钆掺杂对聚丙烯酸共轭氧化铈纳米颗粒的理化性质及神经保护活性的影响——神经退行性疾病潜在诊疗剂（Theranostics）的体外研究

《Pharmacological Reports》：The impact of gadolinium doping on physicochemical properties and neuroprotective activity of polyacrylic acid conjugated cerium oxide nanoparticles – in vitro study of potential theranostics for neurodegenerative diseases

　　

摘要 背景：氧化铈纳米颗粒（CeO NPs）在多种神经退行性疾病的实验模型中显示出神经保护作用。将磁性共振成像（MRI）造影剂（例如钆）掺杂到纳米颗粒中，可以实现神经退行性疾病的同步诊断与治疗，这种技术称为诊疗剂（Theranostics），最初主要应用于肿瘤学，但也能成功应用于神经退行性疾病的诊疗。 方法：在本研究中，研究人员合成了聚丙烯酸共轭氧化铈纳米颗粒的钆掺杂物（Gd-CeO），以创建一种兼具MRI能力和神经保护特性的诊疗剂。在人类帕金森病神经模型（使用未分化和视黄酸分化的SH-SY5Y细胞）中，评估了这些纳米颗粒的理化特性、磁共振成像潜力、生物安全性、细胞摄取和神经保护效果，并与未掺杂钆的氧化铈纳米颗粒（CeO）进行了比较。 结果：合成的Gd-CeO纳米颗粒显示出良好的稳定性、浓度依赖性的T1和T2对比特性，且无细胞毒性。Gd-CeO纳米颗粒能被细胞快速摄取，并且在抵抗过氧化氢（H2O2）和6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导的细胞损伤方面，保持了与未掺杂钆的CeO纳米颗粒相似的神经保护效力。此外，在两种细胞损伤模型中，研究人员证明了Gd-CeO和CeO纳米颗粒对线粒体膜电位、DNA片段化和坏死细胞数量具有保护作用，而在caspase-3活性水平，仅在对6-OHDA模型中显示出所研究纳米颗粒的抑制作用。最后，Gd-CeO和CeO纳米颗粒对H2O2的保护作用在小鼠原代皮层神经元中得到了证实。 结论：由于所开发的Gd-CeO纳米颗粒显示出有前景的对比特性，并且保持了与未掺杂钆纳米颗粒相似的生物安全性和神经保护特性，它们可以作为一种潜在的神经退行性疾病（包括帕金森病）诊疗探针进行进一步研究。

研究背景、问题与目的

近年来，诊疗纳米颗粒在推进个性化医疗中扮演着关键角色，其能够以靶向方式同时实现疾病的诊断与治疗。神经退行性疾病（ND）如帕金森病（PD）、阿尔茨海默病等，与氧化应激、蛋白质聚集、神经炎症等病理过程密切相关，目前缺乏有效的早期诊断和疾病修饰疗法。将成像和治疗功能整合于一体的诊疗剂（Theranostics）在神经科学领域展现出巨大潜力。然而，开发适用于脑部的高效诊疗剂面临血脑屏障穿透、生物安全性、实时监测等多重挑战。氧化铈纳米颗粒（CeO NPs）因其独特的氧化还原特性（Ce³⁺/Ce⁴⁺转换），能够有效清除活性氧（ROS），在多种神经退行性疾病和脑损伤模型中显示出显著的神经保护作用。钆（Gd）复合物是目前广泛使用的磁共振成像（MRI）造影剂，能显著增强组织对比度。但传统的Gd基造影剂存在潜在的脑部沉积风险、细胞毒性和生态毒性等问题。将CeO的神经保护功能与Gd的成像功能结合，构建兼具治疗与诊断功能的纳米诊疗剂，有望为神经退行性疾病提供新的解决方案。此前的研究已证明聚丙烯酸（PAA）共轭的CeO NPs及其铕（Eu³⁺）掺杂物具有神经保护潜力，但Gd掺杂的CeO NPs（Gd-CeO NPs）的神经保护效能和MRI成像能力，尤其是在PD相关细胞模型中的系统性评估尚不充分。因此，本研究旨在开发一种新型的Gd-CeO NPs，并全面评估其理化性质、MRI成像潜力、生物安全性、细胞摄取和神经保护效果，以探索其作为帕金森病等神经退行性疾病潜在诊疗剂的可行性。

