基于线粒体DNA的罗马尼亚可食用睡鼠（Glis glis，啮齿目：睡鼠科）的系统发育多样性研究

《European Journal of Wildlife Research》：Phylogenetic diversity of the edible dormouse, Glis glis (Rodentia: Gliridae) in Romania, based on mitochondrial DNA

　　**摘要**
本研究探讨了食用睡鼠（Glis glis）的遗传多样性。这种啮齿动物与富含橡树和山毛榉的落叶林及混交林有着密切关联。研究重点分析了G. glis的系统地理分布模式和遗传结构，特别是罗马尼亚种群内部的遗传多样性及其与其他欧洲种群的关联。研究人员利用线粒体细胞色素b基因序列来分析遗传多样性和系统发育关系。我们从罗马尼亚的不同种群中收集了117个样本，并结合GenBank中的现有数据以提供更广泛的地理背景信息。研究证实了G. glis内部存在不同的系统发育分支，同时指出罗马尼亚种群的遗传多样性处于较低至中等水平。在分析的罗马尼亚种群中发现了5种单倍型，其中Hap_2和Hap_5与其他欧洲种群共有，其中Hap_2是欧洲种群中最常见的单倍型。其余3种单倍型为罗马尼亚特有：Hap_1分布于罗马尼亚南部Piscoiu地区，Hap_3和Hap_4则分布于东南部的Dobrogea地区。几乎所有被研究的种群都共享广泛分布的Hap_2单倍型，只有Piscoiu地区除外。这些发现有助于理解该物种的遗传结构，并对未来的保护工作具有指导意义。

**引言**
近年来，越来越多的证据表明不同G. glis种群存在显著的遗传和形态差异，这逐渐质疑了将其归为单一物种的观点。这一发现促使人们发现了隐藏的物种存在，并确认了地中海和Hyrcanian地区的重要冰川避难所，同时揭示了需要加以保护的深层系统地理结构（Hürner等人2010年；Naderi等人2014年；Koren等人2015年；Ahmadi等人2018年）。主要基于形态学和生态学数据，目前已描述了约9个亚种：Glis glis glis（Linnaeus, 1766）、G. g. italicus（Barrett-Hamilton, 1898）、G. g. melonii（Thomas, 1907）、G. g. pyrenaicus（Cabrera, 1908）、G. g. minutus（Martino, 1930）、G. g. argenteus（Zimmermann, 1953）、G. g. orientalis（Nehring, 1903）、G. g. germanicus（Violani in Zava, 1955）以及G. g. persicus（Erxleben, 1777）（Kry?tufek和Flaj?man 2007年；Kry?tufek等人2021年）。目前，Glis属仅被认可为两个物种（Kry?tufek等人2021年）：主要分布在欧洲的Glis glis（Linnaeus, 1766），以及主要分布于伊朗Hyrcanian森林的Glis persicus（Erxleben, 1777）。在欧洲范围内，意大利亚种Glis glis italicus（Barrett-Hamilton, 1898）（分布于意大利中部和南部以及西西里岛）已被提议提升为独立物种（Lo Brutto等人2011年；Gippoliti 2013年；Gippoliti和Groves 2018年；Kry?tufek等人2021年）。
基于遗传和形态学差异，尤其是生殖结构的差异，伊朗食用睡鼠Glis persicus被提升为独立物种（Kry?tufek等人2021年）。Ahmadi等人（2018年）的分子研究表明该物种具有复杂的进化历史，分为西部伊朗亚群（分布于Ardabil、Gilan、Mazandaran及可能的阿塞拜疆）和东部伊朗亚群（分布于Golestan）。

食用睡鼠（Glis glis Linnaeus, 1766）的原生分布范围广泛，覆盖了欧洲大陆大部分地区，向东延伸至小亚细亚、土耳其北部、高加索地区、伊朗北部和土库曼斯坦西南部。它通常栖息于西古北界的落叶林和混交林中，栖息地海拔最高可达1600米（Miller 1912年；Morris 1997年；Wilson和Reeder 2005年；Hürner等人2010年；Holden-Musser等人2016年；Aulagnier等人2018年）。其原生范围从比利牛斯山脉和西班牙北部向东延伸至俄罗斯西部，向南延伸至地中海地区（Kry?tufek 1999年；Kry?tufek和Vohralik 2005年；Amori等人2021年）。历史上曾提出了超过25个具体或亚种名称，主要基于毛色、体型、颅骨和牙齿特征的不同（Miller 1912年；Ellerman等人1940年；Ognev 1963年；Ellerman和Morrison-Scott 1966年；Kry?tufek 2010年）。尽管全基因组规模的研究仍有限，但现有研究已显著改变了睡鼠的分类学和保护策略（Kry?tufek等人2021年）。然而，针对西古北界地区该物种的遗传结构（Michaux等人2019年）和线粒体系统地理学（Hürner等人2010年）的研究并未包含罗马尼亚样本。在罗马尼亚进行的研究主要集中在物种分布及其生物学和生态学特征上（Duma等人2008年；Sevianu 2009年；Sevianu和David 2012年）。在罗马尼亚，该物种主要分布在以橡树和山毛榉为主的落叶林中，或与针叶林混生的林区，海拔最高约为2000米。它们也出现在岩石地带、果园和灌木丛中（Popescu和Murariu 2001年）。

