缺乏CTpF和MmpL7转运蛋白的结核分枝杆菌表现出与其毒力决定因子相关的微生物学特征变化

《Archives of Microbiology》：Mycobacterium tuberculosis lacking CtpF and MmpL7 transporters exhibits altered microbiological traits associated with virulence determinants

　　**摘要**
结核病（TB）仍然是一个重大的全球公共卫生问题，这突出了寻找结核分枝杆菌（Mtb）中的减毒靶点以开发新的控制策略的必要性。在这方面，质膜转运蛋白是决定Mtb毒力的关键因素，包括Ca2+ P型ATP酶CtpF和负责转运硫醇二麦角酯（PDIM）的MmpL7。在这项研究中，我们通过体外实验鉴定了MtbH37RvΔctpF和MtbH37RvΔmmpL7菌株的微生物特性。与MtbH37Rv相比，这两种突变株的菌落粗糙度和疏水性均有所降低，这表明细胞壁脂质的组成发生了变化。色谱分析证实了脂质谱的变化：MtbH37RvΔctpF的磷脂酰肌醇甘露糖苷和海藻糖二麦角酯谱型发生了改变，而MtbH37RvΔmmpL7则在细胞内积累了PDIM。此外，转录分析显示两种突变株中PDIM的生物合成和转运基因表达下调。然而，这两种菌株仍能分泌早期分泌抗原6（ESAT-6）和培养滤液蛋白10（CFP-10），表明其免疫刺激潜力得以保留。这些发现提供了体外证据，证明ctpF和mmpL7的缺失改变了与分枝杆菌毒性相关的包膜特征。

**图解摘要**
结核病（TB）仍然是一个重大的全球公共卫生问题，这突出了寻找结核分枝杆菌（Mtb）中的减毒靶点以开发新的控制策略的必要性。在这方面，质膜转运蛋白是决定Mtb毒力的关键因素，包括Ca2+ P型ATP酶CtpF和负责转运硫醇二麦角酯（PDIM）的MmpL7。在这项研究中，我们通过体外实验鉴定了MtbH37RvΔctpF和MtbH37RvΔmmpL7菌株的微生物特性。与MtbH37Rv相比，这两种突变株的菌落粗糙度和疏水性均有所降低，这表明细胞壁脂质的组成发生了变化。色谱分析证实了脂质谱的变化：MtbH37RvΔctpF的磷脂酰肌醇甘露糖苷和海藻糖二麦角酯谱型发生了改变，而MtbH37RvΔmmpL7则在细胞内积累了PDIM。此外，转录分析显示两种突变株中PDIM的生物合成和转运基因表达下调。然而，这两种菌株仍能分泌早期分泌抗原6（ESAT-6）和培养滤液蛋白10（CFP-10），表明其免疫刺激潜力得以保留。这些发现提供了体外证据，证明ctpF和mmpL7的缺失改变了与分枝杆菌毒性相关的包膜特征。

