了解在搅拌罐式和摇摆运动型生物反应器中黑曲霉（Aspergillus niger）菌群的异质性

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Understanding pellet population heterogeneity of Aspergillus niger in stirred tank and rocking motion bioreactors

　　**摘要**

丝状真菌黑曲霉（Aspergillus niger）是生物技术领域中成熟的细胞工厂。其生产效率依赖于宏观形态的发展，而这一过程目前仍难以控制，部分原因是种子培养与反应器特定剪切力条件之间的关系尚未得到系统研究。本研究探讨了在高剪切力和低剪切力条件下，颗粒在搅拌罐反应器（STR，高剪切环境）及摇摆运动生物反应器（RMB，低剪切环境）中的微观与宏观形态变化。实验使用了初始颗粒大小不同的黑曲霉菌种培养物，分别接种到STR和RMB中进行批量培养。培养条件基本相同，主要区别在于剪切力的不同。通过二维和三维图像分析，研究人员能够根据颗粒内部结构将颗粒分为三类。颗粒的分布受种子培养的宏观形态和反应器类型的影响。在STR的高剪切力下，颗粒在搅拌器启动后很快就会破碎，平均直径限制在500–600微米，并形成均匀的群体；相比之下，RMB中的颗粒保持了初始形态，能够形成较大颗粒（中位数直径约800微米），并促进颗粒融合，从而形成宏观形态更复杂的群体。值得注意的是，葡萄糖的吸收速率与颗粒的表面积与体积比相关：在STR条件下，葡萄糖消耗更快，但生物量产量较低，蛋白质分泌量较高。柠檬酸的产生量在两种反应器中均可检测到，但仅在接种了颗粒结构疏松的菌种培养物的情况下出现。总体而言，本研究揭示了剪切力条件和种子培养形态如何共同影响颗粒结构、群体异质性和放大过程中的生产效率。这种对形态变化的全面理解对于优化生物工艺和未来的预测建模方法至关重要。

**关键词**
• 在不同剪切力环境中对特定种子培养物的二维/三维分析
• 高剪切力限制并使颗粒均匀化，而低剪切力保持颗粒异质性
• 最高的柠檬酸和总蛋白质含量出现在较小、更紧凑的颗粒中

**引言**

黑曲霉的淹没培养在生物技术应用中广泛应用，范围从废物处理到药物化合物、酶和有机酸的生产（Meyer等人，2020年；El Enshasy，2022年）。尽管应用广泛，但控制黑曲霉的宏观形态仍然是确保多种产品生产线一致生产效率的挑战（Cairns等人，2021年；El Enshasy，2022年）。黑曲霉在淹没培养中可形成三种不同的形态：(i) 直径可达数毫米的近似球形颗粒；(ii) 全部分散的菌丝体；(iii) 由松散菌丝缠结形成的团块（Cairns等人，2022年；Meyer等人，2021年；Müller等人，2022年）。这些可见的形态被称为宏观形态，可在颗粒或培养物水平上观察到。当从菌丝水平研究其丝状发育时，使用“微观形态”一词，强调更细微的结构细节，如总菌丝长度和菌丝顶端数量（Dinius等人，2023年）。黑曲霉多样宏观形态的形成被认为是由孢子聚集、随后顶生菌丝的生长和分支在微观尺度上控制的（Cairns等人，2022年；Engelbert等人，2025年）。这种相互作用可能与较大真菌实体之间的相互作用以及它们与生物反应器系统在宏观尺度上的互动有关（B?l等人，2021年）。这种相互作用可能导致形态上的异质性，这可能有利于其在自然环境中的适应，但在工业生物过程中通常被视为不利因素（Zacchetti等人，2018年）。因此，从微观和宏观两个层面研究黑曲霉的形态将有助于全面理解过程性能优化（Müller等人，2023年）。黑曲霉的宏观形态影响培养液的流变特性，进而影响功率输入，进而影响淹没培养中的体积氧气传递和营养物质混合（Veiter等人，2018年）。分散生长导致非牛顿流体特性，给混合和质量传递带来挑战，而颗粒化培养则表现出更接近牛顿流体的行为（Wucherpfennig等人，2013年）。另一方面，颗粒内的氧气和营养物质扩散受其直径和紧凑性的影响（Schmideder等人，2019b；Deffur等人，2024年）。最近使用微电极和X射线显微断层扫描技术测量发现，外层菌丝密度较高的颗粒具有90–290微米的氧气渗透深度，证明该区域具有代谢活性（Deffur等人，2024年）。因此，为了减少颗粒内的质量传递限制，尤其是在较大规模下，通常更倾向于使用小颗粒形态（Lin等人，2010年）。黑曲霉的宏观形态最终被认为在生长中起关键作用，这反过来又会影响代谢产物的生产和细胞的生产效率（Cairns等人，2019b；Dinius等人，2024年）。据报道，多种因素会影响宏观形态，包括孢子浓度（Li等人，2022年；Engelbert等人，2025年）、氮源（Ikram-Ul-Haq等人，2005年；Li等人，2022年）、pH值（Colin等人，2013年；Buffo等人，2021年）、渗透压（Dittmann等人，2019年；Tesche等人，2019年）和剪切力条件（Kelly等人，2004年；B?l等人，2021年）。然而，实现某些形态的理想控制条件具有挑战性，尤其是在跨尺度转移培养物时（Meyer等人，2021年）。近年来，微粒的应用（通常称为微粒强化培养，Laible等人，2021年）已成为改变具有凝结孢子的颗粒形成真菌宏观形态的可靠方法（Walisko等人，2012年；B?l等人，2021年；Engelbert等人，2025年）。研究表明，添加高达10克/升的滑石粉能有效控制黑曲霉在低剪切力环境下的宏观形态，尤其是颗粒直径（Kurt等人，2018年；Kheirkhah等人，2023年）。这在二维摇摆运动生物反应器（RMB）中的受控培养条件下得以实现，该反应器无需搅拌器即可进行混合。这类生物反应器通常用于单个使用生物工艺中的种子培养和生产规模的扩大（Junne和Neubauer，2018年）。