分子数据显示，G. glis内部存在5个不同的遗传分支，其中大部分分布于地中海盆地：西西里分支、希腊分支、马其顿分支、意大利分支和欧洲分支（命名依据Hürner等人2010年的分类系统）（Castiglia等人2012年；Naderi等人2014年；Koren等人2015年；Moska等人2016年；Ahmadi等人2018年；Kry?tufek等人2021年；Mori等人2024年）。欧洲分支分布最为广泛，从英格兰延伸至土耳其。这一分支的系统发育深度较浅，其大部分来源于冰川期后单一单倍型的近期扩张（Hürner等人2010年；Koren等人2015年）。人们认为人类活动（包括罗马征服）促进了该物种的扩散，因为在古罗马饮食中它被视为珍馐（Hürner等人2010年）。由于历史因素和现代人类活动的影响，欧洲范围内的食用睡鼠分布呈现碎片化特征（Michaux等人2019年）。这种碎片化可能导致种群隔离、基因流减少以及潜在的近亲繁殖，从而威胁物种的遗传健康和生存（Crooks等人2017年；Lino等人2019年；Hawlitschek等人2023年）。历史因素和过去的气候事件也对遗传结构形成起到了作用。

睡鼠种群中的遗传分化也可能反映了冰川期后的殖民过程和适应环境变化的趋势（Herdegen等人2016年；Michaux等人2019年）。这一现象突显了睡鼠遗传变异的复杂性，当代的碎片化进程和历史进程共同塑造了当前的遗传格局（Hürner等人2010年；Naderi等人2014年；Koren等人2015年；Ahmadi等人2018年；Kry?tufek等人2021年；Mori等人2024年）。多项研究表明，G. glis在其欧亚大陆范围内的遗传同质性较高，这强调了了解其遗传多样性的重要性，不仅对有效保护栖息地至关重要，也有助于重建其进化历史并预测未来趋势（Helvaci等人2012年；Herdegen等人2016年；Moska等人2016年）。在欧亚生物地理背景下，喀尔巴阡山脉构成了有效的生物地理屏障，同时也是许多动植物的重要避难所（Mráz和Ronikier 2016年；Mamos等人2021年；Iorgu等人2023年）。中欧地区的动植物分布受到喀尔巴阡山脉及主要河流多瑙河的影响。

因此，本研究旨在通过线粒体细胞色素b标记来确定罗马尼亚食用睡鼠种群的遗传多样性，并探讨喀尔巴阡山脉和多瑙河对该物种生物地理分布及遗传结构的影响。了解这些种群的遗传结构将有助于深化对该物种遗传变异的认识，并为未来的保护策略提供依据。

**材料与方法**
研究区域和样本收集
共收集了117个G. glis样本，来源包括野外调查和博物馆藏品。野外调查在罗马尼亚的三片森林中进行：Ro?ia（Hunedoara县，46°01’03.7"N, 23°05’59.3"E）、Dumbr?veni森林（43°58’18.6"N, 27°59’31.7"E）和Negureni森林（44°04’47.2"N, 27°44’52.8"E），这些地点均位于Constan?a县。我们采用非侵入性方法——在木质巢箱中收集样本（Lefort等人2022年），该方法对食用睡鼠的影响最小。我们放置了50个巢箱，尺寸分别为14×14×21厘米和20×20×30厘米，入口直径分别为3.5厘米和4厘米，巢箱放置高度为2-2.5米，朝向树干方向。2018年在Ro?ia森林放置了20个巢箱，2021至2023年间在Dumbr?veni和Negureni森林各放置了15个巢箱。

此外，还收集了存放在布加勒斯特Grigore Antipa国家博物馆哺乳动物收藏馆中的组织样本，这些样本来自Vrancea县的Ti?i?ei峡谷（45°56’25.3"N, 26°35’09.4"E）、Maramure?县的Vaserului山谷（47°47’17.2"N, 24°41’41.5"E）、Gorj县的Piscoiu（44°49’29.7"N, 23°43’31.0"E）以及Valcea县的Lotru山谷（45°26’12.4"N, 23°52’20.7"E）。

为了分析喀尔巴阡山脉对罗马尼亚G. glis遗传多样性分布的影响，我们将样本种群分为两组：位于喀尔巴阡山脉内部的种群（Ro?ia、Ti?i?ei峡谷、Lotru峡谷、Vaser山谷）和位于山脉外的种群（Piscoiu以及Dobrogea地区的Negureni和Dumbr?veni）（图1）。

