通过突变分析有丝分裂终止GTP酶MoTem1，揭示了其在稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）的发育、应激适应、致病性以及全局基因调控中的作用

《Stress Biology》：Mutational analysis of the mitotic exit GTPase MoTem1 reveals its role in development, stress adaptation, pathogenicity and global gene regulation in Magnaporthe oryzae

　　摘要
有丝分裂退出网络（MEN）由小GTP酶Tem1调控，在协调真核生物的有丝分裂和细胞周期进展中起着关键作用。在这项研究中，我们在稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）中发现了MoTem1，它是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Tem1的功能性同源物，并研究了其在有丝分裂调控和致病性中的作用。通过靶向突变，我们生成了一系列突变株：ΔMotem1（敲除型）、MoTem1-OE（过表达型），以及通过单核苷酸替代产生的MoTem1-CA（持续激活型）和MoTem1-DN（显性阴性型）变体。表型分析表明，MoTem1的活性状态对病原体的生长、发育、胁迫耐受性和致病性至关重要。ΔMotem1和MoTem1-CA突变株的毒力降低，而MoTem1-DN突变株则表现出超强毒力。转录组分析和加权基因共表达网络分析（WGCNA）表明，几丁质合成酶MoCHS1是受到MoTem1活性状态直接或间接影响的下游基因。使用Polyoxin B药理抑制几丁质合成在MoTem1-CA突变株中显示出增强的敏感性，证实了几丁质合成酶的表达减少。亚细胞定位研究显示MoTem1依赖于GTP，能够定位到纺锤体极体（SPB）；而不活跃的MoTem1无法定位到SPB，而在MoTem1-CA中持续激活的MEN会破坏纺锤体位置检查点（SPOC）的控制，导致多核菌丝和多种发育缺陷。总之，我们的工作不仅证明MoTem1是一个细胞周期调控因子，还是一个全局性的上游因素，它影响核分裂、细胞壁完整性，并广泛重塑基因组调控网络，以控制M. oryzae的发育和致病性。

引言
在真核生物中，细胞周期分为间期和有丝分裂期（M期），后者包括核分裂（有丝分裂）和细胞质分离（胞质分裂）（Nigg 2001）。有丝分裂退出和胞质分裂开始的时空调控由进化上保守的有丝分裂退出网络（MEN）控制，这是一个对核分裂与细胞分裂保真性至关重要的信号级联反应（Bardin和Amon 2001；Hotz和Barral 2014）。在酿酒酵母中，MEN作为一个以类似Ras的GTP酶Tem1（M期终止蛋白1）为中心的GTP酶驱动的信号层级结构，协调下游效应因子Bfa1、Bub2、Cdc5、Lte1、Cdc15、Dbf2、Mob1和蛋白质磷酸酶Cdc14（Bettignies和Johnston 2003）的活动。这一过程的关键组成部分是Bfa1-Bub2异二聚体，它作为GTP酶激活蛋白（GAP）复合体，水解结合在Tem1上的GTP。这一机制在早期有丝分裂期间保持MEN信号处于空间上受限的非活性状态（Scarfone和Piatti 2015）。MEN的激活依赖于对抗性磷酸化事件，因为在后期，类似polo的激酶Cdc5会磷酸化Bfa1-Bub2，抑制其GAP活性并稳定Tem1的活性GTP结合构象（Scarfone和Piatti 2015）。这使得Tem1能够激活涉及Cdc15和Dbf2-Mob1的激酶级联反应，最终导致Cdc14磷酸酶从核仁释放（Scarfone和Piatti 2015）。Cdc14通过去磷酸化促进B型周期蛋白降解的底物并激活周期蛋白依赖性激酶（CDK）抑制剂Sic1来促进有丝分裂退出（Scarfone和Piatti 2015）。空间监测机制确保了MEN的准确性。不当的纺锤体定向或细胞骨架缺陷会通过Lte1介导的Kin4自抑制解除来触发Kin4激酶的激活（Scarfone和Piatti 2015）。Kin4磷酸化Bfa1-Bub2以对抗Cdc5介导的抑制修饰，从而恢复GAP活性，使Tem1失活并阻断MEN信号——这是一个在错误条件下防止过早有丝分裂退出的检查点（Scarfone和Piatti 2015）。因此，位于纺锤体极体（SPB）上的小GTP酶Tem1是有丝分裂退出网络（MEN）的主要调控GTP酶，在控制真核生物的有丝分裂进展和退出中起着关键作用（Valerio-Santiago和Monje-Casas 2011）。Tem1最初是通过遗传筛选有丝分裂终止缺陷而被发现的（Shirayama和Matsui 1994）。Tem1的同源物在进化上不同的真菌中具有保守的功能角色。在Schizosaccharomyces pombe中，Tem1同源物Spg1（隔膜促进GTP结合蛋白1）协调有丝分裂退出、胞质分裂和隔膜形成（Schmidt等人1997）。同样，Candida albicans中的CaTem1对有丝分裂退出和胞质分裂启动也是必不可少的；其删除会导致过度极化生长、胞质分裂失败以及核分裂后的异常细胞周期重新进入（Milne等人2014）。Tem1活性平衡似乎对真菌致病性至关重要：在Colletotrichum orbiculare中，由于CoTem1的持续激活和过早的有丝分裂退出，CoBfa1/CoBub2敲除株表现出非致病性表型（Fukada和Kubo 2015）。然而，重新引入一个GTP酶缺陷突变株CoTem1（G20V）后，致病性得以恢复，证实GTP结合态和GDP结合态之间的动态循环对毒力至关重要（Fukada和Kubo 2015）。值得注意的是，Fusarium graminearum中的ΔFgtem1表现出正常的营养生长、有性繁殖和脱氧雪腐醇（DON）生物合成，但其感染结构形态发生严重受损，且在小麦穗上的致病性显著降低，表明FgTem1是致病性的重要调控因子（Miao等人2023）。

稻瘟病由真菌Magnaporthe oryzae引起，对水稻构成重大全球威胁，每年可能导致6000万人的粮食损失（Pennisi 2010；Dean等人2012）。在有利条件下，M. oryzae会发育出产生无性孢子的分生孢子器（Ou 1980）。这些具有三个隔室的分生孢子器每个隔室含一个核，在水稻叶片表面萌发，形成一个侵入器，紧密附着在水稻角质层上。侵入器产生高渗透压，使真菌能够通过面向叶片表面的侵入器孔穿透角质层（Ou 1980）。一旦角质层被突破，一个细长的穿透器将一个核植入表皮细胞（Ou 1980）。作为一种半生物营养型病原体，M. oryzae最初表现出生物营养型行为，躲避植物免疫系统，然后切换到坏死营养型生长（Wilson 2021）。在生物营养型阶段，真菌会破坏宿主内的激素平衡并分泌效应蛋白以逃避免疫反应，通过相邻叶片细胞间的胞间连丝进行传播（Kankanala等人2007；Fernandez和Orth 2018）。对稻瘟病菌M. oryzae中MEN成分的功能分析揭示了它们在发育和致病性中的特殊作用。MoBub2对分生孢子形成和侵入器分化至关重要；ΔMobub2突变株产生的分生孢子具有过度隔膜和多核隔室，同时伴有侵入器缺陷，导致宿主角质层穿透失败（Fukada等人2019）。下游MEN效应因子（包括MoSep1（Cdc15同源物）、MoMob1和MoDbf2）的破坏会严重削弱致病性并扰乱菌丝隔膜形成，导致延长的多核菌丝段（Feng等人2022）。有趣的是，M. oryzae在MEN信号传导方面表现出进化分歧：与在S. cerevisiae中Cdc15磷酸化Dbf2不同，MoSep1通过磷酸化直接激活MoMob1，绕过了MoDbf2（Feng等人2022）。此外，删除负责细胞周期最后步骤的MEN磷酸酶MoCdc14同源物（Meitinger等人2012）调节隔膜形成和核分裂，影响致病性，产生无隔膜或低隔膜的多核孢子，形成无法穿透植物表皮屏障的不功能性侵入器，强调了MoCdc14在感染中的多效性作用（Li等人2018）。虽然酵母Tem1相关GTP酶激活蛋白（GAP）复合体同源物及其下游MEN成分在M. oryzae中已被广泛研究，它们在那里调节隔膜形成和致病性，但由于这种病原体中缺乏确认的Tem1同源物，阻碍了对MEN信号传导的全面理解。鉴于Tem1在S. cerevisiae中作为MEN的主要调控因子的关键作用，其中它协调有丝分裂退出并确保细胞周期的准确性，识别其在M. oryzae中的对应物对于阐明这一途径如何影响真菌发育和宿主感染至关重要。在这项研究中，我们确定了MoTem1（MGG_04862）作为M. oryzae中的功能Tem1同源物，并通过突变和表型分析研究了其调控作用。功能表征表明，MoTem1以其GTP酶活性作为分子开关，协调有丝分裂、分生孢子形态形成，并影响胁迫适应，对致病性具有间接或直接的影响。此外，我们还证明了MoTem1活性影响几丁质合成酶基因的表达，进而影响细胞壁完整性和宿主入侵。我们的发现表明MoTem1是M. oryzae中MEN信号传导的关键组成部分，它桥接了有丝分裂调控与生长及生物和非生物环境压力的反应。