剪切力条件被认为是影响黑曲霉宏观形态的关键因素之一（Kunz和King，2022年）。在常用于黑曲霉生产的搅拌罐反应器（STR）中，需要较高的搅拌速率以确保足够的气体-质量传递和混合。剧烈的搅拌和通气会导致菌丝体承受较高的剪切力，可能引起菌丝断裂和颗粒破碎。单个菌丝的破坏会在微观尺度上影响形态，而强烈的破坏也会影响宏观形态，例如降低颗粒的完整性（Kelly等人，2006年）。反过来，菌丝的聚集和颗粒破碎会直接影响宏观形态（Müller等人，2022年）。与STR不同，RMB的剪切力与常规摇培养相似（Kheirkhah等人，2023年）。研究表明，具有垂直和水平运动的二维摇摆运动生物反应器能够在保持低剪切力的同时提供足够高的气体-质量传递率。在这种系统中，功率输入取决于摇摆角度和速度，估计约为35瓦特/立方米（典型操作条件下的水）（Seidel等人，2022年），大约是STR中功率输入的10–20%（Montes-Serrano等人，2023年）。尽管剪切力较低，RMB仍可实现高达600小时?1的体积气体-质量传递系数（kLa）（Junne等人，2013年；Seidel等人，2022年）。在实验室规模的STR中，在较低的剪切力条件下实现这样的kLa值是不可行的，因为所需的搅拌速率（功率输入）将不足（Kheirkhah等人，2023年）。

长期以来，评估不同培养条件下的宏观形态依赖于多种成熟的分析工具（Krull等人，2013年）。通常通过半自动化分析来检查培养物的图像，从而量化某些宏观结构，如颗粒直径（Cairns等人，2019a；Müller等人，2022年）。最近，提出了使用基于X射线的微计算机断层扫描（μ-CT）（Schmideder等人，2019a）或高通量同步辐射微计算机断层扫描（SR-μ-CT）（Müller等人，2023年）等创新技术进行微观形态分析。这些技术能够分析真菌颗粒的三维微观结构，为理解颗粒内部结构和外部参数对过程性能的影响提供了全新的视角。利用SR-μ-CT，我们首次建立了基于颗粒内部结构的分类系统，即颗粒内菌丝网络的三维空间组织和分布（Engelbert等人，2025年）。简而言之，这表明：早期生长阶段孢子的聚集形成了以中心孢子团为核向外均匀生长的颗粒（I类），而II类颗粒是在后期生长阶段由多个孢子团附着形成的。III类颗粒则由成熟颗粒和颗粒碎片组成，由松散缠结的菌丝形成，通常具有高度不规则的非球形。

本研究有两个主要目标：首先，量化黑曲霉菌种培养物中平均颗粒直径对后续生物反应器培养中形态发展的影响；其次，确定高剪切力和低剪切力培养条件下的形态差异。为此，从添加了1克/升或10克/升滑石粉的摇培养物中获得了具有不同颗粒群体的菌种培养物。反应器在其他条件相同的培养模式下运行，主要区别在于STR的机械剪切力高于RMB。所得颗粒通过二维和三维图像分析进行了详细研究，直至菌丝级别。最后，评估了形态差异对整体过程性能的影响，包括生长参数以及两种主要应用于工业生物技术的产物：分泌蛋白和柠檬酸。据我们所知，这是首次结合受控的种子培养异质性和定量二维及三维形态分析，系统比较反应器特定剪切环境对真菌颗粒影响的的研究。

**材料与方法**

**菌株和孢子溶液制备**
本研究使用了Richter等人（2014年）构建的重组黑曲霉菌株?V4.10（可根据请求从通讯作者处获得）。固体琼脂接种孢子后，在30℃下于固体完全培养基（CM）中培养5天（Meyer等人，2010年）。孢子溶液的采集和制备按照Kheirkhah（2023年）的方法在培养当天进行。

**种子培养物接种液制备**
为了制备接种液，将黑曲霉孢子（5×10^6孢子/毫升）在未装搅拌器的烧瓶（250毫升）中培养12小时或24小时，同时添加1克/升或10克/升的滑石粉，搅拌速度为150转/分钟（Engelbert等人，2025年）。在指数生长阶段（12小时）收集生物量，使用小孔折叠滤膜在无菌条件下进行过滤，并用标准盐培养基MM洗涤。MM的成分包括（每升）：4.5克NH4Cl、1.5克KH2PO4、0.5克KCl、0.5克MgSO4·7H2O、0.1%（体积比）Vishniac微量元素储备溶液和8克葡萄糖（J?rgensen等人，2010年）。湿生物量称重后分为两份，在无菌条件下每份含200克湿重（0.4%（重量百分比）接种比例），连同定义好的液体体积（750毫升）MM一起转移到生物反应器接种瓶中。

**生物反应器培养**
淹没培养在7.5升BioFlo310生物反应器（New Brunswick Scientific，美国）和20升二维摇摆运动生物反应器CELL-tainer? CT20（Celltainer Biotech，荷兰Winterswijk）中进行。培养设置的详细信息已在前文提及（J?rgensen等人，2010年；Kurt等人，2018年；Kheirkhah等人，2023年）。简而言之，两种反应器均使用初始浓度为8克/升的葡萄糖和5升MM进行培养。所有组件均在121℃下高压灭菌至少20分钟。在接种之前，使用1 M HCl将培养基的pH值调整为3.0，并在整个培养过程中通过自动添加2 M NaOH来保持该值恒定。生物反应器同时接种了从接种瓶中新鲜收集的种子培养物。所有连接管的开口都足够大（4毫米），以避免颗粒变形。两个生物反应器的操作温度均为30°C，充氧率为5 L min?1（1 vvm）。对于RMB反应器，通过控制摇床速度在DO-rpm模式下运行，通过调节摇床速度（最低速度为15 rpm，最高速度为35 rpm）来维持溶解氧水平在饱和度的40%以上（见补充材料1）。对于STR反应器，接种后立即将搅拌器速度设定为恒定的750 rpm。每个反应器每两小时取样一次。在STR反应器中，搅拌器启动后还额外取样一次用于形态学分析。每个生物反应器的培养都进行了两次生物学重复实验，分别记为A和B。