**引言**
结核病（TB）仍然是全球主要的健康挑战之一。根据世界卫生组织（WHO）的数据，2024年报告了超过1000万新病例和大约130万死亡病例。这一情况的重新出现与COVID-19大流行期间结核病控制计划的中断有关。多重耐药（MDR）和极端耐药（XDR）结核分枝杆菌菌株的出现和传播进一步加剧了全球结核病的负担，同时人类免疫缺陷病毒（HIV）的共感染也降低了现有治疗方案的有效性（世界卫生组织2025年报告）。这凸显了迫切需要有效且持久的预防措施。
自1921年引入以来，卡介苗（BCG）作为减毒牛分枝杆菌株，一直是唯一获得许可的结核病疫苗（Pai等人2016年）。BCG对婴儿的播散性结核病提供了持续的保护。然而，其对青少年和成人肺结核的保护效果变化很大（0–80%）（Pai等人2016年；Lai等人2023年）。这种变化的一个重要原因是BCG在减毒过程中基因组区域的逐渐丢失（Gr?schel等人2016年）。此外，BCG的有效性还受到多种因素的影响，包括地理环境、宿主的遗传背景以及BCG菌株之间的差异（Lai等人2023年）。值得注意的是，缺乏早期分泌抗原6（ESAT-6）和培养滤液蛋白10（CFP-10）等免疫优势抗原，这些抗原对于引发强大的T细胞介导的免疫反应至关重要（Brandt等人1996年；Wu等人2008年），这与疫苗的保护能力下降有关（Maue等人2007年）。
开发下一代结核病疫苗已成为全球优先事项。减毒活分枝杆菌株是一个有前景的替代方案，因为它们可以保留广泛的抗原库（Martin等人2020年；Romano等人2023年），从而引发更强且更持久的记忆反应（Brandt等人1996年；Wu等人2008年）。然而，疫苗的合理设计需要识别能够降低毒性而不影响免疫原性的分子靶点。
在这方面，跨膜蛋白是减毒分枝杆菌的理想靶点。其中，P型ATP酶对于维持金属离子平衡和适应吞噬体压力至关重要（Novoa-Aponte和Soto Ospina 2014年；Maya-Hoyos等人2019年；Garg等人2020年）。转录研究表明，在缺氧条件下、接触有毒化合物以及感染过程中，这些酶中的几种会上调（Novoa-Aponte和Soto Ospina 2014年）。一个显著的例子是CtpF，它通过防止细胞质过载来调节Ca2+平衡，并在感染期间显著表达以促进Mtb存活（Novoa-Aponte和Soto Ospina 2014年；Maya-Hoyos等人2019年）。先前的研究表明，ctpF基因的突变可以显著减少巨噬细胞中的细菌负荷并延长宿主存活时间（Maya-Hoyos等人2022年）。CtpF还被证明有助于分枝杆菌的潜伏状态（Maya-Hoyos等人2022年）。
另一个相关的跨膜蛋白家族是MmpL，它负责将脂质运输到细胞包膜中，从而增强细胞的不可渗透性和免疫逃逸能力（Rens等人2021年）。具体来说，MmpL7负责转运硫醇二麦角酯（PDIM），这是一种已知的宿主-病原体互作调节剂。重要的是，PDIM不是独立的毒力决定因子，而是与ESAT-6分泌系统1（ESX-1）协同发挥作用。该分泌系统负责分泌如ESAT-6和CFP-10等关键效应蛋白，这些蛋白直接参与吞噬体膜的破坏。在这种背景下，PDIM被认为有助于促进ESX-1依赖性的膜扰动和细胞质内的进入，揭示了宿主-病原体互作的协调机制（Barczak等人2017年；Augenstreich等人2017年）。PDIM还影响早期感染期间的炎症细胞招募和肉芽肿动态（Cambier等人2014年）。此外，PDIM通过掩盖病原体相关分子来逃避宿主先天免疫受体的识别（Cambier等人2014年）。使用mmpL7突变株的研究表明，Mtb感染细胞的自噬显著减少，并证明MmpL7在小鼠模型中对致病性是必需的（Domenech等人2005年；Astarie-Dequeker等人2009年；Melly和Purdy 2019年）。
尽管有这些发现，关于ctpF和mmpL7的缺失如何影响分枝杆菌包膜的生理特性以及其与宿主的相互作用和免疫反应的调节，仍有一些重要的问题尚未解决。解决这些问题对于确定它们作为减毒靶点的适用性至关重要。
因此，本研究设计了一种体外框架，以检查与毒性相关的微生物特性，作为未来在感染模型中进行验证的第一步。选择MtbH37RvΔctpF和MtbH37RvΔmmpL7突变株是基于它们在钙平衡和PDIM转运中的已知作用。这两个功能不同的过程在分枝杆菌毒力和宿主-病原体互作中起着关键作用。

**材料与方法**
**细菌菌株和生长条件**
本研究中使用的细菌菌株列在表S1（补充材料）中。所有菌株均以甘油形式保存在-80°C。大肠杆菌（E. coli）在Luria-Bertani（LB）培养基中或LB琼脂上37°C培养16小时。携带质粒的菌株需添加相应的抗生素：100 μg/mL氨苄西林（Amp）、100 μg/mL庆大霉素（Hyg）和25 μg/mL卡那霉素（Kan）。在基于β-半乳糖苷酶活性的蓝白筛选实验中，培养基中添加80 μg/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃葡萄糖苷（X-Gal）和0.5 mM异丙基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷（IPTG）。
**疏水性测定、 Congo红染色、菌落扩散、生物膜形成测定和RNA分离**
分枝杆菌菌株（MtbH37Rv、MtbH37RvΔctpF、MtbH37RvΔmmpL7）在Middlebrook 7H9培养基（目录号271310，Becton Dickinson，美国新泽西州）中培养，培养基中含有（10% v/v；25 μg/mL油酸、0.5%牛白蛋白V组分、0.2%葡萄糖、0.004%过氧化氢酶）OADC、0.5%甘油（目录号G5516，Sigma-Aldrich，美国密苏里州）和0.05%泰洛克斯醇（Tyl）（目录号T8761，Sigma-Aldrich），37°C培养并摇匀（80 rpm），直到光密度OD600约为1.0。对于生物膜定量和ESAT-6/CFP-10检测，培养物在改良的Sauton培养基（0.5 g/L K2HPO4、0.5 g/L MgSO4、4 g/L L-天冬酰胺、0.05 g/L柠檬酸铁铵、4.76%甘油、0.2%葡萄糖、1 mg/L ZnSO4；pH约7.0）中培养，静态培养6周（用于生物膜）或摇匀培养5周（用于分泌蛋白和总蛋白提取）。必要时，7H9、7H10和7H11培养基中添加抗生素：100 μg/mL Hyg、25 μg/mL Kan和10 μg/mL环己亚胺（Chx）。