**图1**
罗马尼亚G. glis的采样地点。地图显示了本研究中分析的样本地理分布：（1）Ro?ia（Hunedoara县）；（2）Dumbr?veni（Constan?a县）；（3）Negureni（Constan?a县）；（4）Piscoiu（Gorj县）；（5）Ti?i?ei峡谷（Vrancea县）；（6）F?ina（Vaser山谷，Maramure?县）；（7）Lotrului峡谷（Valcea县）。符号表示各单倍型的出现频率百分比。

所有117个毛发和组织样本均单独放入含有96%乙醇的1.5毫升离心管中，然后置于-20摄氏度环境中保存。大部分样本来自四个采样点：Negureni（45个样本）、Dumbr?veni（57个样本）和Piscoiu（5个样本）（详情见在线材料表S1）。

为评估罗马尼亚种群与其他欧洲种群之间的系统发育关系，我们将新获得的数据与GenBank中已有的该物种序列数据合并（Hürner等人2010年；Castiglia等人2012年；Naderi等人2014年；Koren等人2015年；Moska等人2016年；Barbosa等人2013年；Benz和Montgelard 1999年；Fabre等人2013年；Mahmudi等人2023年；Perez等人2013年；Popova等人2021年；Reyes等人1998年；Yasuda等人2012年）。我们使用QGIS 3.42.0（QGIS开发团队，2025年）软件，通过将GenBank中的样本数据与IUCN红色名录中的G. glis分布信息叠加，制作了详细地图（图2）。地图显示了本研究中分析样本的地理分布情况，包括我们自己的样本以及GenBank中的样本。符号代表六个遗传谱系。分子实验室分析中，使用Meridian Bioscience公司的ISOLATE II基因组DNA试剂盒以及QiAGEN DNeasy Blood & Tissue试剂盒按照制造商的说明提取了总基因组DNA。使用Nanodrop ND-1000分光光度计（Thermo Fisher Scientific）验证了DNA的质量和浓度。然后使用特定的G. glis引物FGlis1和RGlis1扩增并测序了线粒体cytb标记的DNA片段，得到了713 bp的片段（Hürner等人，2010年）。PCR反应使用了4-6 μl的基因组DNA，每个引物的最终浓度为2 pM/μl，20 μl的2x AccuStart II PCR SuperMix（Quantabio LLC）和无菌水，最终体积达到40 μl。PCR的条件设置为：初始变性阶段在95°C下进行4分钟，随后是39个循环，每个循环分别为94°C 30秒、52°C 60秒和70°C 90秒，最后在70°C下延伸15分钟。PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶上显示，并用溴化乙锭（EtBr）染色。之后使用Wizard? SV Gel和PCR Clean-Up System（Promega）对产物进行纯化，并送交荷兰阿姆斯特丹的Macrogen-Europe公司进行测序。

数据分析、系统发育和遗传结构重建
由于细胞色素b（cytb）基因是该物种所有已知谱系中唯一有数据的遗传区域，因此我们的系统发育重建仅限于这个线粒体标记。我们使用了35个额外的Glis glis cytb序列、10个Glis persicus序列以及来自其他Gliridae物种的10个序列作为外群，这些序列从GenBank中下载（详见在线材料表S1）。
序列使用CodonCode比对软件（CodonCode Corporation，美国马萨诸塞州Dedham）和MEGA v.11（Tamura等人，2021年）进行比对和编辑。使用DnaSP v6（Rozas等人，2017年）估计了单倍型多样性（h）、核苷酸多样性（p）（Nei 1987）及其标准差（Tajima 1993）。我们使用最大似然算法（Felsenstein 1981）在MEGA v.11（Tamura等人，2021年）中进行了系统发育重建，并使用BEAST v1.8.0（Suchard等人，2018年）进行了贝叶斯推断。MEGA v.11还用于确定我们数据集的最佳DNA替换模型，基于信息准则（BIC）和校正的赤池信息准则（AICc），选择了一个具有伽马分布率变化的GTR模型。系统发育测试的稳健性通过非参数自举测试（最大似然法1000次重复）和贝叶斯后验概率（BPP）进行了评估。
BEAST分析进行了两次独立的10,000,000次马尔可夫链蒙特卡洛运行，每1000代抽样一次。BEAST包中的另外三个软件也被使用：Tracer v1.6用于检查两次独立运行的有效样本大小（ESS）下限，LogCombiner v1.8.0用于合并树文件，Tree Annotator v1.8.0用于生成具有平均高度的最大支系统发育树。烧录期设置为15%，初始抽样树中有1500棵被丢弃，树节点的贝叶斯后验概率（BPPs）和分歧时间来自50%多数规则共识树。我们使用Eliomys quercinus/Eliomys melanurus在7±0.9百万年前的分歧时间（Voloch和Schrago 2012；?olak等人，2025；?bi?等人，2025）。两种系统发育树都使用FigTree v1.8.0（Rambaut 2013）进行了可视化。
通过在中位数连接算法（Bandelt等人，1999）下构建的单倍型网络评估了不同种群之间的序列关系，该算法在PopART（Leigh和Bryant 2015）中实现。
为了推断人口历史，我们使用DnaSP进行了1000次共祖模拟来分析不匹配分布，这使我们能够区分历史稳定的种群和最近扩张或收缩的种群。此外，我们还进行了两项中性检验：Tajima的D（Tajima 1993）和Fu的Fs（Fu 1997），基于1000次排列，使用DnaSP。这些检验是在我们有五个以上样本的种群上进行的，以及所有罗马尼亚个体的混合样本上进行的。这些指数假设长期存在突变-漂变平衡（Nei和Kumar 2000）；因此，显著负值表明偏离了平衡状态，通常是由突然的人口或地理扩张驱动的（Jenkins等人，2018）。使用Arlequin版本3.5.1.2（Excoffier和Lischer 2010）计算FST并进行了AMOVA（分子方差分析）以确定变异来源并研究亚种的遗传结构。使用Kimura–2-参数（K2P）模型和1000次自举重复在MEGA v.11（Tamura等人，2021）中计算了种群间的遗传距离。

