在棒状粘杆菌（Mycolicibacterium smegmatis）中表达的重组蛋白可增强基于抗体的牛结核病检测方法

《Veterinary Research》：Recombinant proteins expressed in Mycolicibacterium smegmatis enhance antibody-based detection of bovine tuberculosis

　　**摘要**
牛结核病（bTB）由牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）引起，是一种人畜共患病，对公共卫生构成威胁，并导致养牛业遭受重大经济损失。目前基于大肠杆菌表达的重组蛋白在诊断性能上存在不足，这限制了现有bTB血清学检测的效果。为克服这一限制，我们评估了Mycolicibacterium smegmatis作为表达宿主的可能性，该宿主能够产生具有与牛分枝杆菌相似的翻译后修饰的重组抗原。我们使用pET-26b(+)载体在大肠杆菌中，以及pSOΔBam载体在M. smegmatis中分别表达了十个候选抗原。通过酶联免疫吸附测定（ELISA）方法，使用来自韩国干扰素-γ释放试验（IGRA）阴性（n=30）和阳性（n=46）牛的血浆样本对这些抗原的诊断性能进行了评估，并进行了接收者操作特征（ROC）曲线分析。在单一抗原中，表达在M. smegmatis中的LprA显示出与公认抗原MPB70相当的诊断性能（灵敏度：50.0%，特异性：96.6%，AUC：0.791）。此外，多个源自M. smegmatis的抗原与IGRA结果的一致性更高（通过Cohen’s kappa和Fisher’s exact检验评估），并且在IGRA阳性的牛中观察到年龄与抗原特异性抗体反应之间有更强的关联。更重要的是，一个包含来自两种宿主的八个抗原的多变量逻辑回归模型对IGRA结果具有很高的预测准确性（灵敏度：87.0%，特异性：100%，AUC：0.991）。这些发现表明，M. smegmatis是鉴定新抗原的有前途的宿主，采用多宿主策略可能改善bTB的血清学诊断。

**引言**
结核病（TB）由结核分枝杆菌复合群（MTBC）引起，是一种主要的传染病，对全球公共卫生构成持续威胁[1]。在MTBC中，牛分枝杆菌是牛结核病（bTB）的主要致病菌，影响动物健康并对畜牧业造成巨大经济负担。根据世界动物卫生组织（WOAH）的数据，2017年至2018年间全球188个国家中有82个国家报告了bTB病例[2]。据估计，bTB每年导致大约30亿美元的经济损失[3]。除了对农业的经济影响外，bTB还是一种重要的人畜共患病。人类感染牛分枝杆菌（称为人畜共患结核病（zTB）主要通过食用未经巴氏消毒的乳制品发生。zTB仍然是一个严重的公共卫生问题，尤其是在低收入和中等收入国家，这些国家在实际的bTB控制工作中经常受到经济和文化因素的阻碍[4]。2019年，全球约有14万新病例和11,400例死亡[5]。值得注意的是，即使在公共卫生系统先进的高收入国家，也继续出现零星zTB病例。2019年至2023年间，欧盟报告每年平均有超过122例人类牛分枝杆菌感染病例[6]。此外，韩国也确认了首例zTB病例，涉及一名接触动物标本的实验室工作人员，凸显了与牛分枝杆菌传播相关的职业风险[7]。为了减轻bTB带来的经济和公共卫生负担，许多国家在对牛进行生前诊断测试，包括结核菌素皮肤试验（TST）和干扰素-γ释放试验（IGRA），这两种方法都用于评估细胞介导的免疫反应[8]。例如，韩国每年进行约23万次TST和75万次IGRA，耗费约420万美元。同样，英国每年投入约1.2亿英镑用于bTB控制工作[9]。尽管如此，由于受感染牛的持续流动、诊断灵敏度和特异性（DSe和DSp）有限，以及环境和野生动物宿主的存在，bTB在许多地区仍然流行[10]。