**构建mmpL7缺陷型Mtb菌株**
使用van Kessel和Hatfull（Van Kessel和Hatfull 2007）描述的Che9c重组系统从MtbH37Rv中删除mmpL7基因。使用CTAB-NaCl/蛋白酶K方法（Parish和Roberts 2015年）分离Mtb基因组DNA。具体来说，通过将mmpL7基因上游和下游区域各500 bp的片段独立克隆到pYUB854载体中，构建 alleles exchange substrate（AES）载体，生成pVVG4质粒。然后用BspHI和XhoI双切删除pVVG4中的mmpL7 AES（3048 pb）。
同时，重组菌株（MtbH37Rv::pJV53）在添加0.2%琥珀酸、0.05%吐温80和Kan的7H9培养基中培养，直到OD600约为0.8。然后加入0.2 M甘氨酸，并通过添加0.2%乙酰胺诱导重组酶表达。这些细胞用电穿孔法转入200 ng的AES，然后接种到7H11-OADC-Kan-Hyg培养基中（Van Kessel和Hatfull 2007；Maya-Hoyos等人2019年）。从Mtb菌落中，使用表S1（补充材料）中列出的引物通过PCR确认mmpL7基因的缺失。通过连续传代纯化突变菌株。该过程包括将1 μL原始菌落接种到10 mL的7H9-OADC-Chx-Hyg培养基中。培养21天后，重复此过程三次。从最终培养物中制备系列稀释液（10^-1至10^-5），并将每份稀释液100 μL接种到7H10-OADC-Chx-Hyg培养基中直至出现菌落。通过PCR评估菌落的纯度（数据未展示）。最后，使用pMV261（由 Constitutive hsp60启动子控制的复制载体）进行互补实验。然而，由于过表达效应，未恢复野生型（WT）表型，因此未包括互补实验结果。

**Congo红染色**
在7H9-OADC-Tyl培养基中培养的3 μL Mtb细胞（OD600约为1.0）接种到加入100 μg/mL Congo Red的7H10-OADC-Chx培养基中心。培养板在37°C下静置培养4周。根据（Julián等人2010年）将菌落形态分为粗糙或光滑类型，并根据Congo Red染色的存在进一步分类为不透明或透明、有色或无色（Maya-Hoyos等人2015年）。每个菌株培养三个生物重复样本，每个样本包含五个技术重复样本。以MtbH37Rv为参考，比较不同菌株的形态，特别注意菌落表面的绳状结构，这是致病菌的特征性生长模式（Darzins 1958年；Hunter等人2006年）。

**疏水性测定**
疏水性测定按照Jankute等人（2017年）的方法进行，但有所修改（Jankute等人2017年）。在7H9-OADC-Tyl培养基中培养的Mtb（OD600约为1.0）在室温下静置一周直至生物量沉降。然后去除上清液，将生物量在95°C下热灭活1小时。细胞用PUM缓冲液（2.2% K2HPO4·3H2O、0.726% KH2PO4、0.18%尿素、0.02% MgSO4·7H2O，pH约7.1）洗涤一次，然后重新悬浮在0.05% PUM-Tween 80中至OD600约为0.7（A0）。然后取3 mL样品转移到含有2.4 mL十六烷的玻璃管中，颠倒混合，在37°C下孵育15分钟。室温下分离两相，收集上层液体并测量OD600（A1）。疏水性计算公式为：% 疏水性 = (1–(A1/A0))×100。实验进行两次生物重复和三次技术重复。统计分析采用单因素方差分析（ANOVA）进行，随后进行Tukey检验。生物膜形成测定：将100 μL在7H9-OADC-Tyl培养至OD600≈1的Mtb接种到含有改良Sauton培养基的微管中（Ojha等人，2008年；Richards等人，2019年）。微管在37°C下培养6周，期间不进行振荡。通过将微管倾斜90°去除浮游细胞。然后用1X PBS（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，1.8 mM KH2PO4；pH≈7.4）洗涤微管以去除残留细胞。接着加入0.1%结晶紫，在室温下放置15分钟。微管以13,200 rpm的速度离心10分钟，弃去上清液。通过加入无水乙醇并在室温下孵育10分钟来提取与生物膜结合的染料。为了定量，将每个微管中的100 μL乙醇-染料提取物与100 μL无水乙醇混合在96孔板中。随后，将板子在室温下孵育24小时，并使用iMARKTM Microplate Reader（Bio-Rad，美国加州）在570 nm处测量吸光度。仅含无水乙醇的孔作为阴性对照。实验每个Mtb菌株进行了4次生物学重复和8次技术重复。统计分析采用单因素ANOVA进行，随后进行Tukey检验。