### 分析方法

#### 细胞干重测定
将15 mL的培养液通过预先称重的Whatman?滤纸（编号41，WHA1441047，Whatman PLC，Keene，NH）过滤，使用真空泵进行过滤。滤液被分离出来用于代谢物分析。然后使用去矿物质水清洗滤纸上的颗粒。细胞干重（CDW）的测量方法之前由Fiedler等人（2018年）和Kheirkhah等人（2023年）针对STR和RMB培养物分别描述过。每个样本的CDW测定结果进行了三次重复实验。报告的CDW包括颗粒内的总生物量和残留的滑石粉，因为滑石粉颗粒无法与生物量定量分离。根据接种条件和培养过程中干重的相对增加，预计滑石粉的贡献可以忽略不计。

#### 上清液中的葡萄糖、柠檬酸和总蛋白测定
葡萄糖和柠檬酸的浓度使用Agilent 1200高效液相色谱（HPLC）系统（Agilent Technologies，Waldbronn，德国）进行测定，该系统配备折射率检测器和HyperRez? XP碳水化合物H+柱（300 × 7.7 mm，8 μm，Thermo Fisher Scientific，Schwerte，德国），以0.1 M H2SO4作为洗脱液，流速为0.6 mL min?1，温度为65°C。总蛋白的定量使用Bradford试剂盒（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，美国）进行，至少进行了两次技术重复实验。牛血清白蛋白被用作标准蛋白。

#### 宏观形态特征分析
通过将15 μL的培养液转移到显微载玻片上，并使用Leica DM 5000 CS（Leica Microsystems，Wetzlar，德国）差示干涉对比（DIC）显微镜，在高倍率下观察种子培养物的颗粒形成过程。所有进一步用于分析宏观形态（2D）的图像都是使用连接到Leica MC120 HD相机的Leica S8APO立体显微镜获得的。将一定量的培养液和生理盐水溶液（0.89% (w v?1) NaCl）以及2 μL的50% (v v?1) Tween? 20（Sigma-Aldrich/Merck，Darmstadt，德国）倒入空白培养皿中，以防止颗粒进一步聚集。溶液轻轻搅拌后，按照之前描述的方法（Müller等人，2022年）拍照。含有1 g L?1滑石粉的种子培养物的颗粒和孢子在图像中被识别出来。然而，对于含有10 g L?1滑石粉的颗粒，准确识别颗粒内的孢子聚集体比较困难，一些颗粒边界由于局部阈值分割而被误判。因此，这些图像使用了我们之前描述的适应性图像处理方法（Engelbert等人，2025年）进行分析，该方法根据颗粒的形态进行分割，而不检测孢子聚集体。不同时间点的颗粒直径分布使用Mann–Whitney U检验进行统计比较。分散的菌丝体使用我们之前描述的方法检测出来（Müller等人，2022年）。

#### 微观形态特征分析
对于微观形态分析，首先将重复实验A中的颗粒冷冻干燥，然后按照这里描述的程序进行处理（Schmideder等人，2019a）。冷冻干燥后的颗粒使用基于同步辐射的微计算机断层扫描（SR-μ-CT）进行分析，如我们最近的研究（Müller等人，2023年）中所述。

### 结果
假设种子培养物的形态会影响后续的生物反应器培养。因此，在摇瓶中进行了初步筛选，以找到最佳的种子培养条件。A. niger在48种不同的培养条件下进行了三次重复实验，24小时后使用调整后的自动化图像分析工作流程量化了颗粒的大小分布（Engelbert等人，2025年）。这些发现的详细讨论在我们最近的出版物（Engelbert等人，2025年）中提供。基于各种参数，选择了两种培养条件用于种子培养物的生成（图1）。首先，技术重复实验之间的颗粒宏观形态必须具有高度一致性和可重复性。其次，不同培养条件下的宏观形态必须有显著差异（即颗粒直径差异大于400 μm，图1）。

**图1**
A. 代表使用1 g L?1或10 g L?1滑石粉培养24小时后选定种子培养物的颗粒等效直径的箱形图（三次重复实验），以及分析了的颗粒数量（n）。B. 24小时后培养物的立体显微镜图像，展示了三次重复实验之间的形态相似性。刻度尺代表1000 μm。C. 差示干涉对比（DIC）图像，突出了颗粒形成的步骤。刻度尺代表250 μm。数据最初发表在Engelbert等人（2025年）的作品中；在此处进行了修改。

这两种选定的培养条件在培养基中添加的滑石粉微粒量上有所不同（1 g L?1或10 g L?1，图1A和B），这通常用于调整颗粒直径（Wucherpfennig等人，2012年；Kheirkhah等人，2023年）。两种条件下的颗粒直径分布都是单峰的，多次重复实验之间的相似度至少达到60%，这是通过重叠系数确定的（Engelbert等人，2025年）。此外，孢子与滑石粉颗粒的比例决定了形成的孢子-滑石粉聚集体的数量，这是两种种子培养条件之间的关键差异。如图1C所示，这导致了具有不同内部颗粒结构的群体，因为在孢子聚集体形成阶段（4小时）滑石粉颗粒被整合进去。此外，图像还显示了8小时时可能的孢子聚集体融合以及由多个孢子聚集体形成的成熟颗粒（12小时）。观察颗粒形成的一个原因是为了确保孢子开始萌发，从而进入Grimm等人（2004年）描述的第二个聚集步骤。这一步骤被认为是形成颗粒基本结构的一个里程碑（Müller等人，2022年）。基于这些观察结果以及细胞干重（CDW）和底物吸收情况，确定12小时的培养时间是收获种子培养物的最佳时间（补充图S1）。

### 高剪切力和低剪切力条件下的生长和颗粒宏观形态
为了确定培养过程中的剪切力制度如何影响生长行为和宏观形态，STR和RMB反应器分别接种了相应的种子培养物（每个反应器含有200克湿生物量）。为了简化，培养条件如下标记：当向种子培养物中添加1 g L?1的滑石粉时，STR和RMB培养物分别称为STR1和RMB1。同样，当添加10 g L?1的滑石粉时，培养物分别称为STR10和RMB10。通过分析CDW和葡萄糖浓度（图2）随时间的变化以及颗粒直径分布的宏观形态发育（补充图S2a，b）来表征总体培养行为。使用2D图像分析（见材料和方法）分析了两种生物反应器（STR vs. RMB）中的显微图像，以计算颗粒数浓度（即单位体积（mL?1）的颗粒数量）及其等效直径（图3）。生长和宏观形态的关键参数总结在表1中。