尽管TST和IGRA仍是当前bTB控制策略的核心，但财务和物流挑战激发了对替代诊断方法的兴趣。bTB感染期间抗体滴度的逐渐升高，加上牛分枝杆菌基因组测序[11]和大肠杆菌中重组蛋白表达[12]的进步，促进了针对牛分枝杆菌特异性抗原的血清学诊断方法的发展[13,14,15,16,17]。这些测试可以识别在TST或IGRA中表现出假阴性结果的动物，并通过最小化与环境中的非结核分枝杆菌（NTM）的交叉反应来提高DSp[14,15,16]。然而，它们的广泛应用受到血清转化延迟和比基于细胞介导的免疫（CMI）的检测方法较低的DSe的限制[18, 19]。最近对100多种重组抗原的大规模筛查显示，牛分枝杆菌感染牛的抗体反应存在显著异质性，这突显了鉴定最佳诊断抗原的挑战[20]。这种异质性可能与大肠杆菌表达系统无法再现牛分枝杆菌天然蛋白中存在的翻译后修饰（PTMs）有关。PTMs涉及磷酸基团、脂质或碳水化合物等官能团的共价添加。这些修饰存在于结核分枝杆菌蛋白中，可以调节蛋白结构和宿主免疫反应[21, 22]。与大肠杆菌表达的重组蛋白相比，增强了对天然结核分枝杆菌蛋白的抗体反应性，突显了PTMs在结核病患者诊断中的重要性[23]。然而，主要MTBC物种（包括牛分枝杆菌和结核分枝杆菌）的高致病性和生长缓慢限制了它们在大规模抗原生产中的应用。为克服这些限制，非致病且生长迅速的Mycolicibacterium smegmatis作为一种与致病分枝杆菌亲缘关系密切的替代表宿主应运而生[24, 25]。这种表达宿主能够生产可溶性、正确折叠且具有生物活性的分枝杆菌蛋白[26]。此外，已明确表明在M. smegmatis中表达的蛋白会经历与天然病原体相似的PTMs，从而更准确地评估其免疫原性[27,28,29,30]。基于这些优势，我们假设在M. smegmatis中表达的重组蛋白将提高bTB血清学检测的诊断性能。

**材料与方法**
**血浆样本收集**
2022年至2024年间，作为标准兽医临床实践的一部分，从韩国全北地区的八个养牛场收集了全血样本。血浆在全北州兽医服务与研究所分离，用于根据农业、食品和农村事务部发布的指南进行IGRA检测[31]。为了避免抗原刺激对ELISA性能的潜在干扰，本研究仅使用了经PBS处理（未刺激）的全血获得的血浆。

**干扰素-γ释放试验和MAP抗体ELISA**
IGRA使用PIron-gamma TB ELISA Kit（PIgenomics Co., Ltd., Hwaseong, Korea）按照制造商说明进行，刺激抗原包括早期分泌抗原6（ESAT-6）、培养滤液蛋白10（CFP-10）和低分子量抗原TB10.4（EsxH）。对于IGRA阴性样本，使用Johne’s Disease Screening KS kit（Kyoritsu Seiyaku Corp., Tokyo, Japan）进行了MAP抗体ELISA，以评估可能干扰重组抗原抗体反应的潜在MAP相关体液反应。在该检测中，平板上涂布了来自M. avium subsp. paratuberculosis P-18菌株的纯化蛋白[32]。根据制造商的方案，在ELISA前用Mycobacterium phlei菌株354-NIAH预吸附血浆样本以确保特异性。在IGRA阴性动物中没有检测到MAP血清阳性样本。

**IGRA样本分类**
IGRA阴性组（n=30）包括在2020-2024年期间五个农场未报告bTB病例的样本。采用保守的选择方法，只有显示OD差异（抗原刺激减去PBS对照）≤0.01的样本被纳入。
IGRA阳性组（n=46）来自三个农场，包含OD差异≥0.1的样本，按照制造商的指南定义。为了代表广泛的IGRA反应性，该组被进一步分为高反应（OD≥1.0，n=8）、中等反应（0.3≤OD<1.0，n=16）和低反应（0.1≤OD<0.3，n=22）三个类别。所有样本均证实有足够的丝裂原反应，确保T细胞激活充分。样本的完整信息位于附加文件1中。

**在大肠杆菌和M. smegmatis中生产重组抗原候选物**
基于在人类和牛中的免疫原性、在牛纯化蛋白衍生物（bPPD）中的丰度、已知的PTMs以及与MAP的潜在交叉反应性，选择了十个候选抗原（包括嵌合ESAT-6/CFP-10蛋白E6C10）[13, 33]。这些抗原候选物的特征总结在表1中。