在M. oryzae中鉴定motem1及其功能等位基因MoTem1Q182L和MoTem1T137N
我们通过针对M. oryzae 70–15基因组（NCBI taxid: 242507）使用S. cerevisiae Tem1（ScTem1；NP_013647.1）以及更密切相关的F. graminearum FgTem1（Miao等人2023）作为查询，通过BLASTP搜索找到了一个潜在的Tem1同源物。这一分析确定了MGG_04862，其在NCBI中被注释为隔膜促进GTP结合蛋白1，与ScTem1的序列同源性为60.21%，覆盖率为77%，从而确认了其结构同源性，因此我们将其命名为MoTem1（图S1A）。与更密切相关的F. graminearum FgTem1（Miao等人2023）的相似性更好，序列同源性为72.28%，覆盖率为96%。对24种真菌物种的Tem1同源物的系统发育分析将MoTem1归类到一个包含Botrytis cinerea的BcTem1和Sclerotinia sclerotiorum的SsTem1的支系中，强调了其在具有高度黑化的繁殖体的植物病原真菌中的进化保守性（图1A）。为了解析MoTem1的功能状态，我们引入了基于S. cerevisiae、C. orbicular和F. graminearum的Tem1同源物的突变，使其处于活性（Q182L）或非活性（T137N）状态（图S1B）。为了简化，我们将MoTem1的活性形式命名为MoTem1Q182L，非活性形式命名为MoTem1T137N。

图1
此图像的替代文本可能是使用AI生成的。

通过酵母双杂交和pull-down实验鉴定MoTem1及其与同源蛋白的相互作用。对24种Tem1同源物进行了系统发育分析。物种信息和登录号见表S1。B 酵母双杂交实验验证MoTem1与MoBfa1/MoBub2之间的相互作用。MoTem1Q182L代表持续激活形式，而MoTem1T137N代表显性阴性形式。不同状态的BD-MoTem1质粒与AD-MoBfa1或AD-MoBub2质粒共转染到酵母AH109中。酵母在SD-2/-Tep/-Leu2培养基中的生长表明质粒转化成功，而在SD-4/-Ade/-His/-Leu/-Trp培养基中的生长表明AD和BD质粒上的蛋白之间存在相互作用。AD-T和BD-P53的组合用作阳性对照，而AD-T和BD-Lam用作阴性对照。C pull-down实验验证MoTem1与MoBfa1之间的相互作用。GST、GST-MoTem1Q182L和GST-MoTem1T137N分别用HIS-MoBfa1进行GST pull-down实验，其中GST和HIS-MoBfa1的组合用作阴性对照。D pull-down实验验证MoTem1与MoBub2之间的相互作用。由于HIS-MoBub2无法表达，因此使用GST和GST-MoBub2来pull down HIS-MoTem1Q182L或HIS-MoTem1T137L，测试不同MoTem1变体与MoBub2之间的结合。

酵母双杂交实验显示MoTem1Q182L和MoTem1T137N均与MoBfa1（MGG_03162）相互作用，后者是GTP酶激活蛋白（GAP）复合体的核心成分。然而，另一个GAP复合体的核心成分MoBub2（MGG_04676）仅与MoTem1Q182L结合（图1B）。下拉实验验证了这些依赖于状态的相互作用，表明MoTem1 Q182L能够招募整个GAP复合体（MoBfa1-MoBub2），而MoTem1T137N只招募MoBfa1（图1C，D）。因此，我们在Guy11背景中生成了四种同源突变株，以研究MoTem1活性状态在稻霉菌（M. oryzae）中的功能后果：ΔMotem1（基因缺失）、MoTem1-OE（过表达）、MoTem1-CA（Q182L；持续激活）和MoTem1-DN（T137N；显性负调控）（图2A）。我们通过同源重组将MoTEM1编码序列替换为潮霉素磷酸转移酶（HPH） cassette来构建ΔMotem1株。使用Hind III消化的基因组DNA探针进行的Southern blot分析确认了MoTEM1的精确位点替换，在转化体中观察到一个整合事件（图S1C）。MoTem1-OE、MoTem1-CA和MoTem1-DN株都是通过将表达野生型MoTEM1、MoTEM1-Q182L和MoTEM1-T137N等位基因的pKNT-RP27载体转化到Guy11中而获得的。RT-qPCR定量显示，与野生型相比，MoTem1-OE、MoTem1-CA和MoTem1-DN中的MoTEM1转录本分别上调了13.57±1.77、11.11±1.91和19.78±1.82倍（图S1D）。

图2
此图像的替代文本可能是使用人工智能生成的。
不同突变株的创建及其与野生型（WT）的表型比较。图中展示了不同菌株中表达的MoTem1形式示意图。在Guy11中，MoTEM1的启动子激活MoTEM1基因的转录。在ΔMotem1中，MoTEM1基因被HYH基因取代；因此，MoTEM1的启动子激活HPH的转录。在MoTem1-OE、MoTem1-CA和MoTem1-DN菌株中，MoTEM1、MoTem1-Q182L和MoTem1-T137N基因位于强烈的RP27启动子之后，并被转移到Guy11中以获得MoTem1-OE/CA/DN菌株。在RP27启动子的驱动下，MoTem1、MoTem1Q182L或MoTem1T137N的过表达会覆盖Guy11自身表达的原始MoTem1的功能。灰色和蓝色条形代表MoTem1的氨基酸长度，橙色条形代表HPH的氨基酸长度，黑色条形代表MoTem1启动子的核苷酸长度，红色条形代表RP27启动子的核苷酸长度。
B. 不同菌株在固体CMII培养基上的生长情况，包括菌落生长速率分析。统计显著性通过Kruskal-Wallis检验和Dunn的事后检验确定。数据表示平均值±标准差，n=3个生物学重复。
C. Guy11和MoTem1-CA菌株之间的分生孢子萌发比较。比例尺代表10微米。
D. 不同菌株产生的分生孢子数量。统计显著性通过单因素方差分析（one-way ANOVA）和Dunnett的事后检验确定。数据表示平均值±标准差，n=3个生物学重复。
E. 不同菌株在2小时后的分生孢子萌发率。统计显著性通过单因素方差分析（one-way ANOVA）和Dunnett的事后检验确定。数据表示平均值±标准差，n=3个生物学重复。
对于B、D、E，与Guy11的统计显著性比较如下：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。Cohen的d值（C）作为效应大小的度量，阈值定义为：0.2=小效应，0.5=中等效应，0.8=大效应。

我们的结果明确识别了MoTem1，并建立了一系列具有定义好的MoTem1活性状态的稻霉菌（M. oryzae）菌株，从而进一步系统地研究了这些状态在稻霉菌作为病原体生长以及在实验室培养基上生长中的作用。