**图2**
相同A. niger颗粒种子培养物在搅拌罐（三角形）和摇动运动（圆形）生物反应器中的细胞干重和葡萄糖浓度。颗粒大小通过添加1 g L?1或10 g L?1滑石粉微粒来调整。实验进行了生物学重复实验：封闭符号代表重复实验A，开放符号代表重复实验B。两个重复实验的平均值由虚线标记。

**图3**
从2D（基于面积的）图像分析数据获得的颗粒宏观形态的发展。搅拌罐（STR，三角形）和摇动运动（RMB，圆形）生物反应器培养物的颗粒数浓度和等效直径。颗粒数浓度是基于在定义体积内计数的颗粒数量确定的。实验进行了生物学重复实验：封闭符号代表重复实验A，开放符号代表重复实验B。对于每个时间点，分析了数百个颗粒，整体颗粒直径由中位数表示，虚线显示两个重复实验的平均值。

**表1**
搅拌罐和摇动运动生物反应器中A. niger培养物的生长、 productivity、宏观和微观形态参数。特定生长率（μ）是在生长阶段计算的：STR 1 g L?1为6–12小时，RMB 1 g L?1为6–14小时，STR和RMB 10 g L?1为6–10小时。Rs和qs是在葡萄糖吸收期间给出的平均值。具体计算细节可以在补充材料中找到。在葡萄糖吸收停止且颗粒结构基本形成的14小时时，报告了宏观和微观形态的比较值。其余具有稳定趋势的参数是在20小时内平均得出的。

**补充图S1**
对于来自种子培养物的较大颗粒（1 g L?1），STR1和RMB1都接种了大约200个颗粒/mL，初始平均颗粒直径为609 ± 31 μm（图3）。两个反应器在前10小时内的生长和葡萄糖吸收模式相似（图2）。然而，STR1在12小时后几乎消耗了所有的葡萄糖，而RMB1在14小时后葡萄糖消耗停止，表明STR1的底物吸收速度更快（图2）。这一点得到平均体积葡萄糖消耗率的支持，STR1的消耗率略高于RMB1（STR1为0.60 g L?1 h?1，RMB1为0.51 g L?1 h?1，表1）。在指数生长阶段，STR1的文化达到了0.15 h?1的平均特定生长率，而RMB1为0.12 h?1（表1）。值得注意的是，RMB1的生物量产量更高，为0.68 g g?1，而STR1为0.58 g g?1。这些数据表明，在RMB1中，更多的葡萄糖被转化为生物量（CDWmax分别为6.73 ± 0.2 g L?1和5.81 ± 0.1 g L?1）。在宏观形态方面，两种剪切力制度下的平均颗粒群体发展不同。在STR1培养中，前4小时内颗粒数浓度增加了三到五倍（图3），尽管生物量浓度没有观察到明显增加（图2）。这与等效直径减少了100 μm（18%）（图3和补充图S2a）相结合，表明在这个培养的早期阶段，搅拌器引起的剪切力导致了颗粒破裂。STR1的初始颗粒群体在仅仅两小时后就有显著差异（p值 < 0.001，补充图S3）。虽然之后颗粒数浓度几乎保持不变（图3），但在培养结束时分散的菌丝体比例增加（补充图S4），这表明颗粒完整性丧失。相比之下，在RMB1培养中，颗粒数浓度保持不变，而它们的直径在批次培养的前18小时内持续增加了大约150 μm（图3和补充图S2a）。总之，两种剪切力制度下宏观形态发展的最大差异出现在培养开始时，STR1中的颗粒群体由于搅拌作用转变为更小的颗粒直径。这导致了两种培养系统之间初始颗粒直径组成的差异（图3），进而表现为不同的生长行为和宏观形态发育。对于使用10克/升滑石粉培养的种子培育出的较小颗粒，每个生物反应器（STR10和RMB10）中转移了大约3000个颗粒，这些颗粒的初始直径为234±34微米（图3和补充图S2b）。在生长方面，STR10和RMB10培养产生的生物量相当（STR10为0.63克/克，RMB10为0.62克/克，表1）以及最大细胞密度（CDWmax）（表1和图2）。在RMB10培养中，葡萄糖的消耗速率更高（0.64克/升·小时，表1），而在所有培养中，STR10的葡萄糖消耗速率最高（0.84克/升·小时，表1）。就宏观形态而言，当接种较小颗粒的种子培养物时，两个反应器在颗粒直径发展和颗粒数量浓度方面表现出相似的趋势（图3和补充图S2b）。在STR10培养中，搅拌器激活后颗粒数量浓度翻了一番，颗粒直径在2小时内减少了24微米（10%）（图3和补充图S2b）。尽管如此，与较大的STR1颗粒相比，初始搅拌对颗粒群体的影响是显著的但较小的（p值<0.001，补充图S3）。同样，在STR1中，STR10培养中的颗粒直径主要在指数生长期间增加。分散的菌丝量在STR10培养中也最高，并且与STR1培养相比在生长阶段就已经增加（补充图S4）。在RMB10中，变化在2小时内就很明显，颗粒群体与种子培养物有显著差异（p值<0.01，补充图S3），并且与STR10不同，它趋向于更大的颗粒直径。总之，种子培养中的初始较小颗粒导致在高剪切和低剪切条件下的生长行为和宏观形态发育更加相似。这可以通过剪切力对颗粒大小分布的影响在总体较大的颗粒群体（STR1和RMB1）中比在较小的颗粒群体（STR10和RMB10）中更为明显来解释。比较这两个系统，RMB1和RMB10培养中的颗粒生长稳定地变得更大，而所有STR培养中的颗粒最终直径范围相当。

接下来，根据四种培养条件下的颗粒直径和颗粒数量浓度计算了表面积与体积比。当将其与平均底物吸收率绘制在一起时，观察到高表面积与体积比与吸收率增加之间存在正相关（补充图S5）。表面积与体积比较高的培养显示出更早的底物耗尽。