菌落扩散测定：简而言之，将3 μL在7H9-OADC-Tyl培养至OD600≈1的Mtb接种到含有0.4%琼脂糖的7H9-OADC固化的孔中心。培养板在37°C下培养4周（Maya-Hoyos等人，2015年）。每3天测量一次从接种点开始的径向生长直径来监测菌落扩散。该测定进行了5次生物学重复。数据采用单因素ANOVA进行统计分析，随后进行Tukey检验。

脂质提取和薄层色谱（TLC）分析：对在含有0.4%琼脂糖的7H9-OADC上生长的分枝杆菌进行脂质提取。将菌落从琼脂糖表面刮下并转移到螺旋盖玻璃管中。然后加入5 mL石油醚，在室温下孵育3分钟。轻轻混合后，收集上清液，并立即与5 mL氯仿:甲醇混合，孵育24小时。之后，从剩余的生物质中提取总脂质（在醚提取之后），分别用（1:2）氯仿:甲醇和（2:1）氯仿:甲醇在37°C下孵育24小时，同时进行振荡（80 rpm）。脂质提取物过滤后，在65°C下干燥，并在20 mg/mL氯仿中重新悬浮（Guallar-Garrido等人，2021年）。对于色谱分析，将400 μg的脂质提取物点在TLC板上（Merck Silica Gel G60 F254，20×20 cm，玻璃背板）。对于PDIM分析，使用（9:1，v/v）石油醚/乙醚作为流动相。对于糖脂分离，使用（65:25:4，v/v/v）氯仿/甲醇/水洗脱系统（Lefebvre等人，2018年；Krishnamoorthy等人，2021年；Jones等人，2024年）。TLC板通过喷洒10%磷酸钼酸乙醇溶液来检测PDIM，并通过喷洒1%蒽醌浓硫酸溶液来鉴定糖脂。最后，将TLC板在140°C下加热15分钟以可视化脂质斑点（Camacho等人，2001年；Maya-Hoyos等人，2015年；Guallar-Garrido等人，2021年）。

RNA分离和cDNA合成：将在7H9-OADC上培养至OD600≈1的Mtb菌株以13,000 rpm离心10分钟，用DEPC处理的H2O洗涤，然后使用基于Rustad方法（Rustad等人，2009年）的Trizol方法（Invitrogen，美国加州卡尔斯巴德）进行RNA分离。RNA在60 μL DEPC处理的H2O中重新悬浮，并使用NanoDrop? OneC（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）进行定量，并在2%琼脂糖凝胶上评估其完整性。为了消除DNA污染，将2 μg的RNA与4 μL DNase I（EN0521 Thermo Scientific）和1 μL RNase抑制剂（N8080119 Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）在37°C下处理30分钟。然后通过加入2 μL 25 mM EDTA并在65°C下孵育10分钟来使DNase失活。cDNA合成使用2 μg的RNA处理过的RNA、1 μL 10 mM dNTPs、1 μL 0.2 μg/μL随机引物（Thermo Fisher Scientific）、1 μL 0.02 mM基因特异性反转引物和1 μL OneScript? Plus反转录酶（abm）进行。反应按照制造商的说明书进行。cDNA在?20°C下保存直到使用。

qRT-PCR分析：使用Pfaffl方法（Pfaffl 2001；Pfaffl等人，2004年）定量16SrRNA（标准化基因）、lppX、drrC和mas基因的转录水平。针对三个样本进行定量，包括一个阴性对照（未添加cDNA）。使用10倍系列稀释的MtbH37Rv基因组DNA来确定目标基因和参考基因的扩增效率。qPCR和qRT-PCR使用Bio-Rad的SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix在CFX-96热循环仪（Bio-Rad Laboratories，美国加州赫拉克勒斯）上进行。循环条件如下：初始变性在95°C下5分钟，接着是39个循环，每个循环95°C 15秒，熔解温度（Tm）10秒，72°C 15秒。

