占据主导地位。由于R. irregularis是我们的本地接种剂中的主要分类单元，它在接种处理中也占据主导地位（见图4中的OTU排名变化）。F. mosseae属于一类以杂草或机会主义生态策略为特征的AM真菌，因为研究发现F. mosseae经常以孢子形式存在于自然土壤和陷阱培养物中，但在自然环境中的植物根系中较少见（?pik等人，2014年）。此外，有报道称F. mosseae在各种受干扰的生境中表现出较高的丰度。Helgason等人（2007年）提出，竞争释放可能解释了在施用杀菌剂benomyl后观察到的F. mosseae丰度增加的现象，这种杀菌剂改变了未受干扰土壤单块体中的AM真菌群落动态。Ma?ek等人（2016年）在盆栽实验中研究EDTA洗过的受污染土壤时发现，与F. mosseae相关的OTU，特别是与MaarjAM虚拟分类单元VT67和VT265对应的OTU，仅出现在AM真菌分类单元多样性相对较低的处理条件下。F. mosseae的相对丰度随着植物根系中AM真菌分类单元丰富度的增加而减少，值得注意的是，在Ma?ek等人（2016年）的研究中，F. mosseae也不存在于环境草地根系样本中，包括常见的菌根植物Plantago lanceolata的根系。

结论

修复过程对修复土壤中的AM真菌群落有显著影响。在修复土壤中使用本地接种剂可以促进多样化的AM真菌群落的形成，包括那些在自然环境中丰富且占主导地位的分类单元，如Rhizophagus irregularis（OTU 1），以及一些稀有分类单元，这些分类单元为在成分上更接近未经处理土壤的菌根真菌群落的土壤中的自然建立提供了机会和推动。研究表明，基于自然AM真菌组成的菌根共生关系比基于人工制造的合成群的共生关系对宿主植物更有益（Bla?ková等人，2021年）。因此，对于修复土壤的恢复，我们再次强调使用来自相似生态系统（在这种情况下是pH值相似的广泛管理的草地土壤）的本地（本土）接种剂是在重金属修复后建立多样化和功能高效群落的最佳方法。这突显了基于自然的解决方案在建立受到不同干扰（包括传统农业系统和城市土壤）影响的土壤中具有植物共生效应的AM真菌群落方面的重要性。