进一步分析了含有1克/升或10克/升滑石粉的种子培养物的STR和RMB培养中颗粒大小分布与特定代谢率的质量变化之间是否存在明显关系（补充图S6）。使用1克/升滑石粉时，最初较大的颗粒种子培养物在整个核心生长阶段（6-12小时）显示出几乎恒定的特定生长率（μ）。STR1培养物中的颗粒具有最均匀的直径分布，这由最小的四分位数范围（146±10微米，补充图S6）表示。在RMB1中，随着颗粒的生长，异质性增加，四分位数范围从267±16微米（0小时）增加到346±31微米（10小时）（补充图S6）。在STR1和RMB1培养中，前四小时可以观察到较高的峰值底物吸收率，而STR1培养物的吸收率同时伴随着颗粒直径的减小（补充图S6）。在STR1培养物中，12小时后颗粒直径再次减小，这与葡萄糖限制有关（图2、3和补充图S2a）。在RMB1培养物中，葡萄糖限制发生得较晚（图2），并且颗粒直径在更长的时间内保持稳定（图3和补充图S2a）。只有在生长停止并且生物量生长结束时（18小时）才观察到明显的颗粒直径减小。相比之下，使用10克/升滑石粉的培养物显示出非指数生长模式，这表现为特定生长率随时间的增加（补充图S6）。在主要生长阶段开始时（6-10小时），STR10培养物中出现了最大的直径变化（图3和补充图S2b）。随着颗粒的生长，群体变得更加异质，四分位数范围从0小时的175±24微米增加到20小时的353±20微米，实际上使颗粒群体中中间50%的直径范围翻倍（补充图S6）。虽然STR10和RMB10中的颗粒直径相当（补充图S2b），但RMB10中中间50%颗粒的大小范围更广（402±62微米），使其成为最异质的群体。在生长阶段的最后（10-12小时），STR10和RMB10反应器中的分布模式稳定下来。因此，初始较小的颗粒种子培养物导致在高剪切和低剪切条件下生长更快、生长下降更早以及颗粒异质性更大，尤其是在RMB10中，然后在生长阶段结束时分布趋于稳定。

在所有培养物中测量了胞外蛋白浓度（图4）。在STR培养物上清液中检测到最高的蛋白浓度，而在RMB1和RMB10培养物中，培养结束后只存在少量蛋白。根据Gaden的分类（Gaden 1959），STR培养物中的蛋白产生似乎随着葡萄糖消耗量的增加而增加。分泌的蛋白质通常是与生长相关的产物（I型）。在培养结束时观察到最高的蛋白水平，STR1和STR10培养物中测量到的胞外蛋白总量为35微克/毫升（RMB1和RMB10中为5微克/毫升）。这时，颗粒完整性的丧失表现为颗粒直径的减小（图3和补充图S2a、b）以及分散菌丝比例的增加（补充图S4），这可能促进了蛋白质释放到培养基中。因此，不同大小的种子培养物之间的胞外蛋白浓度变化小于两种培养系统之间的变化。

相比之下，种子培养的历史和颗粒直径显著影响了柠檬酸的产生，根据Gaden的分类（Gaden 1959），柠檬酸是一种II型发酵代谢物。这些代谢物间接来源于能量代谢的反应，通常在微生物生长的初始阶段之后产生。在STR10或RMB10培养物中都没有检测到胞外柠檬酸，因为这些培养物中的颗粒较小。然而，在STR1和RMB1培养物中，具有较大颗粒直径的群体中，大约有1克/升的柠檬酸在RMB1中积累，在STR1培养物中甚至达到两倍。柠檬酸的生产开始于特定葡萄糖消耗量开始下降之后，尽管特定生长率尚未降至零（图4和补充图S6）。生产强度的增加分别在STR1和RMB1培养物的接下来的4小时和6小时内发生。在葡萄糖吸收停止和生长停止后，两种反应器系统中的柠檬酸积累速率下降。数据显示，剪切力制度对蛋白质和柠檬酸的生产都有显著影响，而与种子培养历史相关的差异仅体现在柠檬酸的生产上。对于绝对值的解释，应该注意的是，所有培养都是在初始葡萄糖浓度为8克/升的条件下进行的，这足以支持生长，但不是为了最大化分泌蛋白质的产生或柠檬酸的最大积累。

如我们之前的工作所示，SR-μ-CT技术可以用来确定A. niger颗粒的3D结构，直至菌丝水平（Müller等人，2023年）。因此，分析了来自STR和RMB运行的3500多个颗粒（从重复实验A中收获的）。图5A给出了不同培养时间点的代表性颗粒图像。首先，目的是确定3D数据的体积等效颗粒直径是否与2D数据的面积等效颗粒直径相匹配（补充图S7a-d）。对于STR1和RMB1群体，用两种方法测得的等效直径确实非常相似。然而，在STR10和RMB10群体中，来自STR10的较大颗粒（>800微米）与3D数据的匹配程度有限，而RMB10的颗粒总体上比2D数据中的颗粒要大。不过，注意到两种情况下的群体动态与2D数据中观察到的相似。由于覆盖率较低，RMB10的4小时时间点被排除在进一步分析之外。对于STR10，由于文件错误，18小时和20小时的数据不可用。

我们最近的研究（Engelbert等人，2025年）引入了一种基于同步辐射的微计算机断层扫描技术的颗粒分类系统，该系统根据颗粒的内部结构对颗粒进行分类，并在引言中进行了总结。图5B展示了本研究中发现的I至III类的3D图像。图中显示了颗粒质量中心的固体部分（=菌丝和嵌入滑石粉的量）以及颗粒内的孢子簇数量（图6），这些是估计颗粒类别的合理指标。请注意，可见孢子聚类的数量可能与三维中确定的孢子簇数量不同。