研究方法概述

本研究主要运用了材料合成与表征、磁共振成像评估、细胞生物学和分子生物学等多学科技术方法。研究人员合成了不同浓度（0.05 M和0.1 M）的聚丙烯酸（PAA）共轭CeO NPs及其20%钆掺杂物（Gd-CeO NPs），并对其粒径、zeta电位、多分散指数、长期稳定性、元素分布等进行了系统的理化表征。利用9.4T高场MRI扫描仪，评估了Gd-CeO NPs的T₁和T₂弛豫特性及造影能力。生物学研究采用人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系（包括未分化（UN-）和视黄酸分化（RA-）的两种表型）作为帕金森病体外模型，并使用了小鼠原代皮层神经元进行验证。通过乳酸脱氢酶（LDH）释放、MTT还原、显微形态学观察等方法评估细胞活力和神经保护作用。利用流式细胞术、荧光探针、酶活性测定、蛋白质免疫印迹等技术，深入探究了纳米颗粒对细胞摄取、坏死、凋亡、活性氧水平、线粒体膜电位、钙蛋白酶、组织蛋白酶D、caspase-3活性等多种细胞损伤通路标志物的影响。实验数据采用Statistica软件进行统计分析。

研究结果详述

1. 合成纳米颗粒的理化特性

动态光散射（DLS）分析显示，0.05 M CeO NPs平均尺寸约为40-50 nm，0.1 M CeO NPs约为20-30 nm。掺杂20% Gd后，粒径略有增加（约10 nm）。所有样品的Zeta电位绝对值均高于30 mV，多分散指数（PDI）在0.2-0.25之间，表明胶体系统稳定且单分散性良好。扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）结合X射线能谱（EDS）分析证实了Gd在CeO基质中的均匀掺杂，NPs呈球形，尺寸在10-40 nm范围内。长达20个月的稳定性监测表明，NPs悬浮液在室温避光储存下理化性质保持稳定。

2. 磁共振弛豫和成像

MRI评估显示，Gd-CeO NPs表现出合理的T₁正对比特性，在较宽的稀释范围内，Gd-CeO与未掺杂CeO NPs溶液间存在显著对比。T₂负对比在较高浓度下可检测。计算得到的r₁摩尔弛豫度约为1.3-1.7 mM^?1s^?1，r₂约为8.6-11.4 mM^?1s^?1。造影效果完全源于Gd的存在，未掺杂CeO NPs的对比效应可忽略。这表明Gd-CeO NPs具有作为MRI造影剂的潜力，尤其在T₁加权成像中。

3. Gd-CeO NPs的生物安全性评估

LDH释放实验表明，在UN-和RA-SH-SY5Y细胞中，分别以10x稀释度处理24-48小时，0.05 M和0.1 M的CeO及Gd-CeO NPs均未引起显著的细胞毒性，显示出良好的生物安全性。

4. NPs的FITC标记和细胞摄取

荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记证实了CeO和Gd-CeO NPs的成功标记。流式细胞术分析显示，所有NPs在UN-和RA-SH-SY5Y细胞中均能被快速摄取，处理0.5小时后FITC阳性细胞比例即接近100%，并在6小时内维持高水平。平均荧光强度在0.5小时达到峰值，表明NPs快速积累。在UN-SH-SY5Y细胞中，0.05 M Gd-CeO NPs在0.5小时时的积累略低于同浓度的CeO NPs，但在其他时间和浓度下，两种NPs的积累水平相似。

5. CeO和Gd-CeO NPs对氧化应激诱导的细胞损伤的神经保护作用

在H₂O₂诱导的细胞损伤模型中，0.05 M和0.1 M的CeO及Gd-CeO NPs（稀释度10x-40x）均能显著降低UN-和RA-SH-SY5Y细胞中的LDH释放，显示出剂量依赖性保护作用。在某些浓度下，NPs的保护效果甚至优于阳性对照药物N-乙酰半胱氨酸（NAC）。显微形态学观察进一步证实了其保护作用。在6-OHDA诱导的损伤模型中，同样观察到了显著的神经保护效果，0.1 M浓度的NPs保护效果普遍优于0.05 M浓度，且Gd掺杂并未显著削弱保护效力。即使在合成后储存20个月，NPs仍能保持其神经保护活性。