**大肠杆菌表达**
为了表达目的基因，设计了包含限制性酶位点和6×组氨酸标签的引物，使用TaKaRa LA Taq聚合酶（Takara Bio Inc., Shiga, Japan）通过PCR从牛分枝杆菌BCG Tokyo 172基因组DNA（Japan BCG Laboratory, Tokyo, Japan）扩增每个目标基因。所得扩增子和pET-26b(+)载体（Novagen, Merck KGaA, Darmstadt, Germany）用相应的限制性酶（New England Biolabs, Ipswich, MA, USA）进行消化，然后连接并通过热休克（42°C，45秒）转化到E. coli BL21(DE3)pLysS细胞中。转化后的E. coli细胞在Terrific Broth（BD Difco, Franklin Lakes, NJ, USA）中培养至OD590为0.6–1.0，随后使用优化浓度和温度的异丙基β-D-硫代半乳吡喃糖苷诱导蛋白表达。诱导后，通过离心（5000×g，30分钟）收获细胞，重新悬浮在Native Binding Buffer（50 mM NaH2PO4，500 mM NaCl，pH 8.0）中，并通过超声处理（30秒开/关，10分钟，中等功率）裂解细胞。裂解液离心（12000×g，10分钟），使用Ni-NTA琼脂糖（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）在0至250 mM咪唑梯度下收集和纯化可溶部分。编码优化的E6C10基因（GenScript Biotech, Piscataway, NJ, USA）被合成，亚克隆到pET-26b(+)中，并采用相同的表达和纯化流程处理。

**M. smegmatis表达**
将编码优化的基因（MPB63、MPB64、MPB70、MPB83和E6C10；GenScript Biotech）或牛分枝杆菌BCG Tokyo 172基因组DNA的PCR产物（对于其余抗原）克隆到表达载体pSOΔBam中，并使用NEPA Porator在2000 V电压下电穿孔到M. smegmas菌株ATCC 607或mc2 155中。转化体在LB琼脂上培养37°C 3天，然后在Sauton’s medium中37°C培养至少7天[34]。培养上清液通过0.2 μm Minisart注射器过滤器（Sartorius AG, G?ttingen, Germany）过滤，并使用Ni-NTA琼脂糖（Thermo Fisher Scientific）在0至250 mM咪唑梯度下纯化。生物膜在含有0.05% Tween 80的PBS中重新悬浮，离心（10000×g，30分钟），然后采用与E. coli裂解物相同的纯化流程处理。

**蛋白质分子量和纯度测定**
通过SDS-PAGE测定蛋白质分子量和纯度，并使用抗-His-tag mAb-HRP-DirecT（MBL Life Science, Tokyo, Japan）通过Western blot确认蛋白质表达。代表性的SDS-PAGE结果显示在附加文件2中。所有重组蛋白使用Amicon ultra离心过滤单元（Merck KGaA, Darmstadt, Germany）浓缩，并使用PD-10脱盐柱（Cytiva, Marlborough, MA, USA）进行缓冲液交换，然后存储在-80°C直至使用。引物序列、限制性酶和详细的培养条件在附加文件3和4中提供。

**内部ELISA**
间接ELISA在96孔Maxisorp板上进行了三次重复实验（Thermo Fisher Scientific），板上涂有1 μg/mL的抗原，使用碳酸盐缓冲液（15 mM Na?CO?、35 mM NaHCO?、0.05% NaN?，pH 9.6）在25°C下培养1小时。然后用PBS-T（PBS中的0.05% Tween 20）洗涤三次后，用封闭缓冲液（Block ACE，Megmilk Snow Brand Co., Ltd.，日本札幌）在25°C下封闭1小时，再洗涤三次。将血浆样本以1:500的比例稀释在封闭缓冲液中，然后于25°C下孵育1小时。之后加入HRP标记的兔抗牛IgG（PBS中的稀释度为1:20,000；Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯），并在25°C下孵育1小时。使用TMB底物（KPL SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate，1组分；SeraCare，美国马萨诸塞州米尔福德）在黑暗中培养15分钟进行比色反应。反应用1 M磷酸终止，随后使用微孔读数仪（SpectraMax 190，美国加利福尼亚州圣何塞）在450 nm处测量吸光度。分析前减去无血浆孔的背景吸光度。

**统计分析**
ELISA数据使用Prism 9（GraphPad Software，美国加利福尼亚州圣地亚哥）和Python版本3.13以及pandas、numpy和scikit-learn库进行分析。IGRA阴性和阳性组之间的OD值差异使用Mann–Whitney U检验进行评估，双尾p值<0.05被认为是统计学上显著的。