从1克/升滑石粉的种子培养物中获得的颗粒群体来看，观察到了I至III类的颗粒，并用它们接种生物反应器，其中主要类别是II类颗粒，每个颗粒平均包含5.33±0.23个孢子簇。颗粒质量中心的固体比例为0.11±0.01。在STR1中，假设由于搅拌作用，颗粒在培养的前两小时内从主要是多孢子聚集的颗粒（II类）转变为单孢子聚集的颗粒（I类）。这表现为每个颗粒的孢子簇数量减少（2.25±3.19），以及固体比例的整体趋势变化（图6A）。之后，固体比例均匀增加，表明颗粒以非常均匀的方式径向生长，主要包含一个位于中心的孢子簇（图6）。在生长停止后（16小时，μ=0），在颗粒的外部观察到固体比例减少（约180–400微米，补充图S6）。与分散的菌丝增多所观察到的颗粒完整性的丧失（补充图S4）相结合，这可能表明了外层菌丝的磨损。与STR1相比，RMB1颗粒的特点是颗粒结构较为松散，整体上更蓬松，具有更长的向外生长的菌丝（图5A）。这种视觉上更松散的结构得到了质心处较低固体分数的支持，8小时时的最大固体分数约为0.15（图6A）。在培养过程中，每个颗粒中的孢子簇数量略有增加，这强烈表明一些颗粒发生了融合，尤其是在生长初期（4小时），从而增加了III类颗粒的比例。这一趋势得到了颗粒直径增加和从4小时到6小时颗粒数量浓度略微下降的支持（图3和补充图S2a）。孢子簇的高标准差（图6B）反映了该群体颗粒直径的高度异质性（补充图S2a和S6）。在最初的8小时内，RMB1培养的颗粒表现出所有部分菌丝质量的均匀分布（图6A）。与STR1不同，在葡萄糖限制后（14小时），RMB1的菌丝分布不那么明显。这可以归因于RMB1群体中不同颗粒结构的多样性，而且分析的颗粒数量较少（每个时间点n < 40）。然而，含有10 g L?1滑石的种子培养物在两种剪切应力条件下的发展有所不同。种子培养物主要由几乎没有孢子簇的颗粒组成，其质心处的固体分数为0.15 ± 0.02（图6），因此主要可以视为I类颗粒。在STR10培养物中，形成了结构更松散的宏观形态，由小颗粒和低总体密度的团块混合而成（图5A）。质心处的固体分数在0小时时最高，并在14小时时连续下降到所有培养物中最低的值<0.1。与STR1颗粒类似，搅拌器的激活对STR10的个别颗粒形态产生了很大影响，表现为固体分数趋势的变化（图6A）。此外，搅拌器激活后孢子簇的数量减少了超过一半（图6B），同时颗粒直径也减小了（图3和补充图S2b）。有趣的是，生长过程中（6-12小时）颗粒直径的增加（图3中可见）并未在3D数据的固体分数中得到体现。原因可能是 capture 到较大直径颗粒的能力降低，或者可能是分散的菌丝比例较高（补充图S4），而SR-μ-CT通常无法捕捉到这些情况。RMB10培养物中的颗粒在形态上与STR1培养物相似，但看起来密度更低、更蓬松（图5A）。同样，它们显示出从中心孢子团块开始的均匀向外生长，固体分数均匀增加。在RMB10中，每个颗粒中的孢子簇数量在生长过程中略有增加，达到7.97 ± 12.29（12小时），但与RMB1种子培养物相比仍处于较低水平。因此，可以得出结论，两种不同的种子培养群体在高剪切力和低剪切力条件下在微观形态上发展有所不同。在STR培养物中，主要由多个孢子团块组成的颗粒群体（II类）转变为了I类颗粒，而I类起始群体则未能表现出密集的菌丝结构。然而，在RMB培养物中，最初的内部结构得以保持。此外，RMB中的低剪切力似乎促进了颗粒通过菌丝缠结而融合，从而增加了总体颗粒群体中III类颗粒的比例。除了在微观形态上分析这些群体外，SR-μ-CT还计算了其他关键参数，如图6B、补充图S9和表1所示。更多数据见于补充材料1。颗粒的总菌丝长度、每个颗粒的顶端数量和分支数量随着培养时间的推移而增加，范围与颗粒直径相似（补充图S9）。在生长阶段结束时（14小时），STR1中直径为689 μm的颗粒总共有1.45 ± 0.86 m的菌丝长度，计算出8654 ± 4744个顶端和6258 ± 3465个分支；而在RMB1中，直径为900 μm的颗粒则有3.57 ± 3.18 m的菌丝，25,039 ± 23,222个顶端和18,414 ± 16,756个分支。对于10 g L?1滑石的较小颗粒，在14小时时的数据如下：STR10中直径为295 μm的颗粒有0.07 ± 0.08 m的菌丝，599 ± 668个顶端和366 ± 445个分支；RMB10中直径为716 μm的颗粒有1.37 ± 1.02 m的菌丝，5871 ± 4711个顶端和6245 ± 4649个分支。平均分支长度（ABL），即两个分支点之间或一个分支点与一个顶端之间的距离（Müller等人，2023年），在图6B中给出，并且随时间没有显著变化。20小时内的平均ABL值在所有条件下都处于相似范围内：STR1、RMB1、STR10和RMB10分别为81 ± 23 μm、75 ± 10 μm、73 ± 11 μm和94 ± 11 μm（图6B，表1）。这表明了顶端生长行为和分支模式的稳定性。有趣的是，尽管在两种种子培养条件和剪切应力条件下形成的颗粒之间菌丝质量的局部分布有所不同（图6A），但平均颗粒孔隙率（分别为STR1、RMB1、STR10和RMB10的0.95 ± 0.02、0.95 ± 0.01、0.96 ± 0.01和0.96 ± 0.01）在整个培养期间基本保持不变（图6B，表1）。同样，菌丝直径（分别为STR1、RMB1、STR10和RMB10的3.04 ± 0.06、3.07 ± 0.08、3.52 ± 0.38和3.24 ± 0.09）也基本保持不变（图6B，表1）。值得注意的是，直接比较来看，含有10 g L?1滑石的培养物中的平均菌丝直径总体上略大于含有1 g L?1滑石的培养物。然而，这些菌丝直径与之前对A. niger的研究报告中的直径范围一致（Schmideder等人，2019a；Müller等人，2023年）。总体而言，A. niger的微观菌丝特征，如分支频率、总体颗粒孔隙率和菌丝细胞壁厚度，在两种剪切力条件下都相对稳定，因此可能在基因控制之下。由于丝状微生物的形态和生产力紧密相关，了解培养系统如何影响特定群体的形态对于菌株和工艺优化具有重要意义。在本研究中，研究了使用两种不同反应器系统（RMB vs STR）的高剪切力或低剪切力对特定种子群体的影响。虽然许多研究已经探讨了搅拌器引起的剪切效应对丝状真菌整体宏观形态的影响（Grimm等人，2005年；Lin等人，2010年），但在低剪切力条件下、虽然受到控制的摇动培养中的形态发展却很少被研究，主要是我们（Kurt等人，2018年；Kheirkhah等人，2023年）进行的。还有报道指出，在STR中较低的搅拌速度会由于液体相中的氧气限制而导致颗粒生长受阻，这是由于气体-液体传质不足（Li等人，2002年）。为了控制群体的初始直径范围，种子培养物中添加了1 g L?1或10 g L?1的滑石微粒。这种方法确保了滑石在颗粒中的整合，防止了游离滑石的存在，同时允许控制颗粒直径。此外，这种方法还能够监测种子列。本研究主要关注剪切力对两种生物反应器系统中群体的影响，并且所有培养物中的溶解氧（DO）水平始终保持在40%以上（补充材料1），从而排除了由于气体-液体传质不足造成的氧气限制。然而，尽管在两种反应器中保持了相同的通气速率，流体动力学的差异导致了kLa值的变化。虽然氧气传递速率的影响通常不如剪切力（无论是通过搅拌器还是通气）那么明显，但不应忽视，因为它仍然可以影响A. niger物种的颗粒形态，尤其是在微观层面上（Casas López等人，2005年；Lin等人，2010年）。然后，在两种生物反应器系统中比较了培养物的宏观和微观形态发展以及生长参数和产物形成。本研究的结果总结在图7中。总体而言，较低的滑石浓度导致了较少但较大的颗粒形成，其中大多数颗粒包含多个孢子簇（图6B）。这种群体（1 g L?1滑石）在不同的反应器系统中表现出更明显的生长行为。这主要可以由两种系统中颗粒的数量和直径不同解释，从而导致表面与体积比的变化。对于最初接种的颗粒较小的群体（含有10 g L?1滑石的种子培养物），在高剪切力和低剪切力条件下观察到了更相似的生长行为和形态发展。除此之外，RMB培养的颗粒总是更加蓬松，具有更长的向外生长的菌丝。先前的研究已经报告过，较低的功率输入和较低的剪切力会导致更蓬松的颗粒形成（B?l等人，2021年）。图7 这张图像的替代文本可能是使用AI生成的。高剪切力和低剪切力条件对两种不同颗粒种子培养群体影响的图形总结。在上清液中测量蛋白质或柠檬酸的培养物分别用蓝色和橙色圆圈标记。对于较大的颗粒，发现了两种与剪切力相关的不同影响。首先，高剪切应力系统使颗粒直径更加均匀，形成了中心有孢子团块的颗粒，其直径仅在发酵过程中增加。在搅拌器激活后，剪切力对STR培养物中较大颗粒断裂的影响立即显现出来（数据未显示），导致颗粒数量浓度增加和中等等效直径减小。其次，观察到在较高剪切力下葡萄糖限制后，菌丝网络的完整性无法维持，因为培养基中分散的菌丝比例较高。就异质性而言，RMB中的颗粒每个颗粒中的孢子簇数量变化更大，导致颗粒群体总体上更加异质。需要注意的是，由于种子培养群体本身就是异质的，摇摆运动并不会显著改变其形态；相反，只要有足够的底物，它就会保持这种异质性，允许颗粒生长而不会出现显著的形态变化。这一假设得到了中等直径增加的支持，同时颗粒数量浓度保持不变。另一方面，STR1培养物中的较大颗粒形成了最均匀的培养物。由于剪切力的作用，颗粒无法超过某个直径，因此变得更加均匀。这种尺寸限制效应之前已经在高剪切应力STR培养（500–800 rpm）下的颗粒接种物中描述过（Paul等人，1999年）。此外，每个颗粒的葡萄糖可用性也可能限制了颗粒直径，因为STR1中的颗粒数量浓度高于RMB1培养物。来自含有10 g L?1滑石的种子培养物的颗粒最初较小，在反应器系统中的形态变化不太明显。这些颗粒主要由单个孢子团块组成，即使在STR的较高剪切条件下也主要保持了其结构完整性，尽管仍然观察到了颗粒数量浓度的轻微增加。相比之下，这些较小的颗粒在RMB中偶尔会融合，表现为颗粒数量浓度下降和颗粒尺寸在4小时内增加了60 μm，导致所有条件中最异质的宏观形态（直径）。这种增加的异质性可能源于它们较小的初始尺寸和较高的颗粒数量浓度，这使得在培养过程中有更宽的直径范围。在选择培养系统时，应考虑这一差异，因为异质性有助于提高酶的多样性和整体生产的稳定性（Lyu等人，2023年）。在观察了大形体发育的同时，还利用固相组分和孢子簇的数量评估了颗粒结构的微观形态发育。本研究识别出了所有与生长相关的I、II和III类颗粒，这些颗粒由一个或多个孢子聚集体或成熟的颗粒发展而来。本研究以及其他研究（Müller等人，2022年）的2D图像分析结果显示，颗粒会破裂形成暂时性结构，这些结构既无法归类到上述三类中，也无法归类为分散的菌丝体。为了便于讨论，我们将这些颗粒碎片称为“过程导向的临时‘第四类（破裂颗粒）’”，同时承认需要进一步专门的研究来建立系统的定义和定量表征。这些碎片可能与高剪切应力有关，并可能通过后续生长转变为I类或II类颗粒，同时也可能成为III类颗粒的前体。在我们之前的工作中也报告了这种由碎片形成的颗粒现象（Engelbert等人，2025年）。