MoTem1通过GTP酶活性循环调节营养生长和分生孢子形成。为了评估MoTem1在真菌发育中的作用，我们测量了每种菌株的菌丝径向生长。与野生型（WT，Guy11；3.08±0.02毫米/天）相比，ΔMotem1（2.77±0.04毫米/天）和MoTem1-CA（1.80±0.04毫米/天）的生长分别减少了约10.06%和41.56%，而MoTem1-OE（3.31±0.05毫米/天）和MoTem1-DN（3.19±0.01毫米/天）的生长分别增加了约7.41%和3.57%。尽管Kruskal-Wallis检验和Dunn的事后检验表明这些差异没有达到统计显著性（图2A，B），但效应大小（Cohen’s d）分析显示了明显的趋势。根据传统解释（d≥0.8表示大效应），MoTem1-CA相对于WT的效应大小非常大（d=41.22）。此外，ΔMotem1（d=9.1）、MoTem1-OE（d=6.27）和MoTem1-DN（d=5.85）的效应大小也远远超过了“大效应”的阈值，这表明这些菌株中观察到的生长变化具有相当大的表型幅度。

在稻糠培养基上进行的分生孢子形成试验揭示了无性繁殖的严重缺陷。与野生型相比，ΔMotem1、MoTem1-CA和MoTem1-DN菌株产生的分生孢子数量分别减少了35.09%、66.74%和36.92%（p<0.0001，单因素方差分析及Dunnett的事后检验；图2D）。这些减少的幅度得到了非常大的效应大小（Cohen’s d：分别为6.98、13.17和6.69）的支持。相比之下，MoTem1-OE菌株的分生孢子形成与野生型水平相当，表明单独的MoTem1过表达不影响这一过程。这些结果表明，MoTem1的GDP/GTP循环——而不是其表达水平本身——对于分生孢子的形成至关重要，因为锁定状态（CA和DN）和敲除（Δ）突变体都严重损害了分生孢子的形成效率。

总体而言，MoTem1作为真菌发育的调节器：其GTP酶活性促进营养生长，而动态的GDP/GTP循环对于分生孢子的产生至关重要。

MoTem1参与分生孢子的萌发和附着器的形成。为了研究MoTem1在感染前发育中的潜在作用，我们分析了突变菌株的分生孢子萌发和附着器形成。与野生型（WT；53.35±3.67%）相比，MoTem1-OE和MoTem1-DN在接种后2小时（hpi）的分生孢子萌发显著加速，分别达到89.64±4.27%和74.38±1.52%（p<0.0001，单因素方差分析及Dunnett的事后检验；图2E），效应大小非常大（Cohen’s d=9.12和7.49）。这种加速的表型与其增强的菌落径向生长率相关（图2B）。相比之下，MoTem1-CA的分生孢子萌发严重延迟且显著延迟（仅2 hpi时为13.47±3.96%；p<0.0001，单因素方差分析及Dunnett的事后检验；图2E和图S2B），伴随非常大的效应大小（Cohen’s d=10.44），并且还显示出附着器形成的缺陷（图2E和图S2B）。这些结果表明持续的GTP酶活性阻碍了萌发的启动。

形态学分析显示，MoTem1-CA的分生孢子表现出异常的表型，包括多根 germ tube形成和细胞壁肥大（图2C和图S2A）。值得注意的是，MoTem1-CA的附着器形成了异常延长的 germ tube，而其他菌株显示出类似野生型的 germ tube-附着器转变（图2C和图S2A）。这些缺陷表明，持续的MoTem1激活会扰乱 germ tube极性的协调，而其失活则允许发育过程的及时进行。

这些发现表明，MoTem1的GTP酶循环，而不仅仅是其存在本身，调控了分生孢子萌发和附着器分化的时空进程，这对正常的植物穿透形态发生至关重要，并且是附着器形成和致病性的必要条件。

我们使用突变菌株的分生孢子对水稻幼苗（cv. CO39）进行喷洒接种，并使用五级评分系统量化病斑进展，以直接评估MoTem1在水稻植物感染中的作用。野生型感染产生了I型（23.46±0.78%）、II型（67.71±1.07%）和III型（8.83±1.04%）病斑，与其毒力特征一致（图3A和图S2）。MoTem1-OE再现了这种模式（I型：21.29±2.62%，II型：69.74±4.68%，III型：8.97±3.18%），表明过表达几乎没有影响，或者功能性补偿或反馈调节保持了致病性（图3A）。

图3
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Motem1参与应激反应和致病过程。不同菌株在水稻叶片中引起的病斑类型。长度小于0.05厘米的病斑被归类为I型，0.05–0.2厘米的为II型，0.2–0.3厘米的为III型，0.3–0.4厘米的为IV型（n=3个生物学重复，数据为平均值±标准差）。通过颜色增强显示病斑。原始图像见图S3。
B. 不同菌株在氧化应激（H2O2）、细胞壁应激（CR）、膜应激（SDS）离子+非营养物质NaCl和KCl的渗透压应激以及非营养物质（山梨醇）的渗透压应激下的抑制率。对于H2O2和山梨醇，统计显著性通过单因素方差分析及Dunnett的事后检验确定。数据表示平均值±标准差，n=3个生物学重复。对于CR、SDS、NaCl和KCl，统计显著性通过单因素方差分析及Dunnett的事后检验确定。与Guy11的比较显著性如下：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。Cohen的d值（C）作为效应大小的度量，阈值定义为：0.2=小效应，0.5=中等效应，0.8=大效应。

ΔMotem1感染表现出减弱的致病性病斑大小，III型病斑减少了3.2倍（2.76±0.37%），并且病斑类型向II型（73.89±1.87%）转变。值得注意的是，MoTem1-CA感染仅限于I型（39.49±0.73%）和II型（60.51±0.73%）病斑，表明持续的GTP酶活性严重损害了毒力（图3A和图S3）。相反，MoTem1-DN表现出过度毒力，产生了IV型病斑（8.28±1.64%），而在相同的hpi下野生型没有这些病斑，同时III型病斑频率增加（12.38±1.45%），II型病斑频率降低（44.53±4.30%）（图3A）。

这些结果表明MoTem1是一个可调节的生长和核分裂结果的调节器：其动态失活促进了更强烈的致病性，而持续激活或缺失则降低了毒力，可能是通过效应因子的失调或形态发生的协调不良。

我们通过模拟真菌作为植物病原体在其自然栖息地中必须处理的氧化应激、细胞壁应激和渗透压应激条件，来挑战菌株。为了评估MoTem1对氧化应激耐受性的影响，我们测量了突变菌株在10 mM H2O2下的生长情况。与野生型（WT；生长抑制率为11.13±1.43%）相比，MoTem1-OE和MoTem1-DN表现出增强的耐受性（抑制率分别为7.15±2.00%和5.33±2.28%）。MoTem1-DN的增强耐受性在统计上显著（p=0.0271，与WT相比，单因素方差分析及Dunnett的事后检验），并且效应大小非常大（Cohen’s d=48.51）。相比之下，ΔMotem1和MoTem1-CA对氧化应激表现出过度敏感性（抑制率分别为14.95±2.06%和26.39±4.84%），MoTem1-CA的敏感性增加也显著（p=0.0448，与WT相比），并且效应大小也很大（Cohen’s d=7.49）。这些表型趋势进一步通过半最大抑制浓度（IC50）分析得到证实：MoTem1-DN的IC50（15.48 mM）高于WT（11.47 mM），而MoTem1-CA的IC50（10.79 mM）较低。这些结果表明，破坏MoTem1的GTP/GDP循环（DN状态）增强了氧化应激耐受性，而其持续激活（CA状态）则增加了真菌的敏感性（图3B和图S4）。

