综述：目前关于干细胞在异种移植中应用的研究视角

《Current Tissue Microenvironment Reports》：Current Perspectives on the Use of Stem Cells in Xenogeneic Transplantation

　　摘要
**综述目的**
本综述的主要目的是评估先前进行的异种间充质干细胞（MSC）移植相关的免疫排斥率，并确定参与这些研究的动物物种。

**最新发现**
基因敲除策略是一种非常有前景的跨物种移植方法，特别是在人类中。这一点至关重要，因为人体自然会产生各种抗体，这些抗体会触发免疫排斥反应，不仅影响细胞和组织移植物，还会影响去细胞化支架。关节微环境因其独特的免疫特权特性（尤其是多形核白细胞的浸润较低）而成为MSC移植的理想目标。

**总结**
干细胞（SCs）是未分化的细胞，具有自我更新能力和分化为不同细胞谱系的不同潜力。这些内在特性为干细胞在人类和兽医医学中的广泛应用打开了大门。然而，在同种异体或异种异体移植的情况下，免疫排斥仍然是一个重大障碍。这一机制主要涉及属于主要组织相容性复合体（MHC）的人类白细胞抗原（HLA）分子。相比之下，由于MSCs表面表达的MHC clas II和HLA-DR分子水平较低，因此在免疫学上被认为是有特权的。这些特征可能为使用异种MSC治疗各种疾病提供关键优势。本研究通过系统搜索2003年至2023年间发表在SciELO和PubMed数据库中的文章，发现80%的记录病例中没有出现排斥的临床症状。此外，80%的靶性疾病影响肌肉骨骼系统，研究涵盖了五种物种：人类、马、狗、小鼠和牛。大多数研究人员（60%）进行了间充质干细胞（MSC）移植，而20%使用了造血干细胞（HSCs）。输入的MSC剂量因所涉及的物种而异。总体而言，在过去二十年中，关于SCs与异种移植的研究数量有限。作者建议进行更多严格的研究，以确证这种治疗方法的临床有效性。

**引言**
成体干细胞（SCs）有两个主要类别：造血干细胞（HSCs），它们位于骨髓中，能够分化为所有血细胞谱系；以及间充质干细胞（MSCs），它们存在于各种组织的基质部分以及骨髓中[1]。许多血液系统疾病和原发性免疫缺陷疾病从同种异体HSC移植中受益匪浅。然而，这种手术可能会引发一种称为移植物抗宿主病（GVHD）的不良免疫反应。通过分子生物学技术常规验证供体-受体兼容性，以识别主要组织相容性复合体（MHC），在人类中称为人类白细胞抗原（HLA-A和B/HLA-DRB1/HLA-DQB1）系统。尽管进行了这些匹配努力，大约35%的HLA相同的受体仍会遭受GVHD的影响。这种干预措施（传统称为骨髓移植）已成功恢复了患有白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤的患者以及严重再生障碍性贫血和某些自身免疫性疾病患者的免疫力[2]。
每当在供体与受体之间进行同种异体或异种异体细胞、组织或器官移植时，都可能因宿主对移植物抗原的免疫反应而引发排斥[图1]。这种免疫事件的特点是T细胞增殖和涉及细胞因子、趋化因子和粘附因子上调的炎症级联反应[3]（图2）。免疫激活可以通过直接或间接的同种识别途径发生。CD4+ T淋巴细胞的刺激会释放白细胞介素（IL）-2、IL-4、IL-5、肿瘤坏死因子-β（TNF-β）和干扰素-γ（IFN-γ），从而增强巨噬细胞活性和一氧化氮（NO2）的分泌。这进一步加剧了炎症，激活CD8+ T淋巴细胞、产生抗体的B淋巴细胞（BL）和补体系统，最终导致组织溶解[4]。