ESAT-6和CFP-10蛋白的产生：通过在全细胞提取物和培养上清液中评估ESAT-6和CFP-10的存在来进行检测。为此，将100 mL的分枝杆菌培养物以3000 rpm离心15分钟，将沉淀物与培养上清液分离。首先，上清液通过0.22-μm滤膜过滤，然后加入四体积的冷丙酮在?20°C下过夜沉淀蛋白质。细菌沉淀物在1 mL 1X PBS中重新悬浮并洗涤两次。通过离心去除PBS，然后将细胞沉淀物在95°C下热灭活60分钟，并通过珠子敲打或超声波处理来裂解。对于珠子敲打，将沉淀物在裂解缓冲液中（50 mM NH4HCO3，10 mM MgCl2，0.1% NaN3，1 mM EDTA，7 M尿素，2 M硫脲，5 mM DTT，pH≈7.4；每25 mg沉淀物1 mL裂解缓冲液）中重新悬浮，并使用氧化锆珠子（每30 Hz脉冲六次，脉冲之间冷却）进行破坏。对于超声波处理，将沉淀物在裂解缓冲液中（每25 mg沉淀物1 mL裂解缓冲液）中重新悬浮，并在冰上以80%的功率超声处理15分钟（输出3）。然后将它们在4°C下保持5分钟，然后在相同条件下再次超声处理。在这两种裂解液中，蛋白质用25%三氯乙酸在4°C下过夜沉淀。然后，裂解液以15分钟，13000 rpm，4°C离心，蛋白质用250 μL冷水和1 mL冷丙酮洗涤两次（Rabodoarivelo等人，2016年）。最后，蛋白提取物用50 mM NH4HCO3和1 M尿素（每25 mL滤液或250 μL全细胞提取物200 μL）重新悬浮。蛋白质浓度使用Bradford方法（OD595/OD450）测定（Zor和Selinger，1996年）。在SDS-PAGE之前，样品用10 M尿素和6X加载缓冲液（35% Tris/SDS，30%甘油，10% SDS，33% 2-mercaptoethanol，还原条件，0.012%溴酚蓝）处理，然后加热至90°C 5分钟。

Western blot分析使用标准程序进行。主要抗体（Anti-Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 Antibody（A86648），antibodies.com）或（Anti-Mycobacterium tuberculosis CFP-10 Antibody（A86662），antibodies.com）的浓度为0.5 μg/mL。secondary抗体（Anti-Rabbit IgG（全分子）–Alkaline Phosphatase抗体，由山羊产生；Sigma-Aldrich）的稀释度为1:20000。使用0.165 mg/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚酚磷酸（BCIP）和0.33 mg/mL硝基蓝 tetrazolium（NBT）在缓冲液（100 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，1 mM MgCl2；pH≈9.0）中显色膜。星号表示基于单因素方差分析（one-way ANOVA）和随后的Tukey事后检验得出的统计显著性（ns p > 0.05；*p < 0.05；**p < 0.01）。统计分析使用GraphPad Prism 9.0.0版本（GraphPad Software公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行。

删除ctpF和mmpL7会改变MtbH37Rv的脂质谱。分析分枝杆菌细胞包膜的脂质成分对于理解与突变菌株毒力相关的微生物特性尤为重要。因此，对分枝杆菌脂质谱进行了初步表征。这些脂质是根据它们在硅胶板上的迁移率来鉴定的（Sacco等人，2010年；Pandey等人，2023年）。如图6A所示，检测到了如磷脂酰肌醇甘露糖苷（PIM）和海藻糖6,6'-二麦角酯（TDM，也称为“cord因子”）等糖脂。具体来说，MtbH37RvΔctpF菌株的TDM谱与MtbH37Rv不同，其中高极性PIM的含量在接种点附近减少（图6A）。此外，MtbH37RvΔctaF的一个TDM条带发生了移动，其迁移率相对于MtbH37Rv和MtbH37RvΔmmpL7菌株有所降低。相比之下，MtbH37RvΔmmpL7菌株的PIM和TDM谱与MtbH37Rv相似，条带的强度和保留因子也相当。在Mtb菌株中未检测到海藻糖单麦角酯（TMM）区域的变化（图6A）。

另一方面，MtbH37Rv、MtbH37RvΔctpF和MtbH37RvΔmmpL7的三酰甘油（TAG）和PDIM的薄层色谱（TLC）显示了相似的定性谱（图6B）。观察到了三个不同的PDIM条带，这些条带可能对应于结构上的变异，这些变异体现在植酸链的长度以及是否存在酯基或酮基（Camacho等人，2001年）。PDIM存在多种结构形式，包括PDIM-A、PDIM-B和PDIM-C，其中PDIM-C的结构尚未被完全表征（Siméone等人，2007年；Chauhan等人，2013年；Krishnamoorthy等人，2021年；Lu等人，2024年）。尽管各菌株间的总体PDIM谱型相似，但MtbH37RvΔmmpL7提取物在两种提取系统（氯仿-甲醇和石油醚）中显示出更强的PDIM-B条带（图6B）。这一观察结果表明PDIM物种的相对分布发生了质的变化；然而，本研究没有进行密度计或质谱定量分析。