对于细胞壁完整性和膜通透性应激，突变株在0.1% Congo Red（CR）和0.01% SDS下的反应呈现不同的表型。在CR应激下，MoTem1-OE表现出明显较低的生长抑制（15.92±1.93%），与野生型（WT；28.76±0.59%）相比，效应大小较大（Cohen’s d=9.0），尽管差异在统计上不显著（p>0.05，Kruskal-Wallis检验及Dunnett的事后检验，图3C和图S4）。相比之下，MoTem1-CA对CR表现出严重的过度敏感性（48.93±0.59%的抑制；Cohen’s d=34.12）。相应的IC50值也与这些趋势一致：MoTem1-OE（0.196%）的耐受性高于WT（0.184%），而MoTem1-CA（0.115%）更敏感（图3C和图S4）。

在SDS应激下，ΔMotem1（27.78±1.99%的抑制）比WT（12.72±0.73%）更敏感（p=0.0372，Kruskal-Wallis检验及Dunnett的事后检验），效应大小非常大（Cohen’s d=10.06）。MoTem1-CA（24.94±1.13%）和MoTem1-DN（26.59±1.21%）的抑制率也高于WT，尽管这些差异在统计上不显著（p>0.05）。MoTem1-OE（14.00±1.55%）的抑制率与WT相似。IC50分析进一步支持了这些观察：ΔMotem1（0.01291%），MoTem1-CA（0.01243%）和MoTem1-DN（0.01275%）的IC50值都低于WT（0.01536%），而MoTem1-OE（0.01574%）与WT相当（图3C和图S4）。总之，这些数据表明MoTem1以激活状态依赖的方式调节细胞壁和膜的完整性：过表达赋予对CR的特定耐受性，持续激活导致对CR的严重过度敏感性，而失去MoTem1或锁定失活状态则增加了对SDS介导的膜应激的敏感性。

在离子和渗透压应激条件（1 M NaCl，1 M KCl，1 M sorbitol）下，突变株表现出特定的反应（图3B和图S3）。MoTem1-CA在所有应激下均表现出高敏感性，尤其是在KCl应激下抑制明显增加（66.41±7.02% vs WT 42.88±1.13%；Cohen’s d=4.68），并且NaCl的IC50值较低（0.71 M vs WT 0.98 M）。相比之下，ΔMotem1、MoTem1-OE和MoTem1-DN对山梨醇的耐受性增强（抑制率分别为22.68±2.33%，23.19±1.20%，16.39±7.58%，vs WT 33.87±2.45%；Cohen’s d=4.68，5.53，3.11），但它们对离子应激的反应不同：MoTem1-OE和MoTem1-DN的NaCl IC50值略高（1.03 M和1.04 M）比WT，但MoTem1-OE在KCl下的抑制增加（58.54±3.49%；Cohen’s d=6.03）。这些结果表明，MoTem1的持续激活会广泛提高对压力的敏感性，而其过表达或功能丧失则会促进渗透耐受性，但对离子压力的响应则有差异，这表明MoTem1调节着适应膜和渗透压的不同途径。总体而言，MoTem1影响下游的压力信号传导：其GTP结合状态能够增强氧化应激适应能力和渗透适应能力，而动态的GTP/GDP循环维持着真菌细胞壁和膜的功能。MoTem1的核苷酸突变对其在纺锤体极体（SPB）中的定位有依赖性，这种定位协调了有丝分裂的准确性。使用EGFP-MoTem1在稻霉菌（M. oryzae）菌丝中的荧光定位显示了斑点状分布模式（图4A）。与SPB标记基因MoAlp6-mCherry（来自pKNT-RP27-mCherry载体）共表达证实了GFP-MoTem1确实特异性地定位在纺锤体极体（SPB）上（图4B）。为了研究这种定位的生化基础，我们评估了MoTem1的GTP酶活性。体外研究表明，纯化的HIS-MoTem1表现出显著的GTP水解活性（2.33 ± 0.40 U/mg），显著高于HIS标记的对照组（0.53 ± 0.07 U/mg；p = 0.0002），且效应量非常大（Cohen’s d = 6.21）；而无活性的突变体HIS-MoTem1T137N则没有表现出显著的活性增加（0.39 ± 0.17 U/mg）（图4C）。在体内实验中，ΔMotem1的活性呈现下降趋势（9.16 ± 2.33相对活性单位），而MoTem1-OE的活性则有所增加（14.39 ± 5.29），与野生型（13.45 ± 4.49）相比，但这些差异并不具有统计学意义（图4D）。值得注意的是，ΔMotem1的效应量很大（Cohen’s d = 8.54），这表明其生物学效应显著（图4D）。与这些酶学性质一致的是，功能突变的定位分析显示，持续活性的MoTem1Q182L在菌丝和孢子中显示出更多且更显著的SPB相关斑点。相比之下，显性负突变体MoTem1T137N完全没有明显的斑点定位，其荧光信号在细胞质中呈弥漫分布（图4E）。总之，MoTem1的GTP结合形式在SPB处富集，而GDP结合形式则在细胞质中呈弥漫分布。

图4：该图像的替代文本可能是通过人工智能生成的。全尺寸图像显示了MoTem1的GTP酶活性如何调节其在纺锤体极体（SPB）中的定位。A项展示了Guy 11菌丝中MoTem1向SPB结构的亚细胞定位情况，白色刻度条代表10 μm，白色箭头标记菌丝隔膜的位置，蓝色箭头标记SPB结构的位置。B项进一步展示了MoTem1的亚细胞定位，其中MoAlp6（MGG_01815）作为纺锤体极体标记基因。C项显示MoTem1的GTP酶活性显著高于MoTem1T137N，并表明T137N替换导致MoTem1 GTP酶失活。统计显著性通过单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett的事后检验确定。数据代表平均值±标准差（SD），n=3次生物重复实验。D项显示ΔMotem1的GTP酶活性略有降低，但与Guy11和MoTem1-OE菌株相比没有显著差异，这些菌株的活性相似。统计显著性同样通过单因素方差分析和Dunnett的事后检验确定。对于C项和D项，与HIS或Guy11相比的统计显著性如下：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。C项中的Cohen’s d用于衡量效应量，阈值定义为：0.2 = 海量，0.5 = 中等，0.8 = 大。

这些结果表明，MoTem1的持续激活会增强对压力的敏感性，而其过表达或功能丧失则会提高渗透耐受性，但对离子压力的响应不同，这表明MoTem1通过不同途径调节细胞对膜和渗透压的适应。MoTem1影响了下游的压力信号传导：其GTP结合状态促进了氧化应激适应性和渗透适应能力，而动态的GTP/GDP循环则维持了真菌细胞壁和膜的功能。核苷酸突变改变了MoTem1在纺锤体极体（SPB）中的定位，这种定位协调了有丝分裂的准确性。使用EGFP-MoTem1在稻霉菌（M. oryzae）菌丝中的荧光定位显示了斑点状分布模式（图4A）。与SPB标记基因MoAlp6-mCherry（来自pKNT-RP27-mCherry载体）共表达证实了GFP-MoTem1特异性地定位在纺锤体极体（SPB）上（图4B）。为了研究这种定位的生化基础，我们评估了MoTem1的GTP酶活性。体外实验中，纯化的HIS-MoTem1表现出显著的GTP水解活性（2.33 ± 0.40 U/mg），远高于HIS标记的对照组（0.53 ± 0.07 U/mg；p = 0.0002），效应量非常大（Cohen’s d = 6.21）。而无活性的突变体HIS-MoTem1T137N的活性没有显著增加（0.39 ± 0.17 U/mg）（图4C）。在体内实验中，ΔMotem1的活性呈下降趋势（9.16 ± 2.33相对活性单位），而MoTem1-OE的活性呈上升趋势（14.39 ± 5.29），与野生型（13.45 ± 4.49）相比，但这些差异并不具有统计学意义（图4D）。值得注意的是，ΔMotem1的效应量很大（Cohen’s d = 8.54），这提示其生物学效应显著（图4D）。与这些酶学性质一致的是，功能突变的定位分析显示，持续活性的MoTem1Q182L在菌丝和孢子中显示出更多且更强的SPB相关斑点。相比之下，显性负突变体MoTem1T137N完全没有明确的斑点定位，其荧光信号在整个细胞质中呈弥漫分布（图4E）。总之，MoTem1的GTP结合形式在SPB处富集，而GDP结合形式则在细胞质中呈弥漫分布。