结果
序列变异和遗传多样性
我们分析了一组162个Glis样本的cytb序列，长度为713 bp，其中有10个序列作为外群。我们共识别出117个分离位点，其中95个为简约信息位点，平均核苷酸組成分别为T 27.9%，C 13.1%，A 32.5%，G 26.5%，以及6.6的转换对替换比率。这些序列产生了37个单倍型，其中Glis persicus有10个单倍型，Glis glis有27个单倍型。两种物种的单倍型多样性（Hd）和核苷酸多样性（Pi）有所不同，Glis persicus的值更高（表1）。我们在欧洲谱系中识别出22个单倍型，其核苷酸多样性（Hd = 0.46）和单倍型多样性（Pi = 0.011）处于中等至高水平，与其他研究的结果相似（Hürner等人，2010；Naderi等人，2014；Koren等人，2015；Ahmadi等人，2018；Kry?tufek等人，2021）（表1）。在四个罗马尼亚种群的114个个体中，仅识别出4个多态位点，全部为简约信息位点。总体而言，罗马尼亚样本的单倍型多样性（Hd = 0.38）和核苷酸多样性（Pi = 0.001）低于其他属于欧洲支系的样本。Negureni（Hd = 0.31，Pi = 0.001）和Dumbr?veni（Hd = 0.39，Pi = 0.001）的东南部种群观察到最高的序列变异和遗传多样性值。

表1 Glis种群的遗传多样性估计：N（个体数量），S（分离位点），P（简约信息位点），H（单倍型数量），Hd（单倍型多样性），Pi（核苷酸多样性），SD（标准差），Fs（Fu的Fs统计量），D（Tajima的D检验）。第一列展示了四个罗马尼亚种群的结果、罗马尼亚的混合样本、欧洲支系的混合样本、所有Glis glis样本和所有Glis persicus样本。

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单倍型网络分析
由于西西里和意大利的样本序列较短且数据缺乏，单倍型网络的构建中未包含这些样本，但仍然显示了五个G. glis谱系中的四个：希腊、马其顿、意大利和欧洲。希腊谱系由来自爱琴海Alonissos岛的单一序列代表，该序列与欧洲单倍群相差23个突变步长。马其顿谱系由来自四个地点的三个序列代表，意大利谱系由来自Apromonte的单一序列代表，它们分别距离最近的欧洲单倍型15个和14个突变步长。欧洲谱系呈现出经典的星形结构，Hap_2位于其中心，其余谱系距离它一个或两个突变步长（图3）。罗马尼亚的样本都归入欧洲单倍群。由于其在中枢位置且频率最高，我们可以将单倍型Hap_2视为欧洲支系的祖先单倍型。在其他单倍型中，Hap_20和Hap_19分别距离主导单倍型三个和五个突变步长。Hap_2（52.89%）在欧洲的49个地点被发现，其次是Hap_21（4.30%），在西方欧洲和西班牙的四个种群中被发现。在四个罗马尼亚样本中，我们共识别出五个不同的单倍型（Hap_1到Hap_5）。其中两个是国际共有的：普遍存在的Hap_2和Hap_5，它们也出现在法国的Vercors种群中。其余三个单倍型（Hap_1、Hap_3、Hap_4）是罗马尼亚特有的。Hap_2在78.45%的采样个体（117个中的91个）中被发现，出现在六个地点的个体中，在Piscoiu种群中完全不存在。Hap_1和Hap_4分别地理上局限于Piscoiu和Dumbr?veni森林，而Hap_3被Dumbr?veni和Negureni森林中的12个个体共享（详情见在线材料表S1，图S1）。
图3

