PAM-flexible SpCas9 变体扩展了应用于猪基因组编辑和细胞疾病建模的目标范围

《BMC Biotechnology》：PAM-flexible SpCas9 variants expand the targeting scope for porcine genome editing and cellular disease modeling

　　

摘要

背景

CRISPR-Cas介导的基因编辑技术彻底改变了生命科学领域，但广泛使用的SpCas9的靶向范围受到其对NGG前间隔序列（PAM）严格要求的限制。为克服这一限制，已经在多种物种中开发并研究了PAM灵活型的SpCas9变体；然而，这些变体在猪（作为人类重要的生物医学模型）中的潜力尚未得到探索。在本研究中，我们系统评估了三种PAM灵活型SpCas9变体（SpRY、SpG和SpCas9-NG）及其衍生的碱基编辑器在猪胎儿成纤维细胞（PFFs）中的编辑性能。

结果

通过对228个目标位点的分析发现，SpRY几乎不受PAM的影响，在NRN（15.82%，R = A/G）处的编辑效率显著高于NNY PAMs（5.75%，Y = C/T）处的编辑效率。SpG和SpCas9-NG则优先靶向NGN PAMs，其平均编辑效率分别为14.81%和16.33%。PAM灵活型的胞嘧啶碱基编辑器（CBEs）能够高效地实现C:G到T:A的转换，其中SpRY-BE4max（NNN PAMs）的平均效率为12.01%，SpG-BE4max（NGN PAMs）为15.43%，SpCas9-NG-BE4max（NGN PAMs）为18.39%。同样，PAM灵活型的腺嘌呤碱基编辑器（ABEs）也能高效实现A:T到G:C的转换，SpRY-ABE8e（NNN PAMs）的平均效率为15.66%，SpG-ABE8e（NGN PAMs）为24.16%，SpCas9-ABE8e（NGN PAMs）为20.50%。通过利用这一扩展的靶向范围，我们成功地在猪基因组的NRN PAM位点引入了16个病原性单核苷酸变异（SNVs），其中CBEs的编辑效率最高达到40.68%，ABEs的编辑效率最高达到61.76%。

结论

PAM灵活型的SpCas9变体及其衍生的碱基编辑器大大扩展了猪基因组工程的靶向范围，从而显著提升了CRISPR-Cas介导的基因组编辑工具在猪的遗传改良和疾病模型构建中的应用潜力。

背景

CRISPR-Cas介导的基因编辑技术彻底改变了生命科学领域，但广泛使用的SpCas9的靶向范围受到其对NGG前间隔序列（PAM）严格要求的限制。为克服这一限制，已经在多种物种中开发并研究了PAM灵活型的SpCas9变体；然而，这些变体在猪（作为人类重要的生物医学模型）中的潜力尚未得到探索。在本研究中，我们系统评估了三种PAM灵活型SpCas9变体（SpRY、SpG和SpCas9-NG）及其衍生的碱基编辑器在猪胎儿成纤维细胞（PFFs）中的编辑性能。

结果

通过对228个目标位点的分析发现，SpRY几乎不受PAM的影响，在NRN（15.82%，R = A/G）处的编辑效率显著高于NNY PAMs（5.75%，Y = C/T）处的编辑效率。SpG和SpCas9-NG则优先靶向NGN PAMs，其平均编辑效率分别为14.81%和16.33%。PAM灵活型的胞嘧啶碱基编辑器（CBEs）能够高效地实现C:G到T:A的转换，其中SpRY-BE4max（NNN PAMs）的平均效率为12.01%，SpG-BE4max（NGN PAMs）为15.43%，SpCas9-NG-BE4max（NGN PAMs）为18.39%。同样，PAM灵活型的腺嘌呤碱基编辑器（ABEs）也能高效实现A:T到G:C的转换，其中SpRY-ABE8e（NNN PAMs）的平均效率为15.66%，SpG-ABE8e（NGN PAMs）为24.16%，SpCas9-ABE8e（NGN PAMs）为20.50%。通过利用这一扩展的靶向范围，我们成功地在猪基因组的NRN PAM位点引入了16个病原性单核苷酸变异（SNVs），其中CBEs的编辑效率最高达到40.68%，ABEs的编辑效率最高达到61.76%。

结论

PAM灵活型的SpCas9变体及其衍生的碱基编辑器大大扩展了猪基因组工程的靶向范围，从而显著提升了CRISPR-Cas介导的基因组编辑工具在猪的遗传改良和疾病模型构建中的应用潜力。