解读病原体的进化过程：一项长达二十年的纵向研究揭示了病毒毒力的变化，并鉴定出能够有效对抗喜马拉雅小麦punktasia（Blumeria graminis f. sp. tritici）群体的持久性抗性基因

《Stress Biology》：Deciphering a pathogen’s evolution: a two-decade longitudinal study reveals virulence shifts and identifies durable Pm genes against Himalayan Blumeria graminis f. sp. tritici populations

　　摘要
小麦白粉病由专性生物寄生真菌Blumeria graminis f. sp. tritici（Bgt）引起，是一种极具破坏性的疾病，导致全球小麦产量大幅下降。宿主抗性是可持续的管理策略，但其效力不断受到病原体高进化潜力的削弱，这种潜力源于有性重组和快速突变。为了揭示长期的毒力动态，我们对喜马拉雅西北部地区的Bgt种群在两个十年间（1994–1998年和2015–2019年）进行了比较分析。利用九种不同的小麦品系对285个分离株进行了毒型分析，发现其毒力结构随时间发生了显著变化。虽然当代种群中每个分离株的平均毒力复杂度增加，表明其致病能力增强，但总体毒型多样性却降低了，这表明选择压力倾向于较少但更具侵袭性的毒系。Pm1a（毒力从6%增加到63%）和Pm8的毒力频率发生了显著变化，而Pm2、Pm3a和Pm3b的毒力显著下降。值得注意的是，Pm2和Pm4a基因在整个研究期间表现出完全且持久的有效性。我们的结果确定了这些基因作为稳定的抗性供体，并强调了Bgt种群持续适应的重要性。这项研究为设计持久的抗性基因结构提供了关键见解，同时也凸显了在病原体不断进化的情况下持续进行毒力监测的必要性。

引言
小麦白粉病是一种对小麦（Triticum aestivum L.）具有严重经济破坏性的叶部疾病，由专性生物寄生真菌Blumeria graminis f. sp. tritici（Bgt）引起，对全球小麦生产构成了重大且持续的威胁。疫情的严重程度及相应的作物损害程度因地区气候条件而异。来自各国具体评估的实证证据凸显了这一威胁的严峻性，数据显示俄罗斯的产量减少了35%，巴西减少了62%，中国减少了40%（Mehta 2014）。病原体压力与生产力损失之间存在明确的相关性，研究表明在中等感染情况下产量减少了13–34%，而在严重爆发时则增加到50–100%（Basandrai和Basandrai 2017；Basandrai等人2023）。进一步强调其广泛影响的是，在喜马拉雅西北部地区记录的产量损失范围为8.7%至41.3%（Rana等人2006）。产量的损失和品质的下降在很大程度上取决于感染时的生长阶段，早期感染会对籽粒产量和品质参数造成最显著的降低（Samobor等人2006）。在这种情况下，种植具有遗传抗性的品种被广泛认为是最实际、经济上可行且环境可持续的管理策略。然而，这种方法的长期有效性一直受到Bgt进化适应性的挑战。在印度喜马偕尔邦的温带地区（如IV区），病原体会完成其有性循环，形成子囊壳，成熟后释放含有活力子囊孢子的子囊（Sharma等人1990）。有性重组过程使病原体种群发生遗传多样化，促进了新型毒力组合的出现。此外，病原体产生大量无性孢子的能力增加了随机突变的可能性，使得能够在几个生长周期内迅速选择和传播能够克服宿主抗性的毒系。因此，部署具有单基因（垂直）抗性的品种会施加强烈的选择压力，这通常会加速优势致病菌株的出现，并导致毒力分离株的快速积累（Akhtar等人2011；Wu等人2019；Mehta等人2024, 2025）。持续监测病原体种群动态，包括毒力分析和跟踪时间变化，对于预测抗性失效和维持抗性品种的持久性至关重要（Zeng等人2014；Wu等人2019）。由于在印度西北平原区和北部山区广泛种植易感商业品种，以及先进育种系中也观察到了易感性（https://www.Aicrpwheatbarley.org/wp-content/uploads/2020/07/Crop-Protection-Report-2019-20_compressed.pdf），这一必要性尤为重要。目前印度缺乏针对Bgt抗性的系统化、有针对性的育种计划，因此迫切需要识别和表征针对现有毒力模式的有效抗性供体。为解决这一差距，本研究旨在描述喜马拉雅西北部不同农业气候区Bgt种群的毒力模式，并分析其毒力动态，从而为开发持久的抗性小麦品种提供宝贵见解。