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单倍型的中位数连接网络显示了Glis glis和Glis persicus。圆圈直径与分类单元的数量成正比。

系统发育分析和遗传距离
两种不同的系统发育方法得出了几乎相同的系统发育树（图4，详情见在线材料图S2）。贝叶斯推断和最大似然树与其他关于可食用睡鼠的系统发育结果一致，恢复了属于两个Glis物种的两个不同支系，所有其他识别出的单倍型都在第一个支系中（Naderi等人，2014；Koren等人，2015；Ahmadi等人，2018；Kry?tufek等人，2021）（图4，详情见在线材料图S2）。系统发育分析识别出了第一支系中先前发现的五个谱系：欧洲、意大利、马其顿、希腊和西西里，正如其他研究提到的，这些谱系之间不共享任何单倍型（Hürner等人，2010；Castiglia等人，2012；Naderi等人，2014；Koren等人，2015；Ahmadi等人，2018；Kry?tufek等人，2021）。在伊朗支系中，有两个独立的谱系，一个西部伊朗谱系和一个东部伊朗谱系，正如Ahmadi等人（2018）所描述的。基因距离的范围从Glis glis谱系之间的1.71%到5.55%，以及同一谱系内的0%到0.61%（表2）。

表2 根据K2P遗传分歧计算的主要Glis物种谱系内部和之间的平均遗传距离。对角线以下的数字代表主要谱系之间的K2P平均遗传距离，对角线以上的数字代表平均遗传距离的标准差，对角线上显示的是谱系内的平均遗传距离。

人口历史和遗传分化
我们使用可用样本重新评估了欧洲谱系的人口历史。我们得到了一个偏态的单峰分布，这通常与最近的人口扩张情景相符，正如Hürner等人（2010）和Koren等人（2015）之前你所建议的。总体而言，Tajima的D（D = -2.54，p < 0.001）和Fu的Fs（Fs = -26.61，p < 0.02）中性检验值均为负值，进一步支持了人口扩张理论，表明稀有等位基因过剩，且种群受到正选择或选择性清除的影响（表1）。不匹配分布（详见在线材料图S3）仅在混合的罗马尼亚样本上进行，以及得到的负Tajima的D值，也表明稀有等位基因过剩以及突然的人口扩张（表1）。同样的检验分别对每个有五个以上样本的四个罗马尼亚种群进行了测试。在Rosia和Piscoiu种群中未检测到cytb序列的遗传变异，也没有生成不匹配分布图形。同时，Negureni种群? D值为负，Dumbr?veni种群的值接近零且p值大于0.01。这两个种群都呈现双峰不匹配分布，这通常与种群规模恒定有关。
使用AMOVA分析了Glis种群之间的遗传结构。我们分别进行了AMOVA分析并计算了FST值，比较了四个罗马尼亚种群之间的差异，然后比较了不同组合之间的差异（即罗马尼亚种群与欧洲种群、喀尔巴阡山脉内部的罗马尼亚种群以及喀尔巴阡山脉外部南部的罗马尼亚种群）。在群体遗传学中，FST（固定指数）值的范围是从0到1，其中0表示完全混合（种群自由交配并共享所有遗传多样性），1表示完全分化（种群不共享任何等位基因）（Wright和Wright 1984）。值在0.15到0.25之间表示高度的遗传分化，而值大于0.25表示非常高的遗传分化。结果显示四个罗马尼亚种群与欧洲种群之间的遗传分化很小（Fst = 0.046）。喀尔巴阡山脉地区与罗马尼亚南部和东部的非喀尔巴阡地区（Negureni和Dumbr?veni）的种群之间存在20%的遗传差异（见表3和表4），种群间的FST值为0.329。Piscoiu种群被认为是最孤立的，其FST值最高（与Negureni的Fst值为0.784，与Dumbr?veni的Fst值为0.792，与Ro?ia的Fst值为1）。表3显示了四个罗马尼亚种群的计算出的FST值。表4显示了Glis种群中AMOVA分析的结果，自由度信息。

使用贝叶斯推断进行的分子年代测定估计，Glis物种的不同谱系的分化始于827万年前，即晚中新世时期（见图4）。首先分裂的是西西里谱系，随后是希腊谱系（502.3万年前），然后是马其顿谱系和意大利谱系（338.7万年前），这些谱系在上新世时期分化。这些年代测定分析得出的时间估计值高于Naderi（2014年）和Ahmadi（2018年）关于Glis属物种进化时间尺度的先前研究结果。