6. CeO和Gd-CeO NPs对坏死标志物的影响

碘化丙啶（PI）染色流式分析显示，在H₂O₂和6-OHDA模型中，Gd-CeO和CeO NPs（稀释度10x）均能显著减少UN-和RA-SH-SY5Y细胞中的坏死细胞（PI阳性）数量，其保护效果通常等于或优于NAC。在RA-SH-SY5Y细胞的6-OHDA模型中，0.05 M Gd-CeO NPs的保护效果甚至显著优于同浓度的CeO NPs。

7. CeO和Gd-CeO NPs对caspase-3活性的影响

在6-OHDA模型中，两种细胞表型均观察到caspase-3活性的显著升高。0.1 M的CeO和Gd-CeO NPs（稀释度10x）能显著抑制这种caspase-3激活，而0.05 M浓度的保护效果较弱或仅在一种细胞表型中有效。NPs本身不诱导caspase-3活性。

8. CeO和Gd-CeO NPs对DNA片段化的影响

在RA-SH-SY5Y细胞中，末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）实验表明，H₂O₂和6-OHDA均能诱导DNA片段化（凋亡标志）。0.1 M Gd-CeO NPs能有效减少H₂O₂诱导的TUNEL阳性细胞。在6-OHDA模型中，0.1 M CeO NPs、0.1 M Gd-CeO NPs和0.05 M Gd-CeO NPs均能显著降低凋亡细胞数量，且0.1 M CeO NPs的效果优于0.05 M浓度。

9. CeO和Gd-CeO NPs对细胞内ROS水平、线粒体膜电位、组织蛋白酶D和钙蛋白酶活性的影响

在RA-SH-SY5Y细胞中，H₂O₂可诱导细胞内ROS水平急剧升高，而CeO和Gd-CeO NPs预处理能显著抑制ROS的产生，效果与NAC相当。H₂O₂和6-OHDA处理会降低线粒体膜电位（MMP），而NPs预处理可有效维持MMP。此外，H₂O₂可激活组织蛋白酶D（Cth D）活性，而CeO和Gd-CeO NPs能部分抑制这种激活。蛋白质免疫印迹分析显示，细胞损伤因子可诱导α-血影蛋白（α-spectrin）的裂解（钙蛋白酶和caspase激活的标志），而NPs预处理可减少这种裂解。

10. 在原代皮层神经元中的验证

在小鼠原代皮层神经元中，0.1 M CeO和Gd-CeO NPs（稀释度10x）本身无毒性。在H₂O₂和谷氨酸诱导的兴奋性毒性模型中，两种NPs（稀释度10x和20x）均表现出显著的神经保护作用，能减少LDH释放并提高MTT还原率。

讨论与结论总结

本研究成功开发并系统评估了具有20% Gd掺杂的聚丙烯酸共轭氧化铈纳米颗粒（Gd-CeO NPs）。结果表明，该纳米材料具有良好的胶体稳定性、单分散性和长达20个月的长期储存稳定性。关键的是，Gd的掺入赋予了纳米颗粒显著的MRI T₁和T₂造影能力，使其能够作为诊断成像的探针。在生物学层面，Gd-CeO NPs在多种细胞模型（包括人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的不同分化状态和小鼠原代皮层神经元）中均表现出优异的生物相容性，无细胞毒性。更重要的是，其神经保护效力与未掺杂钆的CeO NPs相当，并未因Gd的引入而显著减弱。这种保护作用在两种经典的氧化应激模型（H₂O₂和6-OHDA）中均得到证实，涉及对细胞坏死、凋亡、线粒体功能障碍、ROS积累、溶酶体酶和钙蛋白酶激活等多种细胞死亡途径的抑制。机制研究表明，其保护作用可能与其抗氧化（清除ROS）特性以及稳定线粒体功能、调节细胞死亡相关蛋白酶活性等多重效应有关。

结论翻译：

由于所开发的Gd-CeO纳米颗粒显示出有前景的造影特性，并且保持了与未掺杂钆纳米颗粒相似的生物安全性和神经保护特性，它们可以作为一种潜在的神经退行性疾病（包括帕金森病）诊疗探针进行进一步研究。