结果
**1994–1998年Bgt种群的毒力结构**
1994至1998年间收集的215个Bgt分离株（155个孢子型；60个子囊孢子型）通过九种不同小麦品系的鉴定，分别划分为51和15个不同的毒型。在孢子型分离株中，来自Kukumseri地区（Lahaul和Spiti县）的P28毒型具有最广泛的毒力谱，能够克服九个测试抗性基因中的七个（Pm1a、Pm2、Pm3a、Pm3c、Pm5a、Pm6和Pm8）。其次是几种能够在六个Pm基因上致病的毒型（P27、P32、P33、P38、P41、P44、P62和P64），以及其他能够在五个Pm基因上致病的毒型（P29、P30、P31、P34、P39、P43和P49）。相比之下，来自Joginder Nagar地区（Mandi县）的P20孢子型对所有测试基因均无毒性。后续毒力最低的毒型（P21、P48、P54、P58和P63）来自Palampur和Simplan地区（Kangra县），每个毒型仅能克服一个基因（图1；表S1）。在子囊孢子型分离株中，来自Kukumseri地区（Lahaul和Spiti县）的P1a和P12a毒型显示出最高的毒力，每种毒型平均能克服六个抗性基因（P1a针对Pm2、Pm3a、Pm3c、Pm5a和Pm6；P12a针对Pm1a、Pm2、Pm3b、Pm3c、Pm4a和Pm5a）。下一个毒力最强的毒型是P3a（图1；表S1）。

**1994–1998年间不同小麦品系对B. graminis f. sp. tritici毒型的感染反应**（n=66）
图1显示了1994–1998年间喜马偕尔邦不同小麦品系对B. graminis f. sp. tritici毒型的感染反应。x轴表示不同小麦品系，y轴表示毒型。白色和灰色分别表示无毒性和毒性。P1-P15毒型来自子囊孢子型。

**2015–2019年Bgt种群的毒力结构**
2015–2019年间收集的70个Bgt分离株（45个孢子型，25个子囊孢子型）通过20种不同小麦品系的鉴定，确定了48个不同的毒型（25个孢子型；23个子囊孢子型）。孢子型分离株表现出广泛的毒力谱。Pt17（来自Chamba县Sarol）和Pt25（来自Kangra县Parour和Malan）是最具毒力的毒型，能够克服20个抗性基因中的15个（Pm1a、Pm1c、Pm3a、Pm3c、Pm3d、Pm3f、Pm4a、Pm5a、Pm6、Pm8、Pm10、Pm12、Pm17、Pm25、Pm 10+15和Pm5+？）。其次是Pt20和Pt44（能在14个基因上致病），以及Pt12、Pt14、Pt19和Pt23（能在13个基因上致病）。相比之下，来自Kangra县Palampur的Pt2、Pt4和Pt6（来自Lahaul和Spiti县的Kukumseri）是最无毒的孢子型，仅对8个基因具有敏感性（Pm3a、Pm3c、Pm3d、Pm3f、Pm5a、Pm6、Pm10、Pm12、Pm17和Pm 10+15）。来自Lahaul和Spiti县的Pt3（Dalang Maidan）和Pt6（Kukumseri）毒型能在9个基因上致病（图2；表S2）。在子囊孢子型分离株中，来自Lahaul和Spiti县Kukumseri的Pt44毒型表现出最高的毒力，能克服14个抗性基因。总体而言，孢子型来源的毒型具有更广泛的毒力谱（平均毒力谱：15个基因），而子囊孢子型来源的毒型则不然（图2；表S2）。