为了观察核的亚细胞定位，我们使用核标记基因MoHis1-mCherry（MGG_12797）（Zhang等人，2019年）来研究不同MoTem1突变体对核动态的影响。与MEN途径失调一致，ΔMotem1和MoTem1-CA菌丝含有多核菌丝隔室，表明隔膜形成和核分离与核分裂不同步（图5A）。相比之下，MoTem1-DN保持了WT型的菌丝隔膜形成和核分离，这表明MEN途径的短暂失活能够维持有丝分裂结束与隔膜形成和核迁移的协调。图5B提出了一个示意图模型，展示了MoTem1的破坏（ΔMotem1）或持续激活（MoTem1-CA）导致多核细胞的机制，说明了异常的GTP酶循环如何影响核分裂和胞质分裂。

我们的数据确立了MoTem1作为稻霉菌（M. oryzae）MEN途径的调节因子，其中其在SPB中的GTP结合状态影响有丝分裂的结束。进一步研究表明，MoTem1的删除（ΔMotem1）或持续激活（MoTem1-CA）会破坏核分裂与核分离为独立菌丝隔室之间的连接。

为了解析MoTem1在全基因组范围内的调控效应，我们对Guy11、ΔMotem1、MoTem1-OE、MoTem1-CA和MoTem1-DN菌株进行了RNA-Seq分析。所有组之间一致的全局表达分布以及生物重复实验之间的相关性热图证明了一致性，表明实验的高重复性（图S6A和S6B）。主成分分析（PCA）在第一个主成分（PC1）上清楚地将ΔMotem1和MoTem1-CA与Guy11区分开来，而MoTem1-OE和MoTem1-DN则聚类在Guy11附近，表明这些菌株的转录发生了显著变化（图S6C）。使用DESeq2进行差异表达分析时设置了严格的阈值（FDR < 0.01且|log2FC| > 2）。对差异表达基因（DEGs）的Venn分析发现了所有突变体比较中共有的72个保守基因（图S7A）。这些保守基因包括核心细胞周期调节因子和应激响应转录因子，可能是本研究观察到的表型差异的基础。在ΔMotem1中，下调的基因主要涉及“糖原代谢过程”和“黑色素代谢过程”，这与观察到的生长迟缓、减弱毒力和多核表型一致，可能源于基本代谢功能的紊乱（图S7B，表S4）。MoTem1-OE特异性激活了与“氧化还原酶活性”相关的基因（图S7C），而MoTem1-DN主要上调了参与“初级代谢过程”的基因。这表明两者通过不同的分子途径达到相同的耐压表型：一种增强了直接解毒，另一种促进了代谢重组（图S7E，表S4）。在MoTem1-CA中，上调的基因主要集中在“单一生物体代谢过程”和“应激响应”途径中，同时还表达了大量与“膜内在成分”相关的基因。这种全局转录重编程表明，细胞激活了广泛的代谢、 transport和适应性反应以应对内部压力，这可能是观察到的严重生长缺陷、多核现象和增强的压力敏感性的原因（图S7D，表S4）。这些转录图谱表明MoTem1是一个信号中心，通过动态的GTP/GDP核苷酸循环影响多种应答，对氧化还原平衡、致病性和形态发生有显著影响，其调控效应类似于MoIsw2（Pei等人，2024年）。

加权共表达网络分析识别了MoTem1调控的功能模块。通过加权基因共表达网络分析（WGCNA），我们识别出八个不同的模块（图S8和S9）。模块-性状相关性分析揭示了三个与植物致病性特别相关的功能簇。MEbrown基因与抗氧化应力抵抗力正相关（r = 0.91），与生长速率负相关（r = -0.95），表明存在生长-应力适应的权衡（图S9）。MEyellow模块与菌丝生长显著相关（r = 0.80），并在核糖体生物合成和糖酵解基因中富集（图S9）。MEtan模块与致病性相关性最强（r = 0.71），包含38个与毒力相关的基因，包括编码分泌效应蛋白和角质酶的基因（图S9）。这一网络拓扑结构表明MEbrown和MEtan调控的基因分别在应激适应和致病性中起重要作用。在MEbrown中响应的72个差异表达基因（DEGs）中，选择了MGG_02246、MGG_11991和MGG_06888进行RNAseq与RT-qPCR交叉验证。同样，对于MEtan，选择了MGG_01802、MGG_05421和MGG_06238。这两种方法显示了五种不同菌株对所有基因的相似表达模式，验证了RNAseq的结果（图S11）。表达动态验证了这些关联。MEbrown基因在MoTem1-CA中显著上调，在其他菌株中下调（图S12）。MEyellow基因在快速生长的ΔMotem1中被抑制，在慢速生长的MoTem1-CA中被抑制，但在慢速生长的MoTem1-DN中被上调（图S13）。METan基因在低毒性的ΔMotem1和MoTem1-CA中表达减少（图S14），这与病变严重程度一致。注意：MEtan包括MoCHS1（MGG_01802），这是一种可能将此模块与细胞壁介导的植物免疫反应联系起来的角质酶。

综上所述，这些分析进一步支持了MoTem1与MoIsw2类似的表观遗传压力调控效应（Pei等人，2024年），并且还表明其对几丁质合成的特定影响可能解释了一些表型。基于METan模块与致病性的关联，我们优先验证了其55个候选基因的功能。通过枢纽基因选择（模块成员身份 > 0.9，基因显著性 > 0.65），我们鉴定出20个高置信度的毒力效应因子，其中12个在ΔMotem1和MoTem1-CA中显著下调（与WT相比，图S10）。其中，MoCHS1（MGG_01802）在图S10中排名第五，编码一种对细胞壁完整性至关重要的V类角质酶，其表达模式反映了毒力表型：在MoTem1-CA中下调3.07倍，在MoTem1-DN中上调1.26倍（图6A和B）。这种转录耦合表明MoTem1活性至少间接影响了MoCHS1的表达。这一假设通过使用Polyoxin B（100 μg/mL）进行药理学抑制得到了进一步证实，这是一种角质酶抑制剂。它使MoTem1-CA的生长抑制了40.36 ± 6.42%，而WT中的抑制率为4.89 ± 1.29%；MoTem1-DN则保持抗性（图6C、D和图S15）。

图6：该图像的替代文本可能是通过人工智能生成的。全尺寸图像显示了MGG_01802基因如何将MoTem1信号与几丁质代谢和致病性联系起来。A项显示了来自转录组数据的MGG_01802的FPKM值。统计显著性通过单因素方差分析和Dunnett的事后检验确定。数据代表平均值±标准差（SD），n=3次生物重复实验。B项显示了不同菌株中MGG_01802表达的qRT-PCR分析结果。统计显著性通过单因素方差分析和Dunnett的事后检验确定。数据代表平均值±标准差（SD），n=3次生物重复实验。C项显示了Polyoxin B（PB）（100 μg/mL）对各种菌株的抑制率。统计显著性通过Kruskal–Wallis测试和Dunnett的事后检验确定。数据代表平均值±标准差（SD），n=3次生物重复实验。对于A项、B项和C项，与Guy11相比的统计显著性如下：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。C项中的Cohen’s d用于衡量效应量，阈值定义为：0.2 = 海量，0.5 = 中等，0.8 = 大。D项显示了添加或未添加PB（100 μg/mL）的Guy11、MoTem1-CA和MoTem1-DN菌落的形态。E项显示了使用来自指示菌株的无菌培养滤液在稻叶盘上诱导的ROS爆发实验。使用最终的chitohexaose（一种几丁质寡聚物）浓度为400 nM作为阳性对照。用角质酶预处理以消除培养滤液中的几丁质成分，确认了反应是由几丁质寡聚物特异性引起的。