**每种重组抗原的诊断性能**
基于IGRA状态，使用接收者操作特征（ROC）曲线分析来评估每种重组抗原的诊断性能，并使用Wilson/Brown方法确定95%置信区间（CIs）。对于所有20种抗原，计算了曲线下面积（AUC）、DSe和DSp。使用DeLong检验评估每种抗原在不同表达宿主之间的AUC差异，该检验使用R软件（版本4.5.1；R Foundation for Statistical Computing，奥地利维也纳）和pROC包进行。

Cohen’s kappa和Fisher’s精确检验分别用于检查二元ELISA分类与IGRA状态之间的一致性和统计关联。ELISA临界值定义为IGRA阴性样本的平均OD值加上三个标准差（SD）。使用Spearman等级相关系数评估每种抗原的牛年龄与抗体反应性之间的关系。

**多变量逻辑回归（MLR）模型**
使用来自所有20种抗原的ELISA数据和76份血浆样本构建了一个MLR模型。每种抗原的OD值作为自变量，IGRA状态（阳性/阴性）作为因变量。采用前向逐步选择法确定在大肠杆菌（E. coli）和羊?分枝杆菌（M. smegmatis）或两者中表达的抗原组合，同时最小化多重共线性（定义为方差膨胀因子VIF<10）。模型性能基于拟合优度、预测因子的统计显著性以及分类准确性进行评估，包括ROC曲线分析，完整结果见附加文件5-7。此外，还使用自助重采样（B=1000）进行了内部验证。模型区分度使用Somers’ Dxy计算，并使用R中的rms包转换为AUC（AUC = (Dxy + 1)/2）。

**结果**
**评估在大肠杆菌和羊?分枝杆菌中表达的重组蛋白的个体区分能力和诊断性能**
十种抗原候选物分别在大肠杆菌和羊?分枝杆菌中表达，产生了20种重组蛋白，后缀_E或_S表示相应的表达宿主。对于每种抗原，比较了IGRA阴性组（n=30）和IGRA阳性组（n=46）的ELISA OD值（图1）。20种重组蛋白中有19种显示出统计学上的显著组间差异（p<0.05）。四种蛋白LprF、LprG、LppX和LpqH无论在哪种宿主中表达，都显示出强烈的组间分离（p<0.0001）。同样，LprA_S、MPB64_E、MPB70_E和E6C10_E也表现出高度显著的组间差异（p<0.0001）。相比之下，只有LprA_E没有显示出统计学上的显著差异（p>0.11）。

**干扰素-γ释放试验（IGRA）阳性和阴性组之间抗原特异性IgG反应的比较**
点图显示了每种重组蛋白的ELISA吸光度（OD450）：N_x_E和P_x_E分别表示针对大肠杆菌表达蛋白的IGRA阴性（n=30）和IGRA阳性（n=46）血浆样本。N_x_S和P_x_S表示针对羊?分枝杆菌表达蛋白的相同组。红色水平线表示中位OD值。组间统计学显著性表示为：ns（不显著）、*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001。

**基于IGRA状态的ROC曲线分析**
进行ROC曲线分析以确定每种抗原的AUC（图2和表2）。为了最小化IGRA阴性牛之间的非特异性ELISA反应性，DSe在96.6%的截断点处进行评估。在20种重组蛋白中，MPB70_E的DSe最高（54.4%），而LprG_E的DSe最低（6.52%）。在羊?分枝杆菌中表达的蛋白中，LprA_S和E6C10_S的DSe分别为最高（50.0%）和最低（17.4%）。六种抗原（LprF_E、LpqH_E、E6C10_E、LprF_S、LprG_S和LppX_S）的AUC值≥0.8。LprF_E的AUC最高（0.852），LprA_E的AUC最低（0.608）。

**通过ROC曲线分析评估的20种抗原候选物的诊断性能**
黑色和灰色曲线分别表示在大肠杆菌和羊?分枝杆菌中产生的重组蛋白。每个图表中的红色虚线表示参考线（AUC=0.5），表示没有区分能力。

**基于ROC曲线分析的个体抗原候选物的诊断性能**
使用DeLong检验评估每种抗原对在不同表达宿主之间的AUC差异（表2）。LprA、MPB64、MPB70和E6C10的差异具有统计学意义（p<0.05）。LprA_S、MPB64_E、MPB70_E和E6C10_E在基于ROC的分析中显示出更高的区分能力，而其余抗原对之间没有显著差异。