**2015–2019年间毒力多样性和种群分化的时间变化**
对九种不同小麦品系的比较分析显示毒力结构随时间发生了显著演变（图1和3）。根据材料和方法中的定义，每个分离株的平均毒力复杂度从1994–1998年的3.92增加到2015–2019年的4.61。2015–2019年的种群在毒型丰富度（表现为鉴定出的不同毒型数量与总分离株数量的比率）和均匀性（量化毒型频率分布的均衡性）上也更高（分别为0.316和0.820，而1994–1998年为0.306和0.756）（表1）。尽管平均毒力增加，但总体病原体种群多样性却降低了。1994–1998年的种群显示出更高的多样性，Simpson指数（Si=0.888）、标准化Shannon指数（Sh=3.085）和Kosman指数（KWm=0.420）的值也更高（而2015–2019年为Si=0.864、Sh=2.414、KWm=0.283）。Gleason指数的同时下降进一步支持了这一时间上的多样性减少（表1）。Hill数量分析也证实了这一趋势，所有多样性阶数的非重叠置信区间（q=0–2）都显示2015–2019年的种群多样性显著减少（图4）。三种应用的距离指标（Roger’s（R）、Kosman’s（KBm）和Mean Character Difference（MCD）都证实了两个时间段种群之间的显著遗传差异（表2）。 permutation multivariate analysis of variance（PERMANOVA）验证了毒力结构的差异具有统计学意义（R2=0.082，p<0.001）。此外，beta-dispersion测试表明2015–2019年种群内的多变量方差显著减少（平均差异=0.760，p<0.001）（表3）。主坐标分析（PCoA）从视觉上加强了这些结果，显示出不同年代的毒型形成了明显的聚类。前两个PCoA轴分别解释了24.94%和21.23%的毒力变异（图5）。1994–1998年的种群显示出更大的分散性，反映了更高的多样性，而2015–2019年的种群形成了更紧密的聚类，表明当代种群在遗传上更为同质（图5）。

**1994–1998年和2015–2019年间B. graminis f. sp. tritici毒型对不同小麦品系的感染反应**（n=9）
表1比较了1994–1998年和2015–19年间不同小麦品系上的B. graminis f. sp. tritici种群参数（n=9）。

**基于Hill数（q=0 {丰富度}、1 {Shannon熵指数的指数}和2 {Simpson浓度指数的倒数}的折射曲线**用于估计1994–1998年（n=66）和2015–19年（n=25）研究期间B. graminis f. sp. tritici种群的多样性（表2）。

**两个十年间B. graminis f. sp. tritici种群之间的遗传距离指标（Roger’s距离（R）、Kosman’s距离（KBm）和Mean Character Difference（MCD）**（表3）。

**两种时间段B. graminis f. sp. tritici种群之间的Pairwise PERMANOVA和Beta dispersion比较**（表3）。

**九个常见Pm基因（Pm1a、Pm2、Pm3a、Pm3b、Pm3c、Pm4a、Pm5a、Pm6、Pm8）的毒力共现比较**显示两个十年间存在显著的进化变化（表4）。这种转变的特点是显著的基因分离现象以及新的致病性组合的出现。最引人注目的是Pm3b-Pm8对，在1994至1998年间共出现频率为-25.8%，而在2015至2019年的菌群中完全消失了，代表了彻底的分离。其他显著的分离现象包括Pm2-Pm3c和Pm3b-Pm3c（各自为-19.7%）、Pm3b-Pm4a（-18.2%）以及Pm2-Pm5（-16.7%）。相反，分析显示出现了许多新的、正相关的致病性组合。共现频率增加最明显的是Pm5a-Pm8（+48.2%）、Pm3c-Pm8（+47.2%）和Pm3c-Pm5a（+45.2%）。其他组合，如Pm1a-Pm3c（+44.4%）和Pm1a-Pm5a（+38.9%），也显示出了新的、牢固的正相关联系。其余的基因对则保持了稳定的共现频率，表明在病原体群体中这种关联得以维持（表4）。表4展示了1994至1998年和2015至2019年间，B. graminis f. sp. tritici菌群在常见鉴别品系上的致病性共现和成对关联情况（n=9）。