图6

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**MtbH37Rv、MtbH37Rv?ctpF和MtbH37Rv?mmpL7菌株提取的脂质物的薄层色谱（TLC）。** A. 使用氯仿-甲醇提取糖脂。TLC使用（65:25:4）氯仿:甲醇:水作为流动相，并用1%蒽酮在浓硫酸中显色。** B. 使用氯仿-甲醇（C:M）或石油醚（Et）提取脂质。TLC使用（9:1）Et:乙醚作为流动相，并用10%磷钼酸显色。

**参与PDIM生物合成的基因在MtbH37Rv?ctpF和MtbH37Rv?mmpL7菌株中下调**

为了评估删除ctpF和mmpL7是否会影响参与PDIM生物合成和转运的基因的转录（Cox等人，1999年；Jain和Cox，2005年；Giovannini等人，2012年；Quigley等人，2017年；Rens等人，2021年），通过qRT-PCR定量了mas、drrC和lppX的表达水平。如图7所示，这三个基因在两个突变菌株中都显著下调，与亲本菌株相比。值得注意的是，MtbH37RvΔctpF中的转录抑制更为明显，这表明ctpF（编码Ca2+-ATP酶）的破坏对PDIM相关基因具有更广泛的调控影响。此外，MtbH37RvΔmmpL7中mas、drrC和lppX的表达降低表明，mmpL7（一种参与PDIM输出的转运蛋白）的破坏也影响了参与PDIM相关功能的基因的转录。

图7

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**Mtb菌株中参与PDIM生物合成和转运的某些基因的转录谱。** 转录水平表示为基因表达相对于突变菌株（MtbH37RvΔmmpL7和MtbH37RvΔctpF）与对照菌株（MtbH37Rv，转录比约为1.0）的比率。相对基因转录被标准化为16S rRNA（管家基因）。绘制的值代表四次技术重复实验的平均值±标准偏差。星号表示通过双因素方差分析（two-way ANOVA）和随后的Sidak多重比较检验确定的统计显著性（ns p > 0.05；*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001；****p < 0.0001）。统计分析使用GraphPad Prism 9.0.0版本（GraphPad Software公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行。

**MtbH37Rv?ctpF和MtbH37Rv?mmpL7仍具有分泌免疫调节抗原ESAT-6和CFP-10的能力**

鉴于ESAT-6和CFP-10在Mtb感染中的关键作用（Anes等人，2023年）以及它们与PDIM的关联（Augenstreich等人，2017年），我们评估了删除ctpF或mmpL7是否会影响这些抗原在突变菌株中的产生。在MtbH37Rv菌株中，通过超声波处理或珠磨获得的整体细胞提取物中未检测到ESAT-6和CFP-10抗原。这可能是由于它们在细胞内的含量低以及所使用的比色检测方法的灵敏度有限（图8A）。因此，分析集中在培养上清液中检测到的28至36 kDa之间的分泌部分，作为ESAT-6阳性条带（图8A）。CFP-10显示两条条带：一条在相同的范围内（28至36 kDa），另一条在约10 kDa（图8B）。此外，MtbH37RvΔctpF和MtbH37RvΔmmpL7菌株也分泌ESAT-6，条带位于28至36 kDa之间（图8C）。同样，在突变菌株中也检测到CFP-10，有两条条带，一条在28至36 kDa之间，另一条在大约10 kDa（图8D）。

图8

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**在Mtb菌株中检测ESAT-6和CFP-10抗原（15 μg蛋白质）。** A. 通过超声波处理（SW）或珠磨破坏（SB）从MtbH37Rv整体细胞裂解物中提取的ESAT-6和B. CFP-10，以及培养上清液（CS）中提取的ESAT-6和CFP-10。** C. 从MtbH37Rv、MtbH37RvΔctpF和MtbH37RvΔmmpL7菌株的培养上清液中获得的ESAT-6和DFP-10。** 使用抗-Mtb ESAT-6和抗-Mtb CFP-10的一级抗体（浓度为0.5 μg/mL）进行检测，然后使用抗兔IgG（全分子）-碱性磷酸酶结合物进行二级检测，稀释比为1:20000。使用NBT-BCIP溶液显色。分子量标记：预染的蛋白梯度（250 kDa）。图表制作于https://BioRender.com。