为了进一步验证这一假设，我们使用了角质酶抑制剂Polyoxin B（100 μg/mL）进行药理学抑制（图6C、6D和图S15）。与野生型（WT；抑制率为4.89 ± 0.42%）相比，MoTem1-CA表现出极强的敏感性，抑制率为40.36 ± 2.23%。相比之下，MoTem1-DN表现出很强的抗性，抑制率仅为0.73 ± 0.01%。尽管这些差异没有统计学意义，但效应量非常大（MoTem1-CA的Cohen’s d = 22.14，MoTem1-DN的Cohen’s d = 14.11）。这些结果强调了MoTem1的GTP结合状态对细胞壁完整性的关键调节作用，其持续激活会导致严重的药物敏感性，而锁定在非活性状态则会增强耐受性。由于几丁质寡聚物chitohexaose是植物先天免疫反应的标准诱导剂，我们使用来自CM2培养的Guy11、MoTem-CA和MoTem-DN菌株的培养滤液进行了标准的ROS实验，并加入了或未加入几丁质。MoTem-DN引发的活性氧（ROS）反应比Guy11滤液，尤其是MoTem-CA滤液要强烈得多。添加几丁质酶后，所有反应都消失，这表明不同量的几丁质寡聚体-PAMP主要是导致植物ROS反应的原因（图6E）。此外，还对KO和OE菌株进行了ROS测定，但结果与Guy11相比没有差异，因此未显示。这些数据表明MoTem1的活性状态可能会影响几丁质的生物合成。在MoTem1-CA（Q182L）突变体中，其构型激活会降低MoCHS1的表达并减弱致病性，而在MoTem1-DN（T137N）突变体中，显性负调控则与MoCHS1表达升高和更高的致病性反应相关，导致坏死阶段的病变更大（Yang等人，2019年）。

讨论
作为有丝分裂退出网络（MEN）的核心组成部分，小GTP酶Tem1对于酿酒酵母（S. cerevisiae）的细胞分裂至关重要，它协调纺锤体定位和细胞周期的进展（Scarfone和Piatti，2015年）。它在F. graminearum中也具有类似的作用（Miao等人，2023年）。在这项研究中，我们将MoTem1鉴定为稻瘟病菌（M. oryzae）中与酵母和F. graminearum Tem1功能相同的蛋白，并阐明了其在有丝分裂准确性、抗逆性和致病性中的作用。我们的发现表明，MoTem1影响核分离、营养生长、抗逆性以及致病性，它作为一个上游调控节点，将细胞周期调控和生长与生物和非生物环境的相互作用联系起来，这种作用类似于MoIsw2的调控方式（Pei等人，2024年）。

Tem1定位的进化保守性和差异
小GTP酶Tem1在包括酿酒酵母（S. cerevisiae）、S. pombe和F. graminearum在内的多种真菌中表现出保守的纺锤体极体（SPB）定位特性，它调节细胞周期的进展（Sohrmann等人，1998年；Valerio-Santiago和Monje-Casas，2011年；Milne等人，2014年；Fukada和Kubo，2015年；Miao等人，2023年）。此外，只有激活状态的Tem1才能定位在SPB中，换句话说，SPB只招募处于激活状态的Tem1（Zhou等人，2024年）。在稻瘟病菌（M. oryzae）中，MoTem1同样定位于菌丝和分生孢子的SPB上，其活性状态MoTem1CA显示出更高的SPB富集，而非活性状态MoTem1DN则在细胞质中分散分布（图4E）。这种依赖于GTP的SPB招募机制与S. pombe的Spg1动态相似（Schmidt等人，1997年），但与F. graminearum不同，后者中非活性的FgTem1定位于隔膜上（Miao等人，2023年）。值得注意的是，非活性的MoTem1菌株缺乏对隔膜的定位能力，同样地，Ashbya gossypii的非活性AgTem1菌株也是如此（Finlayson等人，2011年），这表明MEN调控过程中存在谱系特异性的适应。这些发现突显了Tem1在有丝分裂控制中的保守作用，同时也强调了物种特异性的定位机制，这些机制可能反映了在生长和感染过程中不同的功能，进一步表明丝状真菌中核分裂与不同菌丝和分生孢子区室的分离之间的联系比酵母的母细胞和子细胞分离更为松散。

MEN调控中的SPOC执行和GAP复合体功能
纺锤体位置检查点（SPOC）通过延迟MEN的激活直到纺锤体对齐得到正确排列来保障有丝分裂的准确性（Falk等人，2016年）。这一过程的核心是Bfa1-Bub2 GAP复合体，它水解与Tem1结合的GTP以强制有丝分裂停止（Scarfone和Piatti，2015年）。在稻瘟病菌（M. oryzae）中，MoBfa1与活性和非活性的MoTem1都相互作用，而MoBub2仅与GTP结合的形式结合（图1B、C、D）。这与酿酒酵母的情况相似，在那里Bfa1支持Bub2-Tem1的相互作用，尽管GAP活性较低（Wang等人，2000年；Geymonat等人，2002年）。我们提出MoBfa1在空间上将MoBub2限制在MoTem1附近，从而在细胞分裂后迅速终止细胞周期信号传导。有趣的是，酵母ScBfa1的N端结构域能够独立于GAP活性调节SPOC，通过阻断Tem1与SPB的结合（Li和Song，2022年）。类似地，MoBfa1与非活性MoTem1的持续相互作用表明其具有双重作用：一方面用于MEN调控，另一方面通过结构基序促使SPOC的启动。这些机制共同确保了纺锤体定位和有丝分裂退出之间的精确协调，防止丝状真菌中的非整倍体现象。

核分离缺陷及其对致病性的影响
通过细胞分裂进行的核分离是细胞分裂的一个标志性过程，它受到MEN途径通过Tem1的严格调控（Walther和Wendland，2003年）。在C. albicans中，CaTem1缺失突变体会由于细胞分裂缺陷而表现出多核细胞（Milne等人，2014年）。同样，ΔMotem1突变体的菌丝组织中包含多达四个核，表明核分离缺陷严重，与野生型（WT）相比。值得注意的是，持续激活的MoTem1-CA菌株也表现出多核表型（图4E），这可能是由于MEN激活提前，绕过了纺锤体位置检查点（SPOC）的监控。这与Bub2缺失突变体的机制类似，后者也会导致多核细胞，因为Tem1的过度活性扰乱了有丝分裂的退出时间（Geymonat等人，2002年；Fukada等人，2019年）。然而，显性负调控的MoTem1-DN菌株在MEN途径失活的情况下仍保持正常的核计数（图4E）。然而，这与F. graminearum的情况类似，在那里引入非活性的FgTem1T118N可以修复ΔFgbub2突变体的隔膜形成缺陷（Miao等人，2023年）。因此，我们提出非活性的MoTem1在隔膜形成过程中招募了补偿性因子，从而规避了由MEN失调引起的真菌区室倍性异常（图4E）。这些发现共同表明，SPOC-MEN之间的相互作用在确保核准确性方面起着关键作用，同时反映了物种特定的定位机制，这些机制可能反映了生长和感染过程中的不同功能，也突显了丝状真菌中核分裂与不同菌丝和分生孢子区室分离之间的联系比酵母的母细胞和子细胞分离更为松散。

MoTem1活性状态对致病性的影响及其对几丁质合成酶调节的作用
ΔMotem1缺失菌株在病变数量上表现出轻微的致病性降低，这与F. graminearum ΔFgtem1突变体类似，其分生孢子仍能形成正常的附着器（Miao等人，2023年）。另一方面，缺失影响了病变的大小，这取决于真菌通过胞间连丝在相邻叶片细胞间的生物营养生长（Kankanala等人，2007年；Fernandez和Orth，2018年）。值得注意的是，MoTem1-DN表现出过度致病性，这可能是由于MEN途径的失活，这与C. albicans中CaCdc5调控致病性的方式相似（Bachewich等人，2003年；Scarfone和Piatti，2015年）。这种效应可能促进了菌丝生长，正如C. albicans中Tem1的失活所导致的那样（Milne等人，2014年）。在稻瘟病菌（M. oryzae）中，这种失活促进了侵袭性菌丝的生长，从而增加了病变的大小，因为病变扩展是已知直接影响致病性的特征（Zhang等人，2024年），这也解释了为什么MoTem1-DN显示的病变比Guy11更大（图3A）。相反，MoTem1-CA由于MEN信号传导不受控制，损害了生长、孢子形成和致病性，这也在C. orbiculare、C. higginsianum和M. oryzae ΔMobub2突变体中观察到（Fukada和Kubo，2015年；Fukada等人，2019年）。