**ELISA结果与IGRA状态之间的一致性**
使用Cohen’s kappa（κ）系数评估每种抗原的ELISA结果与IGRA状态之间的一致性，进一步使用Fisher’s精确检验检查统计关联（表3）。与IGRA结果相比，14种抗原显示出统计学上显著的Cohen’s kappa统计值，表明有一致性到良好的一致性。无论表达宿主如何，MPB70_E（κ=0.393）和MPB70_S（κ=0.372）显示出最高的一致性。五种抗原（LprA_S、LppX_S、MPB70_E、MPB70_S和MPB83_S）显示出良好的一致性（κ=0.21–0.40），而九种抗原（LprA_E、LprF_E、LprG_S、LppX_E、LpqH_E、LpqH_S、MPB63_S和MPB83_S）显示出轻微的一致性（κ=0.00–0.20）。在比较表达宿主时，LprF和E6C10在大肠杆菌中表达时通常观察到更高的κ值，而MPB63、MPB83、LprA和LppX在羊?分枝杆菌中表达时显示出更高的一致性。与基于κ的分析一致，Fisher’s精确检验确定了10种抗原的统计学上显著关联，包括五种在大肠杆菌中表达的抗原（LprF_E、LppX_E、LpqH_E、MPB70_E和E6C10_E）和五种在羊?分枝杆菌中表达的抗原（LprA_S、LppX_S、MPB63_S和MPB83_S）。

**年龄与抗体反应性的关联**
使用基于每种抗原的ELISA OD值和45份IGRA阳性牛的年龄（以月为单位）的Spearman等级相关分析评估年龄与抗体反应性之间的关联（表3和附加文件1）。在分析的20种抗原中，18种抗原的年龄与抗体反应性之间存在统计学上的显著相关性（p<0.05），排除了MPB63_E和E6C10_S。七种抗原（LprF_S、LprG_S、LppX_E、LppX_S、LpqH_E和E6C10_E）显示出中等到强的正相关（ρ≥0.5），而其余11种抗原显示出弱正相关（0.3≤ρ<0.5）。

**优化的大肠杆菌和羊?分枝杆菌衍生的重组蛋白组合**
使用来自大肠杆菌的蛋白、羊?分枝杆菌的蛋白及其组合构建了三个MLR模型，以评估多抗原组合的诊断性能（图3、表4和附加文件5-7）。在无多重共线性（VIF<10）的大肠杆菌衍生组合中，包含八种抗原的组合（LprA_E、LprF_E、LprG_E、LpqH_E、MPB63_E、MPB64_E、MPB70_E和E6C10_E）获得了最高的AUC（0.970），DSe为80.4%，在0.820的截断点下的DSp为100.0%。相比之下，最佳的羊?分枝杆菌衍生组合包含六种抗原（LprF_S、LprG_S、MPB63_S、MPB64_S、MPB70_S和MPB83_S），AUC为0.886，DSe为45.7%，在0.917的截断点下的DSp为100.0%。表现最好的跨宿主组合包含八种重组蛋白（LprA_E、LprF_E、LpqH_E、MPB70_E、LprA_S、MPB63_S和E6C10_S），AUC为0.991，DSe为87.0%，在0.870的截断点下的DSp为100.0%。

**基于重组抗原的三种多变量逻辑回归模型的性能**
（A–C）三种逻辑回归模型的接收者操作特征（ROC）曲线，显示与IGRA分类的一致性。黑色虚线表示单个模型的ROC曲线，红色虚线表示随机分类（AUC=0.5）。（D–F）预测值与观察值图，展示了IGRA阳性（Observed=1）和阴性（Observed=0）样本的预测概率分布。