**讨论**

本研究整合了在质膜转运蛋白CtpF和MmpL7缺陷的Mtb菌株的表型和分子特征。与亲本菌株相比，突变菌株的菌落粗糙度显著降低（图2）。Mtb的菌落粗糙度与称为“cord因子”的延长、蛇形表面结构的存在有关，这是毒力强Mtb菌株的特征（Lerner等人，2020年；Gong等人，2023年）。先前的研究表明，PDIM水平改变的突变Mtb菌株形成的菌落形态更平滑，毒力也减弱（Cox等人，1999年；Giovannini等人，2012年）。因此，MtbH37RvΔctpF和MtbH37RvΔmmpL7菌株中观察到的菌落粗糙度降低与细胞包膜脂质组成的改变一致，这反过来影响了细胞表面的疏水性以及与毒力相关的表型（Hunter等人，2006年）。相应地，这两种突变菌株的细胞表面疏水性也显著降低（图3）。这可能反映了分枝杆菌包膜中表面脂质的水平降低或空间分布的改变。在这种情况下，采用了菌落扩散实验来评估细菌表面特性对细胞在7H9-OADC琼脂板上扩散能力的影响（图5）。MtbH37RvΔctpF菌株在琼脂表面的扩散能力显著降低，这一表型可归因于其细胞表面疏水性的降低。相比之下，尽管细胞表面疏水性降低，MtbH37RvΔmmpL7菌株的扩散能力与MtbH37Rv相当。

在生物膜形成实验中也观察到了类似的趋势，MtbH37RvΔctpF菌株的生物膜形成能力显著降低，而MtbH37RvΔmmpL7菌株之间的差异不显著（图4）。为了进一步阐明突变菌株中观察到的表型，我们分析了与这些细胞过程相关的细胞壁脂质谱。如图6A所示，MtbH37RvΔctpF菌株的TDM谱发生了改变。这些变化可能是由于合成了含有结构改变的植酸链的TDM物种，导致极性不同（图6A）。这样的改变与观察到的菌落粗糙度变化一致，因为cord因子的减少表明TDM在MtbH37RvΔctpF细胞包膜中的掺入和/或结构修饰减少。这些效应可能与细胞内Ca2+稳态的紊乱有关，这可能影响多种细胞过程和调控途径（Kruh等人，2008年；Campbell等人，2015年；Yeruva等人，2016年）。

相反，MtbH37RvΔmmpL7菌株的PDIM-B条带强度出现明显变化（图6B），这与mmpL7在PDIM向细胞表面输出中的作用一致。因此，如先前报道的，mmpL7的破坏导致PDIM在细胞内滞留（Cox等人，1999年；Camacho等人，2001年）。PDIM转运受损与MtbH37RvΔmmpL7观察到的更平滑的菌落形态一致，也可能是其毒力减弱的原因（Cox等人，1999年；Giovannini等人，2012年）。

重要的是，由于mmpL7的删除和ctpF删除导致的Ca2+稳态改变可能共同影响了膜组织和宿主-病原体相互作用。虽然PDIM的滞留可以改变细胞包膜中的脂质分布（Jain和Cox，2005年；Sulzenbacher等人，2006年），但Ca2+平衡的破坏可能会影响酶活性和应激信号通路（Domínguez，2018年）。脂质结构和离子稳态的紊乱可能会损害细胞内持续性所需的协调反应。

**Ca2+稳态改变与脂质生物合成之间的生物学合理联系涉及前体利用率的变化。** 多酮合酶，包括那些负责PDIM合成的酶（PpsA-E），需要马来酰-CoA（Azad等人，1997年）和其他酰基-CoA衍生物，这些衍生物是通过乙酰-CoA羧化酶（ACC）产生的（Polyak等人，2012年；Tong，2013年）。羧化反应需要ATP和Mg2+来稳定磷酸盐的负电荷并促进酶促机制（Polyak等人，2012年）。根据它们在细胞内的浓度，Ca2+和Mg2+会竞争蛋白结合位点（Dudev和Lim，2014年）。Ca2+稳态的改变可能会影响Mg2+依赖的代谢过程，从而影响脂质生物合成的前体利用率，减少马来酰-CoA的可用性，并改变脂质谱。

尽管基因互补是确认基因删除与表型之间关系的重要方法，但ctpF和mmpL7突变体的互补在技术上具有挑战性。最初尝试使用hsp60强启动子下的载体pMV261进行互补；然而，所得菌株表现出异常的生长行为，未能恢复野生型（WT）表型（Maya-Hoyos，2021年）。因为生理表达水平对膜转运蛋白至关重要，目前正在开发使用中等启动子的整合载体进行进一步的互补策略。尽管如此，这里描述的表型与mmpL7在PDIM输出中的作用（Cox等人，1999年；Camacho等人，2001年）和ctpF（一种Ca2+ P型ATP酶）的作用（Maya-Hoyos等人，2019年）是一致的。独立实验的可重复性支持了突变体和WT菌株之间比较的有效性。