在生理学方面，无论种子培养基中滑石粉的浓度如何，STR培养物的生长速率和底物吸收速率都略高于相应的RMB培养物。最高的具体底物吸收速率出现在STR10颗粒中，这些颗粒的中位直径最小，因此表面积与体积比也最高。在我们之前的摇瓶实验中，也观察到了类似的直径依赖性效应，即颗粒数量较多且直径较小的培养物消耗葡萄糖的速度更快（Engelbert等人，2025年）。有趣的是，最高的生物量在RMB1培养物中达到，这些培养物的颗粒中位直径也最大（表1）。这表明在低剪切应力下，这些较大的颗粒有更大的生长潜力。尽管培养基中不存在氧气限制，但由于大颗粒内的物质传递受限，生长可能会受到阻碍，这引发了关于RMB系统适用性的疑问。然而，最近的研究表明，颗粒中的氧气和底物扩散速率主要受菌丝组分的影响（Hille等人，2009年；Schmideder等人，2021年）。尽管RMB培养物的平均颗粒尺寸显著更大，但其平均孔隙率与STR培养物相似。不过，RMB培养物的不同之处在于菌丝质量在颗粒上的分布。通过保持最初的（多孢子聚集体）颗粒结构，RMB培养物中较不密集的颗粒中心结构可能有助于更好地传递营养物质和氧气。这些特点可能有助于略微提高代谢效率，这一点从生物量产出中可以得到体现。