Pm基因的抗性效果和致病性压力的时间变化分析显示，几个关键抗性基因的致病性频率在二十年间发生了显著的时间变化（图6）。Fisher精确检验确定了Pm1a、Pm2、Pm3b、Pm3c、Pm5a和Pm8存在统计学上的显著变化（p<0.05），而Pm3a、Pm4a和Pm6的致病性频率则保持不变（表5）。致病性压力指数（VPI）定义为随时间对特定Pm基因具有抗性的Bgt菌型比例相对于所有测试菌型的比例。最显著的VPI增加出现在Pm1a，表明对其兼容菌型的选择压力加剧，以及抗性侵蚀的风险增加。同样，Pm3c、Pm5a和Pm8在两个时期都保持了较高的VPI值。尽管Pm6的致病性频率变化没有统计学意义，但其VPI从0.39增加到0.69，表明存在潜在的抗性崩溃趋势（图6）。对抗性效果随时间的线性回归分析也证实了这种致病性压力增加的模式。基因Pm1a、Pm3c、Pm5a、Pm6和Pm8都表现出显著的负斜率（β?=-0.414、-0.344、-0.365、-0.206和-0.310），证实了它们的保护效果显著下降（表5）。相比之下，基因Pm2、Pm3b和Pm4a显示出持续较低的VPI和稳定的效果，表明它们对当前的Bgt菌群具有固有的耐受性（图6、图7、表5）。

讨论
由有性重组和无性突变共同驱动的Bgt的高进化潜力，不断挑战着小麦中种族特异性抗性基因的持久性（Pretorius等人，2000年）。抗性品种的大规模单一种植施加了强烈的选择压力，往往导致相应致病性的迅速出现以及随后的抗性崩溃（Parks等人，2008年；Paul等人，2000年；Basandrai和Basandrai，2017年；Wu等人，2019年；Xue等人，2021年；Basandrai等人，2023年）。我们的纵向研究比较了二十年间（1994至1998年和2015至2019年）在流行病学上重要的喜马拉雅西北地区的致病性调查，为这种共同进化的军备竞赛提供了独特的视角。研究结果揭示了病原体群体结构的显著变化、关键抗性基因的侵蚀以及新的致病性关联的出现，从而为未来的抗性管理提供了关键见解。我们的分析揭示了一个看似矛盾但实际上显著的趋势：尽管当代菌群中每个菌株的平均致病性复杂性有所增加，表明致病能力增强，但Bgt菌群的总体遗传多样性却下降了（Lalo?evic′等人，2022年）。这得到了关键多样性指数（Simpson指数、Shannon指数和Kosman指数）下降的支持，并通过Hill数置信区间的非重叠得到证实。这种模式表明发生了选择性清除，即少数高致病性、遗传上相似的菌型占据了主导地位，这可能是由于广泛种植遗传基础狭窄的品种所驱动的。这一发现与关于白粉病菌群中适应性强、致病性强的谱系克隆扩张的全球报告一致（Wu等人，2019年；Lalo?evi?等人，2022年）。两个时间段菌群的显著差异通过Roger距离和PERMANOVA得到了验证，证实了病原体群体随时间发生的根本性重构（Dreiseitl等人，2006年；Wang等人，2023年）。这种重构的一个关键方面是致病性基因的持续重新分配。我们观察到了先前相关联的致病性（如Pm3b-Pm8）的分离以及新的强效关联（如Pm5a-Pm8、Pm3c-Pm8）的形成。已建立关联的破坏可能反映了维持不必要的致病性因素所伴随的适应性成本，特别是如果相应的抗性基因已被停止使用（Paul等人，2000年；Kanwar，1993年）。相反，新的致病性簇的出现代表了一种明确的适应性反应，可能使病原体能够克服堆叠的抗性基因。从育种的角度来看，分离的基因对是进行基因堆叠的有希望候选者，因为病原体可能难以同时重组这些致病性。