**免疫排斥机制**
相比之下，MSCs具有强大的免疫调节能力；它们可以使巨噬细胞向抗炎（M2）表型极化，并干扰B细胞活性[5]、T细胞增殖、自然杀伤（NK）细胞细胞毒性以及树突状细胞（DCs）上共刺激分子的表达[6]。此外，MSCs通过分泌或抑制各种生长因子和细胞因子来有效调节组织微环境并发挥抗炎作用，这种机制被广泛认为是旁分泌活性。这一过程中的关键因素包括血管内皮生长因子A（VEGF-A）；血小板衍生生长因子B（PDGF-B）；血管生成素-1（ANG-1）；白细胞介素-11（对多种组织的造血和细胞增殖至关重要）；抗炎蛋白TNF刺激基因6（TSG-6）；基质细胞衍生因子1（SDF-1），它介导细胞迁移；肝细胞生长因子（HGF）；以及胰岛素样生长因子1（IGF-1）。此外，MSCs促进离子、分子、线粒体、mRNA和细胞外囊泡（或外泌体）的细胞间传递，与先天性和适应性免疫系统动态相互作用[7, 8]。
除了这些内在特性外，MSCs还表现出独特的特性，理论上使它们在其他体细胞中具有明显优势，从而支持其在同种异体和异种异体移植中的应用。其中最突出的是它们表面表达的MHC clas II和HLA-DR分子水平较低[9]。在这一背景下，科学界普遍认为MSC输注疗法是安全的，研究人员积极探索由自体、同种异体和异种SC来源引起的不同免疫反应[10,11,12,13,14]。
除了上述内在细胞机制外，培养基条件也起着关键作用，因为它们可作为细胞分化因素，促进针对需要再生的特定组织的治疗，并显著推进组织工程领域[15]。还必须仔细考虑供体和受体物种之间的系统发育关系，因为不同物种携带的基因编码的蛋白质经常成为人类和其他物种免疫系统的主要靶标[16]。
尽管MSC具有这些独特特性，但仍无法完全保证其移植完全无排斥风险。尽管存在这些临床障碍，旨在快速可靠地获取SC的替代治疗策略正在全球范围内扩展。鉴于上述情况，本研究旨在系统地回顾现有出版物，并评估进行SC异种移植的研究人员报告的结果，试图回答一些关键临床问题：之前的研究中是否存在排斥迹象？移植是在哪些物种之间进行的？这些疗法针对哪些具体疾病？作者是否充分描述了与SC识别和培养相关的方法学方面？最终，本研究旨在回答这些问题，并为未来的随机临床试验和临床筛选提供基础框架。

**材料与方法**
2024年4月，在SciELO和PubMed数据库中进行了全面的系统搜索，使用了以下布尔搜索字符串：stem cells AND xenogeneic AND transplant（图3）。搜索范围限制在20年的出版时间窗口内，涵盖2003年至2023年。选择标准明确针对临床筛选和随机对照试验（RCTs）。纳入标准严格定义为进行了异种移植并在治疗过程中使用了SCs。SciELO数据库的搜索产生了两个结果。第一个结果与鱼类生殖细胞的异种移植使用有关，而第二个结果仅关注SC的体外培养；因此，这两个结果都被排除在本研究的最终分析之外。PubMed数据库的搜索共检索到十篇出版物。经过严格的筛选过程后，有两项研究因使用“非异种”细胞和材料而被排除，一项研究因涉及免疫系统细胞移植而被排除，还有两项研究因集中于去细胞化异种移植而被省略。最终，有五项研究符合纳入标准，并被纳入本综述以进行后续描述性分析。

**结果**
在涉及异种移植的分析研究中，60%报告了积极的临床结果。相反，只有一项研究（20%）记录了免疫排斥的迹象。对供体和受体物种的分析表明，SC疗法正在人类和兽医医学中得到积极研究。五种物种主要参与了异种移植试验：人类、马、牛和小鼠。值得注意的是，80%的SC异种移植病例针对肌肉骨骼系统疾病，其中一半明确针对骨关节炎的治疗。关于使用的成体SC类型，60%的研究人员进行了MSC移植，而20%使用了HSCs。在评估细胞供体来源时，异种SC占移植的60%，占大多数研究。其次是自体SC（40%），它们与异种基质联合使用。输入的SC浓度在不同物种间存在显著差异。表1展示了使用SC进行异种移植治疗的疾病概述。

**关于SC识别和培养的方法学报告**
Lamas等人（2012）指出，细胞来自骨髓，并在两周内培养至达到20×10^6个细胞的产量；然而，作者没有详细说明SC识别和培养的具体方案。同样，Salguero等人（2014）简要提到细胞从外周血中分离出来，但没有进一步阐述。相比之下，Wildburger等人（2014年）指出这些细胞是在体外培养的，并通过荧光激活细胞分选（FACS）分析进行了彻底的表征。这一分析确认了间充质干细胞（MSC）的典型形态，显示出CD90、CD73和CD105的阳性表达，同时CD14、CD19和CD45的表达为阴性。尽管Pigott等人（2013年）和Brondeel等人（2023年）从不同组织中获取了MSC，但他们都详细阐述了MSC处理的关键方面。他们采用了高度相似的方法论，详细描述了从初始获取、体外扩增和冷冻保存到给药整个过程，如表2所示。