到目前为止，研究表明，在STR培养物中，与RMB培养物相比，可能有更少的代谢资源转化为生物量。这些资源可能被用于蛋白质的分泌，因为在生长阶段，STR培养物中的蛋白质水平显著更高。之前已有研究证实，生物量形成与蛋白质分泌之间存在负相关关系，这两者依赖于相同的代谢资源（Melzer等人，2007年）。与此一致的是，最近的研究表明，在摇瓶培养条件下，生物量最低的群体具有最高的蛋白质分泌量（Engelbert等人，2025年）。然而，这些颗粒的直径最大。除了代谢资源外，剪切应力也可能促进蛋白质分泌，因为两种培养物都显示出显著的细胞外蛋白质积累。这一观察结果与一个假设相符，即维持细胞壁完整性所需的分泌囊泡也参与了蛋白质分泌，因此可能代表了一种共同的、潜在的受限资源（Kunz和King，2022年）。在此背景下，先前的研究表明，细胞壁应力会激活细胞壁完整性（CWI）途径，从而上调参与囊泡运输和分泌机制的基因转录（Fiedler等人，2014年）。然而，Kunz和King（2022年）的实验数据显示，囊泡数量和葡糖淀粉酶的分布与剪切应力的关系更为复杂。他们在微流控室内对不同流体动力剪切条件下的A. niger进行了研究，结果表明，囊泡数量和蛋白质分泌量并不随剪切应力的增加而线性增加，而是表现出依赖于所施加流体动力条件的最佳行为。因此，虽然剪切应力可能影响蛋白质分泌，但本研究观察到的差异更一致地可以通过生物量形成和资源分配的变化来解释。

多年来，人们已经认识到颗粒大形态对A. niger培养物中柠檬酸积累的影响（Gómez等人，1988年；Papagianni等人，1994年；Paul等人，1999年）。因此，使用种子培养物来确保主发酵过程中的形态控制是一种常见做法（Papagianni和Mattey，2006年）。在本研究中，只有在种子培养基中添加了1克/升滑石粉的培养物中观察到了柠檬酸的产生。这可能与特定的生长速率和底物吸收速率的差异有关，因为两种生物反应器系统的生长模式基于相同的种子培养物产生。这表明，种子培养的历史，包括初始颗粒直径、形态和生理状态，可能比培养过程中的任何时间点的实际颗粒直径对生长有更强的影响。在生长高峰期结束后，检测到了可测量的柠檬酸量。值得注意的是，柠檬酸的产生通常发生在底物限制条件下，但需要活跃的生长。根据所有培养物的生长模式，10克/升培养物中所需的代谢状态持续时间可能太短，不足以产生柠檬酸。因此，STR1培养物中较高的柠檬酸产量可以归因于STR1中更密集的颗粒核心区域底物限制的增加。对于更高的柠檬酸积累，先前已有研究指出，较小尺寸（<0.5毫米直径）的稳定颗粒/团块培养物是有益的（Gómez等人，1988年；Papagianni，2007年；Max等人，2010年）。

在一个群体中，不同大小的颗粒可能承担不同的功能，例如作为主要酶的生产者或参与次生代谢产物的形成，如抗逆因子（Lyu等人，2023年）。因此，通过选择种子培养物和剪切应力条件来控制群体大小，使之趋向于更均匀或更异质的方向，可能有助于优化产品产量或群体稳定性。然而，大多数先前的研究都集中在从孢子开始的培养过程中工艺条件的影响上（Kelly等人，2004年；Lin等人，2010年；Wucherpfennig等人，2012年；Kurt等人，2018年）。还有一些研究选择传统的种子培养方法，没有在主培养前主动控制形态（Fazenda等人，2010年；Maumela等人，2021年）。一个可能出现的问题是这些发现在不同尺度上的可转移性。只有少数研究系统地追踪了生物反应器系统中特定种子培养物的发展过程（Lu等人，2015年；Waldherr等人，2023年）。Waldherr等人（2023年）对使用不同类型搅拌器的A. niger培养物收获的颗粒进行了全面研究，他们的研究是在稀释培养基中进行的，其中真菌生长不是一个影响因素，他们主要关注剪切引起的颗粒破裂。据我们所知，还没有研究结合控制生物反应器培养中的剪切力和培养历史（接种时具有定义特征的颗粒）对摇摆式与搅拌式培养过程响应的影响。

总之，本研究首次提供了一个可扩展的框架，通过群体异质性工程来优化丝状生物过程。通过将定义好的种子群体接种到STR和RMB培养物中，我们研究了机械应力和初始颗粒结构对A. niger的微观和宏观形态、生长行为以及代谢产物产生的综合影响。这首次证明了在各种剪切诱导环境中，种子培养发展的二维和三维层面的跟踪。我们的结果表明，传统的STR环境限制了颗粒大小，并在群体层面和单个颗粒的内部结构上起到了均质化的作用。这主要是由于剪切应力引起的颗粒破裂，形成了紧凑、集中的生长单元。相比之下，低剪切应力条件允许异质种子培养物保持其多样性，并支持形成结构更为松散的大型颗粒。然而，在STR培养物中，较小且更紧凑的颗粒中观察到了更高的细胞外蛋白质水平。另一方面，柠檬酸的产生似乎与种子培养的历史有关。