关于这张图像的替代文本可能是通过人工智能生成的。

基于贝叶斯推断分析的系统发育树和分化时间测定结果。

**讨论**

**系统地理模式与遗传分化**

Kry?tufek等人（2021年）对Glis属的最新修订将该属的G. persicus提升为独立物种，这一修订基于形态学证据以及先前进行的分子研究。Naderi等人（2014年）和Ahmadi等人（2018年）证明了该属内两个物种之间存在深层次的进化分化。此外，Ahmadi等人（2018年）深入研究了G. persicus物种的遗传多样性，并发现该物种内部存在明显的系统发育结构，表现为两个地理位置上分离的谱系。在我们的分析中，我们发现了高度的遗传分化（K2P = 2.1）以及复杂的单倍型网络，这支持了该地区存在隐秘遗传分化的观点。Ahmadi等人（2018年）推测这种遗传结构可能是由于不同的繁殖策略导致的，这些策略使得伊朗海兰卡尼安森林中的物种形成了独特的遗传结构。

我们的系统发育结果与其他研究者的发现一致，如Hürner等人（2010年）、Castiglia等人（2012年）、Naderi等人（2014年）、Koren等人（2015年）和Moska等人（2016年）的研究，并确认了Glis glis属内的五个谱系：欧洲谱系、马其顿谱系、希腊谱系以及意大利和西西里谱系（见图2）。

Mori等人（2024年）的研究基于分子和全面的形态学分析，仅提到了五个亚种：G. g. glis（分布在欧洲）、G. g. minutus（分布在北马其顿）、G. g. pindicus（分布在阿洛尼斯索斯岛）、G. g. italicus（分布在意大利中部和南部）、G. g. insularis（分布在西西里岛）（参见Hürner等人2010年；Lo Brutto等人2011年；Castiglia等人2012年；Koren等人2015年；Kry?tufek等人2021年；Mori等人2024年的研究）。这些Glis glis的五个亚种与其他研究基于分子数据得出的五个独立谱系相符（参见Hürner等人2010年；Castiglia等人2012年；Naderi等人2014年；Koren等人2015年；Moska等人2016年；Ahmadi等人2018年；Kry?tufek等人2021年；Mori等人2024年的研究）。欧洲谱系覆盖了整个欧洲范围，意大利谱系特指源自亚平宁半岛以及西西里岛和撒丁岛。马其顿谱系局限于北马其顿，希腊谱系则分布在阿洛尼斯索斯岛上。最后，西西里谱系集中于西西里岛的东部地区（参见Hürner等人2010年；Lo Brutto等人2011年；Castiglia等人2012年；Naderi等人2014年；Koren等人2015年；Kry?tufek等人2021年的研究）。我们的分析将西西里单倍型定位为所有谱系的基础，这一结论得到了贝叶斯后验概率（PP = 1）和自助法支持值（BP = 99）的强烈支持，与Naderi等人（2014年）、Koren等人（2015年）、Ahmadi等人（2018年）和Kry?tufek等人（2021年）的研究结果一致。构成希腊谱系的阿洛尼斯索斯单倍型形成了自己的群集，但统计支持度较低（PP = 0.999，BP = 84.1）。马其顿和意大利单倍型形成了一个单独的群集，这与Hürner等人（2010年）的预测相符，但支持度也非常低（PP = 0.564）。Castiglia等人（2012年）、Naderi等人（2014年）、Koren等人（2015年）和Ahmadi等人（2018年）的重建结果也证明了马其顿单倍型形成了一个独立的谱系，而意大利单倍型与欧洲谱系关系更密切。然而，Moska等人（2016年）得出的拓扑结构将马其顿单倍型定位为所有谱系的基础。

在G. persicus中观察到的显著遗传丰富性与Glis glis谱系之间的显著分化相呼应，K2P遗传距离范围从1.85%到5.55%，这种模式与地中海地区（如意大利和巴尔干半岛）以及海兰卡尼安森林（Naderi等人2014年；Ahmadi等人2018年）存在的冰川避难所有关。相比之下，每个谱系内的遗传变异较为有限，西西里谱系的K2P遗传距离为0%至0.61%。例如，欧洲谱系内的遗传变异较低（K2P = 0.12%），这一现象可能与Schmitt（2007年）提出的“刺猬式”扩散模式一致，即物种在冰期后向北扩散。第四纪的冰川-间冰期循环，特别是约24-1.5万年前最后一次冰盛期，显著影响了这些适应温暖环境的物种的分布和遗传结构，这些物种主要在避难所中生存（参见Jancewicz和Falkowska 2017年；Wendt等人2021年；García-Rodríguez等人2024年；Ho?ek等人2024年的研究）。最初，关于冰川避难所的理论主要集中在欧洲南部的伊比利亚半岛、亚平宁半岛和巴尔干半岛（参见Hewitt 1999年；Schmitt 2007年）。这种观点认为只有这些地中海地区提供了适合温带物种生存的条件（参见Hürner等人2010年；Koren等人2015年；Jancewicz和Falkowska 2017年；García-Rodríguez等人2024年；Mori等人2024年）。这些理论通常认为，从这些避难所向北扩散的物种经历了周期性的瓶颈效应，导致最近殖民地区的遗传多样性较低，这适用于大多数Glis glis的分布范围。我们的分析与其它研究结果一致，即欧洲谱系中的广泛遗传同质性最好通过从单一避难所的扩散来解释，其中Hap_2是主要传播的单倍型（参见Hürner等人2010年；Naderi等人2014年；Mori等人2024年）。