表2 Pigott（2013年）和Brondeel（2023年）使用的MSC获取和培养方法

讨论
如前所述，同种异体移植和异种移植中的排斥风险直接与宿主免疫系统的激活有关，这会引发导致移植物溶解的反应。然而，在本综述分析的研究中，大多数研究者支持这种治疗方式的应用，因为没有观察到与异种和同种异体SC相关的排斥迹象，并且细胞移植后的结果总体上是积极的。在此背景下，需要强调的是，MSC与构成组织和器官的HSC和其他体细胞相比具有独特的特性；因此，应该认为它们在移植方面具有潜在的优势。

关于异种材料与SC联合使用的方面，Wildburger等人（2014年）使用去细胞化的牛骨基质结合自体骨髓抽取的SC来治疗双侧萎缩性上颌骨，发现与单独使用去细胞化的牛骨基质相比，在新骨形成方面没有显著差异[17]。2019年，Lamas及其同事由于在使用富含自体MSC的异种基质后观察到不良事件，不得不提前终止了一项涉及13名冈上肌腱撕裂患者的试验[18]。
具体来说，关于Lamas等人2012年的研究，虽然验证了移植排斥现象，但由于两个参与组都出现了不良反应，试验被中止。这些并发症归因于在修复旋转袖撕裂时使用了异种支架。尽管有一些有希望的结果，例如MSC治疗患者的Constant评分有所改善，但这些不良事件引发了关于使用这些支架的重大安全担忧。这使研究者得出结论，特别是对于较小的关节，采用非异种支架或无支架策略是必要的。值得注意的是，这些并发症与使用自体来源的MSC没有直接关联。另一个相关方面是，作者主要描述了与排斥相关的效应，但没有明确指出异种材料的供体物种。

目前，大多数关于人类异种移植的研究都集中在猪模型上，因为猪在解剖学和生理学上与人类相似。猪的alpha-Gal基因编码alpha-1,3-半乳糖转移酶，该酶合成了alpha-Gal抗原——这种碳水化合物分子在人类和其他灵长类动物中不存在。人类自然会产生抗-Gal抗体；因此，敲除这个基因可能使这些物种之间的异种移植变得可行。牛（Wildburger等人2014年使用的骨材料）拥有一个与alpha-Gal相似的基因，最近的研究探讨了使用CRISPR-Cas9技术来减轻免疫排斥，从而有利于跨物种移植到人类[16]。Salguero等人（2014年）通过将人类HSC移植到免疫缺陷小鼠体内实现了良好的免疫重建结果[19]。这一成功可能归因于几个因素，包括人类HSC分化为多种免疫细胞谱系（如B细胞、T细胞和NK细胞）的固有能力。此外，人类HSC能够与小鼠微环境相互作用并产生帮助刺激免疫反应的细胞因子。另一个可能与这种跨物种骨髓移植成功相关的关键方面是使用了人源化免疫缺陷小鼠模型，例如NOD-SCID IL2Rγnull（NSG）品系。这些模型为人类细胞的植入提供了高度许可的环境，因为它们缺乏功能性免疫系统，从而降低了移植细胞被排斥的风险[20]。

Pigott等人（2013年）对使用不同来源的MSC进行移植进行了比较分析。大约六匹被诊断为骨关节炎的母马接受了同种异体、异种或基因改造的自体MSC的治疗。该研究注意到，在关节内注射24小时后，异种和同种异体MSC伴随着中度的炎症反应，而自体MSC则没有。然而，据报道，在评估的临床指标（包括疼痛、蹄关节周长和活动范围）方面没有显著差异[21]。十年后，Brondeel等人（2023年）使用来自外周血的马源性异种MSC治疗患有骨关节炎引起的跛行的狗。作者报告说，在移植后六周，上述临床参数有所改善，这表明需要进一步的研究来证实这种治疗方法的有效性[22]。这些发现加强了MSC与宿主免疫系统之间独特的相互作用，部分解释了这些细胞在同种异体移植中的临床成功。