VPI和抗性效果的时间分析直接评估了抗性基因的持久性。我们的数据清楚地表明了几种广泛使用的基因的侵蚀。Pm1a和Pm6的VPI迅速增加，加上Pm3c、Pm5a和Pm8持续面临的高压力，进一步体现在它们效果随时间的显著下降上。Pm3c、Pm5a和Pm8在喜马偕尔邦的广泛使用直接导致了这一现象。这些基因由于与叶锈病（Lr26）和黄锈病（Yr9）抗性基因的紧密关联，常常无意中被引入到流行的小麦品种中（Basandrai等人，2016年）。携带Pm8/Lr26/Yr9基因复合体的品种（PBW-343、HS-240、HPW-284、HD-2967、DPW 50、HS 507、HS 542和HS 562）在NWPZ和NHZ的大规模种植，导致针对Pm8的致病性频率急剧增加。这一频率从20世纪90年代初的<10%（Sharma等人，1990年；Sharma和Singh，1990a、1990b）在十年内增加到>50%（Paul等人，2000年），并在当前研究中超过了80%。这种模式在过去三十年中通过全国范围内种植的Kalyansona和Sonora（Pm3c）等品种得到了加强，许多品种携带Lr26/Yr9（例如PB343、HPW-42、HS 240、HS 277、HUW 206、K 8804、HW 318、MACS 2496、VL 738、UP 2338、WH-542、VL 829、VL 907）或Lr23（例如HPW-251、HD-2967、WH 1021、K 8027、GW 322、HD 2285、HS 295、PBW 154）得到了进一步巩固（Bhardwaj，2011年；匿名者，2014年）。这些品种的长期广泛种植对Bgt菌群施加了强烈的定向选择，导致印度各地针对这些基因的致病性几乎固定（Bahadur和Aggarwal，1997年；Paul等人，2000年；Basandrai等人，2003年、2016年；Mehta等人，2024年、2025年）。Basandrai等人（2003年）记录了这一变化，指出Pm3a、Pm3c、Pm3e、Pm3f、Pm5和Pm6的致病性普遍存在，而Pm1、Pm2、Pm4a和Pm2+6的致病性仍然罕见。Pm1a和Pm6在北印度的增加也与它们在广泛种植的品种中的使用直接相关，例如HS-542、DBW-179、WH-1181、HPBW 01和DDK-1051（Mehta等人，2025年）。这些基因被纳入易感宿主群体的遗传背景中，为能够克服它们的病原体基因型提供了强大的选择优势，推动了相应致病性频率的增加。

相比之下，Pm2、Pm3b和Pm4a表现出显著的持久性，二十年来的VPI保持较低，效果稳定。Pm2和Pm4a对喜马拉雅Bgt菌群的持续有效性也在埃及和匈牙利的研究中得到证实（Abdelrhim等人，2018年；Szungics等人，2001年），使它们成为未来育种计划的有希望候选者。Pm2和Pm4a的组合被证明非常稳健，显示出增强持久性的协同效应（Moustafa等人，2016年；Abdelrhim等人，2018年）。早先在喜马偕尔邦和旁遮普邦（印度）的研究也记录了这些基因非常低的致病性（Sharma和Singh，1990a、1990b；Sharma等人，1990年；Paul等人，2000年）。

结论
总之，这项为期二十年的研究强调了Bgt的无情适应性和单基因抗性的固有脆弱性。观察到的基因向更高个体致病性的转变以及更低群体多样性的趋势，突显了病原体群体正在经历适应性优化。Pm1a、Pm6和Pm8的侵蚀是一个关键警告，提醒我们不要过度依赖单一的、广泛使用的基因。相反，被确认为持久的抗性来源，特别是Pm2和Pm4a，为未来的育种计划提供了明确的方向。此外，2015至2019年间Pm1c、Pm3b、Pm2+Mld和Pm1+2+9+12的有效性表明了它们在育种计划中的潜在用途。因此，我们建议根据持续的、区域特定的致病性监测，战略性地将这些经过验证的、持久的基因与其他有效来源进行堆叠。这种动态和多样化的方法对于开发抗逆性强的小麦品种以及确保喜马拉雅地区及以外地区白粉病的长期可持续管理至关重要。