最近基于化石证据和广泛分子研究的理论揭示了更为复杂的冰川避难所和冰期后扩散情况，包括存在非地中海地区的避难所，如喀尔巴阡山脉、克里米亚、乌拉尔山脉、高加索地区、俄罗斯平原、阿尔卑斯山脉、伊朗北部的海兰卡尼安地区以及中欧地区。此外，也有研究认为在高海拔地区存在具有适宜微气候和栖息地的小型隐蔽区域（参见Mitka等人2014年；Koren等人2015年；Jancewicz和Falkowska 2017年；Wendt等人2021年；Ho?ek等人2024年）。人们认为喀尔巴阡山脉是一个“避难所中的避难所”地带。这一观点得到了古植物学、系统地理学和古生物学证据的支持，表明许多欧洲物种并非在一个大范围内生存，而是在喀尔巴阡山脉内的多个适宜小区域内生存，这些区域的海拔分别为650米和大约300米（参见Mitka等人2014年；Wielstra等人2017年）。在罗马尼亚，所有喀尔巴阡山脉地区的种群都显示了广泛分布的Hap_2单倍型。关于Glis glis的冰川避难所及其冰期后扩散的重要性已在多篇论文中讨论（参见Hürner等人2010年；Naderi等人2014年；Ahmadi等人2018年；Kry?tufek等人2021年），但罗马尼亚南部非喀尔巴阡地区（Negureni和Dumbr?veni）种群的双峰分布模式表明，罗马尼亚东南部的橡树林尤其是多布罗加地区为该物种提供了理想的栖息地，使得从欧洲分布的Hap_2单倍型演化出了多个衍生物单倍型。

**遗传多样性与种群结构**

虽然中性标记物（如微卫星）通常用于评估当代种群历史和分化，但线粒体DNA——特别是细胞色素b（cytb）基因——仍然是解决哺乳动物遗传结构问题的一种非常有效且广泛使用的工具（参见Ahmadi等人2018年；Chen等人2019年，2022年）。cytb标记物的优势在于其易于扩增和高度变异性，特别是在第三个密码子位置。这些特性使其特别适合分析种内多态性、绘制基因流模式以及评估种内多样性（参见Feng和Zhou 2017年；Chen等人2019年；Cuadrado等人2024年）。基于核DNA和线粒体DNA标记物对G. glis进行的遗传研究表明，该物种内的遗传多样性水平较低（参见Dabert等人2009年；Hürner等人2010年；Segelbacher等人2010年；Lo Brutto等人2011年；Castiglia等人2012年；Helvaci等人2012年；Herdegen等人2016年）。栖息地破碎化导致了孤立的可食用睡鼠种群的形成，德国、波兰和意大利的研究表明，来自破碎森林的睡鼠表现出显著的遗传隔离和较低的遗传多样性（参见Fietz等人2014年；Herdegen等人2016年；Moska等人2016年；Bani等人2017年）。

与欧洲其他地区相比，罗马尼亚的遗传多样性较低，且种群间缺乏显著的遗传结构。这些当地种群属于同一波冰期后扩张潮，共同殖民了欧洲大陆的其他地区。与之前的研究一致（参见Hürner等人2010年；Koren等人2015年），我们的分析证实，大多数欧洲种群都特征于一个广泛分布的线粒体单倍型Hap_2，这也是大多数罗马尼亚样本所共有的。序列变异和遗传多样性最高的种群位于东南部，而Ro?ia和Piscoiu种群的遗传多样性最低，仅存在一个单倍型（见表1）。我们的发现与其他使用核分子标记物（如微卫星）研究可食用睡鼠的结果一致。大多数研究发现雜合度较低，每个微卫星位点仅有少量等位基因（参见Hürner等人2010年；Segelbacher等人2010年；Moska等人2016年）。在地中海地区以及中欧地区，杂合度和等位基因丰富度略有提升（参见Dabert等人2009年；Hürner等人2010年；Michaux等人2019年）。样本大小也会影响分析中的遗传多样性水平。东南部的Negureni和Dumbr?veni种群拥有较大的样本量（分别为N = 45和N = 57），这有助于检测到稀有或衍生单倍型的概率 increase。相比之下，Ro?ia和Piscoiu种群的样本量较小（分别为N = 7和N = 5），在这种情况下观察到单一固定单倍型的可能性较低，导致内部多样性较低。Ro?ia种群完全缺乏cytb序列变异，仅固定为普遍存在的欧洲Hap_2单倍型，没有足够的时间进行新的局部突变。