转录组学揭示了MoTem1状态对MoCHS1调控的下游间接效应，因为MoTem1-CA负向影响MoCHS1的表达，而MoTem1-DN则产生正向效应，导致过度致病性（图6A和B）。稻瘟病菌有七种已知的几丁质合成酶，其中MoCHS1（一种V类几丁质合成酶）是致病性所需的三种酶之一（Kong等人，2012年）。MoCHS1突变体缺乏分生孢子尖端的黏液，这对于分生孢子附着在叶片表面至关重要（Kong等人，2012年）。因此，在MoTem1-DN中增加这种黏液可能解释了其致病性增强的原因，使得感染更快地开始，并形成更大的病变（图3A）。用Polyoxin B抑制CHS证实了MoTem1-DN对MoCHS1表达的正面效应，因为其群体生长速率受到抑制，MoTem1-CA的生长抑制率为40.36±6.42%，而Guy11（WT）为4.89±1.29%，同时MoTem1-DN具有抗性（图6C和D）。CHS的抑制也证实了MoTem1-DN对MoCHS1表达的正面效应，因为其群体生长速率受到抑制，MoTem1-CA的生长抑制率为40.36±6.42%，而Guy11（WT）为4.89±1.29%，同时MoTem1-DN具有抗性（图6C和D）。MoCHS表达的差异明显体现在植物的免疫反应中，MoTem1-DN引起的反应最强，其次是Guy11，然后是MoTem1-CA。高且不平衡的MoChs1表达可能会释放更多的几丁质寡聚体，或者使真菌细胞壁的几丁质更多地暴露于植物的细胞外（质外）内几丁质酶（Sundin等人，1991年），产生被植物识别为PAMP的几丁质寡聚体，从而触发早期坏死阶段的形成。

我们总结了已知酵母和其他生物中Tem1的反应（Scarfone和Piatti，2015年；Falk等人，2016年；Ibrahim，2025年），并将其与我们在稻瘟病菌（M. oryzae）中发现的信号通路进行了比较（图7A和B）。简而言之，MoTem1的活性形式（CA或DN）对转录有深远影响，这些影响既包括抗逆性也包括致病性。其中一个主要影响是致病性，可能是通过调节MoChs1几丁质合成酶实现的（图6），后者对于真菌细胞壁的形成和作为已知PAMP的几丁质的释放至关重要，并对植物的先天免疫反应和ROS形成有强烈影响（图6E）。

图7
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将MoTem1介导的有丝分裂退出与应激适应和致病性联系起来。图7总结了酵母中与MEN相关的蛋白质从SPOC到细胞分裂的已知信号通路。当纺锤体排列不正确时，Kin4通过Bfa1激活MoTem1，使其从激活状态转变为非激活状态，从而保持MEN处于关闭状态。相反，当纺锤体排列正确时，Lte1抑制Kin4，cdc5抑制Bub2，使GAP复合体失效。同时，Lte1促进MoTem1从非激活状态转变为激活状态。激活的MoTem1启动信号向Cdc15、Dbf2-Mob1复合体和Cdc14的顺序传递，最终完成MEN和细胞分裂的启动。图8总结了稻瘟病菌（M. oryzae）中与MEN相关的蛋白质与应激反应以及致病性之间的相关性。首先，MoBub2的缺失阻止了MoTem1激活GTP酶活性，从而阻止其从激活状态转变为非激活状态，导致持续激活的状态（CA）。随后，MoTem1的缺失对其下游的MoCdc15、MoMob1、MoDbf2、MoCdc14产生影响，导致有丝分裂退出受损和缺乏反馈，使MoTem1持续处于激活状态（CA）。我们假设MoLte1或MoCdc5的缺失会导致GTP结合不足（GFF不足），而GAP活性保持不受抑制，从而导致持续的非激活状态（DN）。这些持续激活和非激活的状态在稻瘟病菌（M. oryzae）中引发了转录重编程。具体来说，MoTem1的CA形式抑制MoCHS1的基因表达，而DN形式则促进其表达，MoCHS1的表达与应激反应和致病性呈正相关。

结论
总之，这项研究确立了MoTem1作为稻瘟病菌（M. oryzae）中有丝分裂退出网络（MEN）的全球上游调控因子，其功能状态直接和间接地影响着不同的细胞结果，很可能与上游的全球调控因子如MoIsw2协同作用，后者具有表观遗传调控效应，平衡生长与生物和非生物相互作用（Pei等人，2024年）。我们证明了GTP结合的（活性）MoTem1状态驱动MEN途径的激活，确保了精确的细胞分裂和通过菌丝隔膜进行的核分离，并且对其下游有直接和间接的调控作用，这对生长、抗逆性和致病性都很重要。

材料与方法
基因鉴定和系统发育树
通过使用S. cerevisiae的Tem1（ScTem1，NP_013647.1）和F. graminearum的FgTem1（Miao等人，2023年）作为查询，通过BLASTp同源性搜索在M. oryzae的70–15基因组（NCBI taxid: 242,507）中鉴定了MoTem1同源物（MoTem1，MGG_04862）。为了确定进化关系，使用MUSCLE从22个真菌分类单元（21个病原体）中检索并比对Tem1同源物。在MEGA v11.0版本中构建了最大似然系统发育树（Tamura、Stecher和Kumar，2021年）。访问号码和物种列在表S1中。

菌株构建
按照描述的方法进行了靶向基因缺失和补充（Chen等人，2023年）。生成ΔMotem1：扩增了约800 bp的5'和3'侧翼区域，并将其与hygromycin抗性 cassette（HYG）融合，然后通过聚乙二醇（PEG）介导的原生质体转化。在hygromycin（200 μg/mL）条件下筛选出初级转化体，并通过Southern blot验证。补充构建（1.5 kb的天然启动子+GFP+MoTEM1或突变等位基因）被克隆到pKNT中，再重新导入ΔMotem1中。通过共聚焦显微镜（Nikon A1，日本）确认GFP荧光。

对于过表达（OE）、持续激活（CA；Q182L）和显性负调控（DN；T137N）等位基因，将MoTem1变体克隆到pKNT-RP27中（Chen等人，2008年），然后转入Guy11中。通过RT-qPCR验证了表达MoTEM1、MoTEM1-Q182L或MoTEM1-T137N的菌株。引物序列见表S2。所使用的培养条件和其他菌株：M. oryzae野生型菌株Guy11作为生成以下突变体的背景：ΔMotem1（基因缺失）、MoTem1-OE（过表达）、MoTem1-CA（组成型活跃等位基因）和MoTem1-DN（显性负等位基因）。互补菌株MoTem1-OE、MoTem1-CA和MoTem1-DN均来源于ΔMotem1背景。除非另有说明，真菌菌株在26°C、40%相对湿度的黑暗条件下培养于完全培养基（CM II）中。大肠杆菌DH5α用于常规质粒扩增，BL21(DE3)用于重组蛋白表达，酿酒酵母AH109用于酵母双杂交分析。培养基成分和应用详细信息见表S3。