骨关节炎具有某些有利于使用同种异体MSC进行治疗的特点，因为它减少了排斥的风险，主要是因为该疾病与免疫抑制的关节微环境相关，这种环境抑制了对移植细胞的免疫反应。MSC的固有免疫调节特性和低免疫原性进一步加剧了这一效果。此外，由于骨关节炎涉及软骨降解和慢性炎症，因此迫切需要能够促进组织再生和减轻炎症的细胞，而MSC在这些方面表现非常出色[23]。

虽然研究者主要使用骨髓和外周血作为SC来源，但这些细胞也可以从其他组织中获取。可以肯定的是，尽管MSC主要在骨髓中被发现，但它们实际上存在于组织的间充质基质部分，并且可以通过微创程序从多种来源中分离出来，包括脂肪组织、胎盘、脐带和牙髓等。相反，HSC可以从脐带血、外周血和骨髓中获取[8, 24, 25]。这些多样的获取可能性非常有利于促进科学研究和临床研究中的细胞获取。

Pigott等人（2013年）和Brondeel等人（2023年）提供的SC程序的详细描述非常相关。2006年，Dominici等人通过国际细胞治疗学会（ISCT）发布了一份立场文件，制定了定义多能间充质基质细胞的最低标准。这些标准要求：在标准培养条件下具有可塑粘附能力；特定的表面抗原表达，其中MSC必须对CD105、CD73和CD90呈阳性（≥95%），对CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α或CD19以及HLA-DR呈阴性（≤2%）；以及能够在体外分化为脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞的多线谱系能力[9]。全面描述MSC鉴定、培养和分化程序的研究具有更高的方法学可靠性，因为它们严格遵循ISCT指南。

Wildburger等人（2014年）进行的分析程序表明MSC的免疫表型鉴定是正确的，尽管这只是ISCT要求的用于体内实验的MSC使用的步骤之一。FACS（荧光激活细胞分选）是一种先进的流式细胞术技术，允许根据细胞的特定光散射和荧光特性进行分析和物理分选。该方法使用荧光标记抗体来识别特定的细胞内和细胞外标记物。激光激发这些荧光物质，然后检测发出的荧光，从而能够将细胞精确分类为不同的亚群[26]。Lamas等人（2012年）报告了从骨髓中获取SC；然而，由于骨髓中同时含有HSC和MSC，因此必须使用已建立的ISCT指南来区分这些细胞群。

结论
干细胞类似于组织和实体器官，移植到相同或不同物种的个体时存在触发免疫反应的固有风险，这可能会影响移植过程。更深入地了解引发免疫排斥的具体分子和化合物，加上应用基因编辑等先进技术，可以显著促进跨物种移植。特别需要注意的是MSC，与其他体细胞和组织相比，它们表现出独特的免疫行为。由于其独特的特性，它们代表了推进同种异体和异种移植的一个非常有前景的方向。异种HSC移植仍然是一个巨大的临床挑战，特别是考虑到即使在HLA相同的人类受试者中，也观察到了约35%的排斥率。

在分析的研究中涉及了五个物种：人类、马、牛、犬和小鼠。根据供体和受体物种的分析，很明显，SC疗法正在被积极用于治疗人类和兽医疾病。记录的排斥迹象强烈表明这与使用异种支架和基质有关，而不是移植的同种异体或异种细胞本身的免疫原性。然而，由于分析研究的样本量较小，无法对此观察做出明确结论。针对关节软骨修复的治疗策略指出了使用异种和同种异体MSC移植的一个非常有前景的方向。这在很大程度上归因于关节微环境的免疫特权特性、软骨组织的中血管性质以及MSC本身的强大免疫调节特性。

对MSC获取和培养协议的牢固方法学理解将有助于未来研究的设计，从而更深入地理解其作用机制，并扩大其在大规模临床应用中的潜力。严格遵守ISCT指南将为基于MSC的研究提供更高的方法学严谨性和可信度。在过去二十年中，利用SC进行异种移植的临床筛选和随机对照试验的数量明显有限。因此，尽管报告的结果主要是积极的，但不能被认为是决定性的。作者普遍倡导进行更大规模、多中心的研究，以明确证实这种治疗方法的长期临床有效性和安全性。