**讨论**
牛结核病（bTB）监测的一个主要障碍是在某些条件下基于细胞介导免疫（CMI）的检测方法所固有的限制和后勤挑战。世界动物卫生组织（WOAH）正式批准的TST作为bTB的生前检测方法，不能完全排除由非结核分枝杆菌（NTM）感染引起的假阳性反应[10]。同样，IGRA的血液样本处理延迟可能会使其DSe降低多达48.3% [35]。此外，我们未发表的数据表明，大约25%的牛IGRA样本对有丝分裂原刺激的反应不足，这一比例可能根据操作变量（如样本运输距离）和兽医在采集血液时的技术因素（如体外溶血）而增加。由于这些因素可能导致基于CMI的检测结果难以解释，不太受操作变化影响且与基于CMI的检测具有高一致性的血清学检测可能成为预防牲畜群体中bTB传播的有价值补充工具。反映这一需求，WOAH在2019年批准了Enferplex Bovine TB抗体检测方法（Enfer Scientific，爱尔兰Naas）作为对CMI检测结果不确定的牛的辅助方法[36]。在最近的大规模评估中，Enferplex检测方法包含主要在大肠杆菌中生产的11种重组抗原，在PPD增强的牛中显示出高DSp（98.4%），但在非增强的IGRA阳性动物中仅显示30.5%的DSe [14, 37]。这种显著差异使我们推测，大肠杆菌衍生重组抗原中缺乏PTMs可能会影响对自然感染牛中存在的B细胞表位的识别。为了解决这一限制，我们评估了羊?分枝杆菌作为替代表达宿主，以识别在保持血清学检测实际优势的同时与IGRA结果更接近的抗原候选物。

**结论**
在这项研究中，我们评估了五种抗原候选物（LprA、LprF、LprG、LppX和LpqH），这些抗原据报道在牛分枝杆菌（M. bovis）中会发生糖基化和脂质化。这些抗原在大肠杆菌和羊?分枝杆菌中表达，以探讨宿主依赖性因素（HDFs）是否影响抗体反应性。在十个重组蛋白中（即五种在两种宿主中表达的抗原），LprA_S的DSe为50.0%，AUC为0.791，明显高于其大肠杆菌衍生物（表2）。这一发现表明HDFs可能有助于保持B细胞表位的构象。在这种情况下，蛋白质的糖基化是一个生物学上合理的解释。先前的研究表明，LprA的脂质化形式对于激活抗原呈递细胞（APCs）是必需的，且其预测的B细胞表位中有约60%与糖基化位点重叠[30, 38]。这些发现强调了PTMs在血清学抗原筛查中的潜在相关性，至少对于某些抗原如LprA而言。相比之下，尽管先前报道了LprF、LprG、LppX或LpqH的PTMs[28,29,30]，但未观察到这些抗原在诊断性能上的显著宿主依赖性差异。这些结果表明，尽管这些抗原的糖基化或脂质化域可以激活APCs并通过Toll样受体2信号通路促进T细胞反应[39,40,41,42]，但宿主依赖性效应对基于ROC的区分性能的影响有限。

MPB70和MPB83是在大肠杆菌中表达时在bTB血清学测试中显示出强抗原性的保守MTBC蛋白[13,14,15,16,18]。为了检查PTMs对抗体反应性的影响，我们评估了这些抗原在大肠杆菌和羊?分枝杆菌中的表达情况。在20种单抗原ELISA中，MPB70_E表现出最高的DSe（54.4%），这与之前显示的血清学效用一致[13,14,15,16,18]。然而，MPB70_S并未进一步提升DSe或AUC，这可能反映了MPB70本身具有的抗原性，而非与蛋白翻译后修饰（PTM）相关的效应。天然形式的MPB70除了具有分泌功能外，没有已知的PTM，并且包含32个经过实验验证的B细胞表位，其中包括一个免疫优势区域（残基51-70），这可能有助于其在不同表达宿主中的诊断性能[43]。相比之下，MPB83是少数几种被实验证明具有糖基化修饰的牛分枝杆菌（M. bovis）蛋白之一，主要以23 kDa的蛋白质形式分泌[44]。尽管这两种形式在总体诊断性能上没有统计学上的显著差异，但MPB83_S能够检测出MPB83_E未能识别的三例IGRA阳性牛（见附加文件1）。值得注意的是，其中一头动物（P6）对其他19种抗原候选物的检测结果均为阴性，表明MPB83_S可能能够识别IGRA阳性动物中针对PTM相关表位的抗体。这一发现可能与比较MPB83_S和MPB83_E时Cohen's kappa统计量和Fisher精确检验的统计显著差异一致（见表3）。鉴于MPB83在多种野生动物宿主中的血清学检测中的广泛应用，MPB83_S能够识别出更多IGRA阳性牛的能力，表明其在TST和IGRA检测不实用的群体中具有潜在的价值[45,46]。