Southern印迹分析和逆转录定量PCR：Southern印迹方法参照Biregeya的研究（Biregeya等人，2022年）。基因组DNA用Hind III（Thermo Fisher）酶切，然后在0.8%琼脂糖上电泳，并转移到Hybond-N+膜（GE Healthcare）上。使用Roche DIG High Prime DNA标记和检测试剂盒，通过DIG标记的探针进行杂交。对于RT-qPCR，总RNA使用Promega Total RNA Kit（LS1040）提取，并使用Evo M-MLV RT Premix（AG11728）进行逆转录。后续的qPCR扩增和检测使用SYBR Green PRO Taq HS Premix（AG11701）在Bio-Rad CFX96系统上进行。MoACTIN（MGG_03982）作为内源性参考基因（Anjago等人，2022年）。相对表达通过2?ΔΔCT方法计算（Livak和Schmittgen，2001年）。

酵母双杂交（Y2H）和pull-down分析：Y2H相互作用使用Matchmaker Gold System（Clontech）进行。MoTem1-Q182L（诱饵）和MoTem1-T137N（诱饵）被克隆到pGBKT7（BD）中，而假定的相互作用蛋白（MoBfa1 [MGG_03162]、MoBub2 [MGG_04676]）被克隆到pGADT7（AD）中。共转化的AH109细胞接种在SD/-Leu/-Trp和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp琼脂培养基上。在pull-down分析中，GST或His标签蛋白在BL21(DE3)（0.1 mM IPTG，16°C）中表达，并使用谷胱甘肽-琼脂糖珠进行亲和纯化（Smart-lifesciences）。结合复合物通过SDS-PAGE分离，并用抗-GST（1:5,000）和抗-His（1:3,000）抗体进行免疫印迹（Takara Bio）。信号使用Advansta WesternBright ECL和Tanon 5200成像系统检测。

生长和胁迫评估：径向生长在CM II（营养丰富）和最小培养基（MM；营养受限）上评估。对于胁迫分析，菌株接种在含有10 mM H2O2、0.1% Congo Red（CR）、0.01% SDS、1 M山梨醇、1 M NaCl或1 M KCl的培养基上。平板在26°C下培养7天，相对抑制率按照先前描述的方法计算（Biregeya等人，2022年）。为了进一步量化菌株对每种胁迫因子的敏感性，进行了剂量-反应分析以确定半最大抑制浓度（IC50）。每种胁迫因子的浓度梯度如下：H2O2为10、5、2.5和0 mM；Congo Red（CR）为0.1%、0.05%、0.025%和0%；SDS为0.01%、0.005%、0.0025%和0%；NaCl为1、0.5、0.25和0 mM。在26°C下培养7天后，按先前描述的方法计算每种浓度下的相对抑制率。然后使用GraphPad Prism 10软件进行非线性回归分析，应用“log[抑制剂] vs. 标准化反应-变量斜率”模型，计算每种菌株在每种胁迫条件下的IC50值。

分生孢子萌发和植物感染：从10天大的CM培养物中通过无菌水冲洗收集分生孢子，将含有分生孢子的洗液调整为1×10^4分生孢子/mL，并印在疏水性盖玻片上。萌发和附着器形成在接种后2-24小时（hpi）使用Nikon Eclipse Ni显微镜监测（Jiang等人，2024年）。对于植物感染，4周大的水稻幼苗（cv. CO39）以3×10^4分生孢子/mL的浓度喷雾接种。接种后的植物在26°C（>90%湿度）下培养5-7天。根据病斑大小，疾病严重程度分为5个等级：等级1（<0.05毫米）、等级2（0.05-0.2毫米）、等级3（0.2-0.3毫米）、等级4（0.3-0.4毫米）和等级5（>0.4毫米）（Chen等人，2023年）。

GTP酶活性分析：使用Microorganism GTPase ELISA Kit（REF: YJ921558）通过一步夹心酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定GTP酶活性。为了在不同条件下区分其功能，分别使用纯化蛋白在体外和从菌丝中提取的总蛋白在体内测量酶活性。对于体外GTP酶活性分析，使用5毫克纯化的GTP酶蛋白作为测试样本。对于体内GTP酶活性分析，使用从菌丝中提取的1毫克总蛋白作为样本。所有蛋白样本使用推荐的缓冲液稀释至适当浓度。具体检测步骤如下：将制备的样本和一系列已知浓度的标准溶液分别加入预先涂有GTP酶特异性抗体的微孔板中。随后加入辣根过氧化物酶（HRP）结合的检测抗体。孵育并彻底清洗后，加入底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）进行显色。TMB在过氧化物酶的催化下变为蓝色，加入酸性终止溶液后最终变为黄色。颜色的强度与样本中的GTP酶活性呈正相关。使用微孔板读取器在450 nm波长下测量每个孔的吸光度（OD值）。通过将OD值与标准曲线比较，计算样本中的GTP酶活性单位。

共聚焦显微镜观察：使用Nikon A1共聚焦显微镜分析亚细胞定位。EGFP/mCherry标记的菌株在CM II上培养，用4%甲醛固定，然后用60×油浸物镜成像。使用蓝光激发（EGFP）（氩激光488，激发滤光片：470/40，二色镜：495LP，屏障滤光片：515/30，EGFP与mCherry的相对亮度为100%）或绿光激发（mCherry）（He–Ne激光543，激发滤光片：560/55，二色镜：590LP，屏障滤光片：630/60，mCherry与EGFP的相对亮度为47%）获取Z堆栈（0.5 μm步长）。在26°C的CM II琼脂垫上进行活细胞成像，以2分钟间隔捕捉延时序列。图像使用NIS-Elements v5.21解卷积，并分析荧光强度和共定位。

转录组分析：从Guy11（野生型）、ΔMotem1、MoTem1-CA、MoTem1-DN和MoTem1-OE菌株（三重复）中提取RNA，进一步使用Qingke Biotechnology的Illumina NovaSeq 6000（150 bp PE）进行测序，并与M. oryzae 70–15基因组（HISAT2）对齐。进行差异表达（DESeq2；FDR<0.01，|log2FC|>2）和功能富集（KEGG/GO）分析。

植物先天免疫活性分析：检测M. oryzae菌株释放的几丁质衍生诱导剂对植物先天免疫反应的活性。首先将野生型和突变菌株在CM2平板上培养7天。切取相同面积的菌丝块，碎片化并接种到液体CM2培养基中进行摇瓶培养。当大约70–80%的菌丝团达到2–3毫米直径时，收集培养液。培养液通过0.22 μm膜过滤以获得无菌无细胞上清液（CFS）。对于几丁酶处理，使用两等份CFS（各100 μL）。一份加入20 μL几丁酶 stock溶液（Solarbio，Cat# C9331；10 mg/mL，pH 5.5的50 mM醋酸钠缓冲液），另一份则使用同样体积的缓冲液作为未处理对照，使每种反应的最终体积达到120 μL。几丁酶处理的样本在37°C下避光培养2小时后，然后在95°C下热失活10分钟。对照样本同样培养但不进行热失活步骤。所有样本在4°C下以14,000×g离心15分钟，收集上清液用于后续的活性氧（ROS）爆发分析。ROS的产生使用基于化学发光的方法测量。水稻叶片盘子在黑暗中预培养过夜后，放入白色96孔板中。每个孔中加入50 μL含有L-012（化学发光ROS探针）（Fujifilm，Cat# LCK-012；20 μM）和辣根过氧化物酶（Macklin，Cat# P8125；2.5 μg/mL）的检测溶液。在黑暗中平衡30分钟后，立即每分钟记录一次发光强度，持续40分钟，使用化学发光微孔板读取器。

统计分析：本研究的统计分析采用了严格的工作流程以确保测试的适当性。使用Shapiro–Wilk检验评估每组内的正态性。对于符合正态性假设的数据，通过Brown-Forsythe检验评估方差的同质性。如果两个假设都满足，则选择参数检验：两组比较的独立样本t检验，或涉及三个或更多组的单因素ANOVA和Dunnett’s事后检验。如果正态性或方差同质性假设中的任何一个被违反，则应用非参数检验：两组比较的Mann–Whitney U检验，或多组比较的Kruskal–Wallis检验和Dunn’s事后检验。所有分析的显著性水平设定为α=0.05。