材料与方法
研究概述和时间框架
本研究旨在描述2015至2019年间收集的Bgt菌群的致病性结构，并通过将其与1994至1998年的致病性数据集进行比较来分析其时间序列动态。

病原体分离物的收集
两个研究时期共分析了285个Bgt分离物。当代群体（2015至2019年）包括70个单菌落分离物（45个分生孢子型；25个子囊孢子型），而历史群体（1994至1998年）包括215个分离物（155个分生孢子型；60个子囊孢子型）。分离物来自印度喜马拉雅西北部主要小麦种植区的农业气候区。采样地点包括Lahaul和Spiti（Dalang Maidan和Kukumseri）、Kangra、Bilaspur、Una、Chamba、Shimla和Hamirpur（图8；表S3和S4）。子囊孢子型分离物是从Dalang Maidan和Kukumseri的干燥温带区的子囊壳（cleistothecia）中获得的。这些子实体在实验室中成熟以诱导子囊孢子的释放，从而建立分离物。

图8显示了1994至1998年和2015至2019年间在喜马拉雅西北部不同农业气候区收集小麦白粉病样本的采样地点地理分布。

分生孢子型分离物
从田间收集表现出白粉病症状的叶片或穗。在实验室中，将具有活跃孢子形成的叶片片段放在含有2%水的琼脂培养基的培养皿上。在无菌条件下，使用消毒的驼毛刷将不同菌落的孢子单独转移到十四天大的敏感品种'Agra Local'或'Lehmi'的幼苗上（图9A）。每个Bgt分离物在防孢子隔离室中繁殖并维持，每15-20天在新鲜敏感幼苗上更新接种物。1994至1998年间存活和维持的分生孢子型分离物总数为155个，2015至2019年间为45个。

图9显示了分离（a）分生孢子型和（b）子囊孢子型B. graminis f. sp. tritici的方法。

子囊孢子型分离物的收集
从喜马拉雅邦（Lahaul和Spiti地区的Dalang Maidan和Kukumseri）的干燥温带区收集带有子囊壳的叶片。将单独的子囊壳从这些果实体上切除并放在湿润的吸水纸上，然后将吸水纸倒置在装有十四天大的敏感品种（Lehmi和Agra Local）幼苗的玻璃罩上，以捕获释放的子囊孢子。通过吸水纸保持子囊壳的水分。从第四天开始监测子囊孢子的释放（图9B）。在子囊孢子释放后七天观察到真菌菌落的发育，随后通过将孢子转移到新鲜幼苗上来纯化分离的菌落，以实现大规模生产。1994至1998年和2015至2019年分别获得了60个和25个子囊孢子型分离物。

致病性表型和病原体变异
使用一组国际白粉病鉴别品系（Pm品系）评估了Bgt分离物的致病性谱。这些品系包括在'Chancellor'背景下近乎同源的品系（NILs）和抗性品种，来自印度卡纳尔的小麦和大麦研究所（IIWBR）、墨西哥的国际玉米和小麦改良中心（CIMMYT）以及旁遮普农业大学（PAU）。表6提供了这些鉴别品系及其对应的Pm基因的详细列表，以及它们在各个研究时期的使用情况。表6 用于鉴定小麦白粉病（B. graminis f. sp. tritici）分离株毒力的差异品系（2015–2019年和1994–1998年）

**全尺寸表格**
**苗期试验、接种和病害评估**
根据既定方案（Basandrai等人，2016年），培养了差异品系及敏感对照品系（Agra Local和Lehmi）的幼苗，进行接种并培养。接种后10天，使用修改后的‘0–4’等级（Smith和Blair，1950年）记录每个差异品系的感染类型（IT）。感染类型为0–2的分离株被认为是无毒力的，而感染类型为3–4的分离株（图10）被归类为有毒力的（Si等人，1987年）。后续的定量分析中，将宿主反应二值编码：抗性反应（IT 0–2）编码为‘0’，敏感反应（IT 3–4）编码为‘1’（Wu等人，2019年）。这个二值矩阵被用来构建毒力谱图以及所有的后续统计计算。