尽管样本量存在差异，但非喀尔巴阡地区（Piscoiu、Negureni和Dumbr?veni）种群中观察到的较高遗传多样性表明，东南部的落叶林提供了极其适宜且历史稳定的栖息地。这一假设进一步得到了这两个种群中观察到的双峰分布模式的支持，这种模式通常与长期的人口稳定性和而非近期突发的人口扩张相关。这种环境稳定性可能有助于广泛分布的欧洲单倍型（Hap_2）的保留，同时促进了衍生单倍型（Hap_1、Hap_3、Hap_4和Hap_5）的局部积累。尽管Hap_5与法国的一个种群共有，但我们认为这是一种同形现象，这两个种群独立地从同一个祖先单倍型（Hap_2）衍生出了相同的单倍型。考虑到这两个地点之间的地理距离约为2000公里，再加上G. glis较低的自然扩散能力以及现代欧洲森林的高度破碎化，它们之间的自然基因流极不可能发生。此外，线粒体基因组（cytb）序列经常表现出突变“热点”，尤其是在第三密码子位置，那里的同义替换不会改变最终的氨基酸（Nabholz等人，2009年）。这一机制直接解释了Hap_5的独立出现，其特征是在第601位（位于色氨酸密码子的第三位）发生了一个同义替换（鸟嘌呤到腺嘌呤的替换）。

在四个罗马尼亚种群之间计算的Fst值很高（FST = 0.001–1），其中Ro?ia和Piscoiu之间的Fst值最高，这表明存在种群结构。AMOVA分析显示Dobrogea和南部种群与罗马尼亚西部种群之间存在强烈的种群结构差异（FSC = 0.016）。喀尔巴阡山脉内的种群没有像喀尔巴阡山脉外的种群那样形成新的单倍型。此外，在喀尔巴阡山脉更西部的种群（如匈牙利的种群）中只发现了Hap_2。这表明它们的殖民化来源与喀尔巴阡山脉外的种群不同。Piscoiu种群的独特单倍型及其极高的Fst值表明其与其他G. glis种群之间存在明显的地理隔离和基因流中断。对于像可食用睡鼠这样的小型树栖哺乳动物来说，这反映了历史上的隔离以及严重的现代景观障碍或栖息地破碎化，这些因素阻碍了种群间的混合。森林砍伐和栖息地破碎化可能导致Hap_1单倍型在罗马尼亚南部的橡树林中通过遗传漂变迅速固定下来。在这样的孤立森林片段中，遗传漂变可以迅速使某个等位基因固定，从而降低内部多样性同时增加与邻近种群的遗传差异。研究表明，栖息地的破碎化严重限制了该物种的基因交流（Herdegen等人，2016年）。然而，高Fst值表明线粒体基因组可能不是确定G. glis种群遗传结构的最佳标记物，应结合核基因标记物和其他进化速度较快的标记物（如微卫星和SNP）来研究最近的进化事件和短时间尺度上的分化。这些标记物具有大量的等位基因和较高的突变率（由于复制滑动），因此非常适合测量种群内多样性和区分个体。

总体而言，喀尔巴阡山脉内种群与喀尔巴阡山脉外种群之间的遗传多样性存在显著差异，表现为分子变异比例高（20.1%）和种群间的FST值高（0.329）。喀尔巴阡山脉外种群中的遗传多样性突出显示了罗马尼亚南部可能是局部分化的潜在热点区域。值得注意的是，罗马尼亚种群的遗传多样性几乎完全由喀尔巴阡山脉外的种群维持，这凸显了喀尔巴阡山脉和多瑙河作为重要生物地理屏障的作用，它们塑造了该物种在该地区的多样化进化轨迹。Michaux等人（2019年）和Moska等人（2016年）解释了G. glis的种群历史和结构，以及其种群有效规模和遗传多样性的低水平，主要是由于人类活动如森林开发和城市化导致的栖息地丧失和破碎化。可食用睡鼠较低的扩散能力和对特定栖息地（如落叶橡树林和山毛榉林）的依赖性（Popescu和Murariu，2001年）意味着森林砍伐引起的栖息地破碎化阻碍了其种群间的基因交流。

在之前的关于欧洲G. glis遗传多样性的研究中，缺乏喀尔巴阡山脉和罗马尼亚的样本数据，也没有关于罗马尼亚种群遗传结构的资料。我们的研究是首次对这个地区可食用睡鼠系统地理学进行的广泛分子研究。使用线粒体基因组标记物对罗马尼亚的G. glis进行遗传采样对于重构这一物种的遗传图谱非常重要，它填补了该物种系统地理学图谱上的重要空白。该研究还发现了罗马尼亚南部（Piscoiu）和Dobrogea（Negureni, Dumbr?veni）存在的局部分化热点区域，这些区域的独特单倍型对于理解进化过程和保护规划至关重要。了解像G. glis这样栖息地破碎化的特化物种的遗传多样性对于制定有效的保护策略至关重要。为了更全面地了解其遗传结构，使用线粒体和核基因标记物可能是有利的，因为它们由于经历不同的进化压力而提供了互补的信息。