为了补充脂质分析，对参与PDIM生物合成和转运的选定基因（lppX、drrC和mas）进行了转录谱分析（Astarie-Dequeker等人，2009年；Cambier等人，2014年）。drrC基因编码一个ATP结合盒（ABC）转运蛋白复合体的组成部分，该复合体与mmpL7协同作用将PDIM输出到细胞表面（Moolla，2020年）。与此作用一致，缺乏mmpL7的Mtb菌株可以在细胞质中合成PDIM，但无法将其转运到细胞周边，通常表现出PDIM转运相关基因的表达降低，正如本研究中观察到的（图7）（Camacho等人，1999年；Cox等人，1999年）。同样，lppX编码一种细胞周质脂蛋白，通过直接的蛋白质-脂质相互作用在细胞表面定位PDIM（Sulzenbacher等人，2006年），在两种突变菌株中也表现出表达降低。此外，mas编码负责生成PDIM的植酸前体的多酮合酶，这些前体酯化到PDIM的植酸骨架上（Jain和Cox，2005年），在两种突变体中也表现出转录水平降低（图7）。转录分析显示，这些基因（lppX、drrC和mas）在MtbH37RvΔctpF和MtbH37RvΔmmpL7菌株中的表达降低，与突变菌株中观察到的脂质谱改变一致，反映了细胞对包膜组成变化的协调反应。然而，这些转录变化应被视为关联反应，而不是调控机制的直接证据。尽管这种转录抑制可能反映了了对脂质失衡或细胞包膜重塑的反馈反应，但将转运蛋白功能障碍与这些转录变化联系起来的确切调控机制仍然不清楚。另一个有趣的问题是，ctpF和mmpL7的突变是否会影响免疫优势抗原（如ESAT-6和CFP-10）的产生。众所周知，ESAT-6和CFP-10形成一个异二聚体蛋白复合物（Renshaw等人，2002年），该复合物的功能是调节吞噬体的成熟（Tan等人，2006年）。在培养上清液中检测到的28至36 kDa之间的免疫反应带代表了一个更高层次的复合物（图8）。由于已知ESAT-6和CFP-10形成1:1的紧密异二聚体（Renshaw等人，2002年），这个信号可能对应于一个保持不变或重新结合的ESAT-6/CFP-10复合物。值得注意的是，据报道ESAT-6在某些条件下可以形成自组装的复合物并表现出结构稳定性（Daugelat等人，2003年；Bates等人，2024年），这可能解释了观察到的迁移模式的变化（图8）。然而，由于分析是在变性SDS-PAGE条件下进行的，因此无法在本研究中确定检测到的条带的精确组成。需要使用native PAGE、化学交联或质谱来确认其身份。

考虑到本研究的目的，以及ESAT-6和CFP-10是与毒力和T细胞激活密切相关的结核分枝杆菌（Mtb）主要抗原（Brandt等人，1996年；Brodin等人，2005年；Wu等人，2008年），评估这些抗原在突变菌株中的产生情况尤为重要，因为这进一步支持了它们在潜在疫苗策略中的重要性，尽管对其构象状态的了解还不完整。PDIM与ESX-1之间的关系已被认为是协同的毒力机制，而不是独立的途径。先前的研究表明，PDIM缺陷菌株表现出ESX-1介导的分泌改变和吞噬体破坏减少，这支持了脂质组成和蛋白质分泌系统之间的功能相互作用（Jones等人，2024年；Weaver等人，2026年）。在这种情况下，我们发现的突变菌株中ESAT-6和CFP-10分泌的保持表明，尽管PDIM相关途径存在改变，ESX-1的活性依然存在。

尽管本研究没有包括巨噬细胞或动物感染实验，但观察到的几种表型特征，包括脂质谱型的改变和与毒力相关的基因表达变化，被广泛认为是Mtb致病潜力的替代标志物。因此，这些发现提供了机制上的见解，补充了之前基于感染的个别突变体研究，并为未来构建双突变体菌株提供了依据。

结论

本研究的结果表明，MtbH37RvΔctpF和MtbH37RvΔmmpL7突变体表现出与毒性相关特征改变一致的表型特性。这两种突变体在菌落形态和表面疏水性方面都显示出变化，反映了细胞包膜的结构重塑。与这些观察结果一致，转录分析显示参与PDIM代谢的基因表达减少，这与检测到的脂质谱型变化相符。然而，这种关联背后的调控机制仍有待阐明。值得注意的是，这两种突变体都保留了ESAT-6和CFP-10的分泌，这表明尽管包膜发生了改变，关键的免疫原性特征仍然得以维持。

本研究存在一些局限性，需要予以考虑。分析仅限于体外表征，并不能直接反映细菌在感染模型中的行为。此外，脂质谱型分析基于定性的TLC方法，而ESX-1的活性则是通过检测ESAT-6和CFP-10来间接评估的。另外，通过功能互补作用未能在生理条件下恢复野生型（WT）表型。总的来说，这些局限性表明观察到的表型应被解释为微生物特征的改变，而不是毒力减弱的直接证据。尽管如此，结果支持膜转运过程与Mtb通常与毒力相关的特征之间存在关联。