ESAT-6和CFP-10是牛分枝杆菌（M. bovis）差异区域1（RD1）内编码的明确描述的毒力因子，通过ESX-1（第七型）分泌系统释放，能引发强烈的细胞介导免疫反应（CMI）[47]。虽然这些抗原在TST和IGRA中具有高度免疫原性，但它们在牛分枝杆菌血清学检测中的效用被认为相对有限[20,48,49]。在本研究中，E6C10_S在IGRA阴性牛中的OD450值较高，导致其鉴别能力下降，DSe降低（见表2）。这种差异可能与构象变化有关，因为在天然PAGE和Western blot分析中，E6C10_S的表现发生了改变，并且失去了His标签的检测信号，而变性SDS-PAGE和Western blot显示其分子量和抗His反应性相似（见附加文件8）。这些发现表明，表位暴露的改变可能会在IGRA阴性牛中促进非特异性抗体结合，这可能是由于与非结核分枝杆菌（NTM）暴露相关的交叉反应所致，尤其是考虑到本研究中分析的IGRA阴性样本仍表现出适当的致炎反应。这一解释与ESAT-6和CFP-10同源物在70多种分枝杆菌物种中广泛存在的情况相符，也与先前的报告一致，即感染堪萨斯分枝杆菌（Mycobacterium kansasii）的牛在基于bPPD的皮肤测试中可能呈阳性，而感染牛分枝杆菌的动物则会对来自堪萨斯分枝杆菌ESAT-6和CFP-10的合成肽产生反应[50,51,52]。然而，由于这些解释仅基于IGRA结果，E6C10_S的非典型抗体反应在多大程度上反映了真正的牛分枝杆菌感染状态仍不确定。因此，未来需要结合尸检、细菌培养和TST等手段进行进一步研究，以明确其诊断相关性。

对多种统计分析的全面解读为宿主对抗分枝杆菌蛋白的免疫反应提供了额外的见解。尽管基于ROC的分析表明两种宿主表达的抗原在诊断性能上大体相当，但这些发现并不能排除PTM增强牛分枝杆菌相关抗原性的可能性，尤其是因为IGRA并不总是能够准确反映真正的感染状态。事实上，接种了包封牛分枝杆菌BCG疫苗的动物以及自然暴露于结核分枝杆菌（M tuberculosis）的医疗工作者中已记录到针对非蛋白质表面抗原（如糖脂和糖蛋白）的强烈抗体反应[53,54]。与这些观察结果一致，我们的结果显示LprA_S、LppX_S、MPB63_S和MPB83_S在Cohen’s kappa统计量和Fisher精确检验中的一致性值高于它们的大肠杆菌表达对应物，表明宿主依赖的分子变异（可能包括PTM）可能会影响抗原的反应性（见表3）。考虑到糖基化和脂质化对分枝杆菌存活和毒力的关键作用，以及糖脂蛋白在抗原呈递细胞（APCs）信号传导中的作用，PTM的免疫学相关性可能超越了体液免疫，还包括调节抗体产生的先天性和细胞介导的免疫反应，需要在未来研究中进行更深入的整合研究[30,39,40,41,42,55,56]。

Spearman秩相关分析显示，在IGRA阳性牛中，年龄与抗体反应之间存在统计学上显著但通常为弱到中等的关联（20种抗原中的18种；见表3）。在所有抗原候选物中，MPB63表现出明显的宿主依赖性差异。这一发现值得注意，因为MPB63除了具有分泌功能外，没有明确的PTM，其在耻垢分枝杆菌（M. smegmatis）中的表达可能保持了更接近天然的蛋白质构象[26]。在这种情况下，MPB63_S的差异性反应可能反映了与年龄相关的抗体识别模式的变化，可能与牛分枝杆菌感染后期报告的免疫谱相一致[57]。同样，LprG_S与年龄的相关性相对较强，可能表明存在宿主依赖的变异，可能是由于PTM或其他构象因素所致。然而，这些解释应谨慎对待，因为实验模型中早在感染后四周就可以检测到抗体反应[18,19]，而且像bPPD这样的免疫刺激可能会进一步增强抗体反应，无论感染阶段如何[14,16]。此外，由于感染阶段并未通过尸检确认，这些发现应在研究设计的固有限制范围内进行解释。这在韩国尤为重要，因为该国严格的根除政策限制了感染向慢性阶段的进展[10,57]。因此，需要进一步的研究将免疫观察结果与病理发现相结合，以全面评估这些抗原在不同感染阶段的诊断效用。