**图10**
该图像的替代文本可能是通过人工智能生成的。
**全尺寸图片**
**小麦白粉病（B. graminis f. sp. tritici）在差异品系上的代表性感染类型；(a-b) 抗性反应（无病害），(c) 敏感反应（大量产孢）**

**统计分析**
使用一组在两个研究时期（1994–1998年和2015–2019年）中表现一致的九个差异品系（Pm基因）进行了比较毒力分析。计算了关键群体参数，包括毒力频率、毒力复杂性、相对毒力复杂性、病原型数量、丰富度和均匀度。特定Pm基因的毒力频率定义为在该差异品系上表现出毒力的分离株比例。对于每个分离株，毒力复杂性计算为表现出毒力的差异品系数量，因此数值范围为1到20。相应的相对毒力复杂性值范围为0到1（Lalo?evi?等人，2022年）。这个相对指标是根据每条差异品系的毒力复杂性得出的（Kosman，2003年），随后计算每个分离株的平均值（Dreiseitl等人，2006年）。病原型丰富度表示为检测到的不同病原型数量与总分离株数量之比。病原型均匀度用于量化病原型频率分布的均衡程度，较高的值表明分布更为平衡。为了评估群体结构的时间变化，使用了多样性指标和分化指标。基于病原型的多样性使用标准化的Shannon指数（Sh）和Simpson指数（Si）进行量化，而分化程度则通过Roger距离（R）来衡量。此外，还使用Kosman的多样性（KWm）和距离（KBm）指数评估了全面的遗传多样性和成对距离，这些指数结合了病原型身份和多基因位点毒力数据（Kosman等人，2008年）。所有描述性参数和这些多样性指数的分析都是使用Vatue Analysis Tool（VAT）软件（Kosman等人，2008年）进行的。为了对病原型多样性进行稳健的多维度比较，计算了三个阶数的Hill数：q=0（相当于物种丰富度），q=1（Shannon熵指数的指数），q=2（Simpson集中度指数的倒数）。为这些估计生成了置信区间，以便在两个时间群体的之间进行统计比较（Chao等人，2014年；Batista等人，2023年）。这项分析是使用R Studio（v4.0.1）中的iNEXT包进行的。

**毒力关联和群体变化分析**
分析了九个常见Pm基因之间的毒力关联的时间变化。对于每个群体（1994–1998年和2015–2019年），构建了一个二值毒力矩阵，将无毒力（抗性）反应编码为‘0’，将有毒力（敏感）反应编码为‘1’。然后量化了所有基因组合的成对毒力共现情况，即同时具有基因A和B毒力的病原型百分比与总病原型数量之比。为了识别关联性的进化变化，计算了每个基因对在两个时期之间的共现百分比变化：变化共现百分比（%）= 2015–2019年的共现——1994–1998年的共现。根据这一指标，基因对被分类如下：变化值为负的被归类为分离，变化值接近零的被归类为稳定，变化值为正的被归类为新关联。

**多元统计分析**
进行了多元分析，以评估两个时间群体之间毒力结构的总体差异。基于Jaccard距离矩阵进行了主坐标分析（PCoA），以可视化病原型的整体分布和聚类。使用beta-分散检验测试了每个群体的多元分散（方差）的均匀性。为了统计检验毒力谱中心点的差异，使用‘adonis’函数进行了999次排列的置换多元方差分析（PERMANOVA），以检验两个时间期间毒力谱中心点的显著差异。这两个多元分析都是使用vegan包（Oksanen等人，2020年）进行的，可视化结果使用ggplot2（Wickham，2016年）生成。

**毒力压力和抗性持久性**
统计评估了抗性基因的时间持久性和病原体的选择压力。计算了毒力压力指数（VPI），以估计病原体群体对每个基因随时间施加的选择压力。它是通过将特定基因上的有毒力病原型数量除以研究期间检测到的总病原型数量来计算的。VPI的值范围从0（无毒力）到1（完全毒力）。同时，通过将基因的平均效力得分作为响应变量，时间作为预测变量，拟合线性回归模型来评估每个基因的持久性。回归斜率作为持久性指标：斜率非显著或为正的基因被归类为‘持久’，斜率为显著的负值则被归类为‘失效’。