MLR分析用于量化每种抗原的相对贡献，并在处理潜在的多共线性（VIF < 10）后评估多抗原组合的效果，结果显示来自两种表达宿主的抗原之间存在协同作用（见图3和表4）。在由大肠杆菌衍生的组合中，八种抗原的组合表现出最高的模型性能（AUC: 0.970），而加入耻垢分枝杆菌衍生的抗原后进一步提高了鉴别能力（AUC: 0.991），当使用相同数量的抗原时，诊断性能最强。即使在基于自举方法的内部验证后（AUC: 0.955），组合抗原模型与IGRA结果表现出更高的一致性，表明ELISA的实际优势，包括样本处理的简便性、高通量和成本效益，使其成为一种有用的补充诊断工具。这种方法在运输和新鲜血液样本抗原刺激具有物流挑战性的环境中，以及在资源有限环境中的大规模牛分枝杆菌监测项目中可以有效使用[10,35]。然而，鉴于样本量有限、模型依赖性以及IGRA结果与真实牛分枝杆菌感染状态之间的不一致性，需要使用更大的独立队列和其他诊断方法进行进一步验证，以确认这些发现的可靠性和普遍性。

本研究的局限性在于缺乏直接实验分析（例如质谱或酶处理）来表征耻垢分枝杆菌中重组蛋白的PTM，包括糖基化和脂质化。尽管先前的研究已经报道了某些抗原的这些修饰[28,29,30,44,58,59]，但在本研究中这些修改尚未得到证实。值得注意的是，除了E6C10外，所有抗原候选物都是由耻垢分枝杆菌自然分泌的，而它们的大肠杆菌对应物则停留在细胞内。这一差异也可能是相关的，因为分枝杆菌蛋白与大肠杆菌是异源的，可能不会经历相同的天然 folding 过程，从而导致可能导致表位可访问性改变的结构变化。因此，观察到的抗体反应差异可能源于宿主依赖的细胞环境，而不仅仅是PTM本身。需要进一步的研究来澄清某些耻垢分枝杆菌衍生抗原产生增强抗体反应的分子和结构决定因素。

尽管通过多种统计方法证明了耻垢分枝杆菌衍生抗原的诊断潜力，但由于缺乏细菌培养或尸检等公认的金标准方法来确认感染状态，我们的发现应谨慎解读。然而，在活体动物中，这样的确认方法往往不切实际。在积极的牛分枝杆菌根除计划下，早期检测到牛分枝杆菌感染会限制尸检时 gross 损伤的识别，细菌分离的敏感性可能会受到间歇性细菌排出、感染阶段、培养条件和消毒程序等因素的影响[60,61,62,63]。在缺乏可靠的生前诊断金标准的情况下，韩国和欧盟正式采用TST和IGRA作为确认无牛分枝杆菌群体状态和动物移动认证的参考测试[31,64]。因此，我们在实施严格措施以减轻其已知限制的同时，采用了IGRA作为参考标准。为了增加阴性队列的信心，仅选择了过去五年内没有牛分枝杆菌病例报告的农场获得的样本，并且所有样本也通过MAP抗体ELISA确认为阴性。此外，为了减少假阳性反应，使用特定的MTBC相关合成肽（ESAT-6、CFP-10和TB10.4）代替牛PPD，以减少与非结核分枝杆菌的交叉反应。虽然这些措施增强了我们结果的可靠性，但需要进一步的研究来评估不同诊断方法下我们发现的稳健性，特别是考虑到不同诊断方法之间的已知不一致性[10]。

总之，本研究提示PTM与牛分枝杆菌相关的体液免疫反应之间存在潜在关联，使用了耻垢分枝杆菌衍生的重组抗原。值得注意的是，耻垢分枝杆菌衍生的LprA作为单一抗原显示出强大的诊断潜力，而结合耻垢分枝杆菌表达蛋白的多抗原组合的表现优于仅基于大肠杆菌衍生物的组合。总的来说，这些发现表明耻垢分枝杆菌作为表达宿主在提高牛分枝杆菌血清学检测的抗原性方面具有潜在的价值。