表面具有层级结构的双涂层聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒用于靶向CD44的小干扰RNA递送

《Drug Delivery and Translational Research》：Double-coated PLGA nanoparticles with hierarchical surface architecture for CD44-targeted siRNA delivery

　　

摘要 小干扰RNA的高效递送仍然是一个材料学挑战，因为它需要能够稳定多聚阴离子载荷、支持细胞相互作用并实现胞质递送的纳米载体。尽管聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒因其生物相容性、生物可降解性和监管认可而被使用，但基于PLGA的siRNA递送需要进行界面工程以满足这些要求。本文开发并优化了一个模块化的双涂层PLGA纳米粒平台，用于siRNA络合、表面功能化和可规模化制造。该体系包含一个聚乳酸-羟基乙酸共聚物核心，其表面涂覆聚乙烯亚胺中间层以介导siRNA结合，随后是透明质酸外层，用以改善胶体稳定性并促进CD44（一种在多种癌细胞上高表达的受体）介导的细胞摄取。工艺优化，包括从批量纳米沉淀法转变为微流控制造，实现了高产量、优异的可重现性、窄的粒径分布以及增加的siRNA负载。X射线光电子能谱证实了层级多层结构的组装。优化后的dcNPs2.0制剂在储存期间、在含血清培养基中、以及在使用适当冷冻保护剂进行冷冻干燥后，均表现出稳健的物理化学稳定性。对dcNPs2.0的功能评估表明，在MDA-MB-231细胞（一种三阴性乳腺癌细胞系）的二维单层和三维球状体中，siRNA递送后均实现了高效的HA介导的细胞摄取和有效的基因沉默。总体而言，本研究建立了一个可规模化、理性设计的PLGA纳米平台，该平台整合了siRNA治疗应用所需的细胞外靶向与细胞内递送要求。

研究背景

尽管临床取得重大进展，但高效且选择性的小干扰RNA递送仍是一个核心的材料学挑战，其中纳米粒设计在克服细胞外和细胞内屏障方面起着决定性作用。尽管聚合物纳米粒已被广泛探索用于药物递送，但其在siRNA递送方面的应用仍具挑战性，因为这需要更严格且常相互冲突的界面设计需求。在可生物降解聚合物中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物因其监管认可和可加工性而成为一种有吸引力的材料。然而，天然形式的PLGA纳米粒在肿瘤靶向方面欠佳，因为快速的免疫识别限制了循环时间和在靶点的有效积聚。这些限制对于需要稳定络合并保护亲水性载荷、并需要有效进入胞质以实现生物活性的核酸递送而言尤为关键。

核心-壳纳米结构，特别是通过亲水性壳层包裹疏水性聚酯核心，能够合理定制纳米粒界面以应对特定的治疗任务，并精确控制与生物环境的相互作用。其中，表面修饰透明质酸的PLGA纳米粒因其可及性、生物相容性及靶向多种肿瘤中过度表达的CD44受体的能力而备受关注。HA是一种高分子量糖胺聚糖，是细胞外基质的关键成分。将其涂覆于纳米粒表面，可使其与CD44受体发生多价相互作用，该受体在多种癌症类型中频繁上调，包括乳腺癌。此外，HA涂层可应用于PLGA纳米粒，且通过温和、可规模化的过程（如吸附或层层自组装）实现，使其与敏感载荷和良好生产规范要求兼容。除了靶向作用，HA还通过其高度水化的结构有助于纳米粒稳定性和隐形行为。

此前，研究人员开发并广泛表征了双涂层纳米粒，它可以在冻干后仍保持高稳定性，并能选择性地在CD44过表达的肿瘤细胞中积聚，包括A549、HCT-116和MDA-MB-231细胞。基于此已建立的平台以及人们对基于siRNA的实体瘤治疗策略日益增长的兴趣，本研究将dcNP方法扩展到siRNA递送，作为针对CD44过表达癌症的靶向纳米技术策略。

研究目的

本研究旨在建立一个稳健且可扩展的siRNA负载双涂层PLGA纳米粒的制备方法，从实验室规模制备推进到微流控制造，评估其安全性，并证明其在三阴性乳腺癌的二维和三维模型中沉默萤光素酶和/或绿色荧光蛋白基因的能力。

关键技术方法

本研究采用了多项关键技术。首先，通过溶剂扩散法和微流控技术（使用NanoAssembler^?设备）制备PLGA核心纳米粒。其次，采用基于静电相互作用的层层自组装技术，在PLGA核心上依次涂覆聚乙烯亚胺和透明质酸，形成双层结构。第三，通过动态光散射、纳米颗粒跟踪分析和Zeta电位测定评估纳米粒的胶体性质。第四，利用X射线光电子能谱进行表面和深度剖析，确认多层结构的组装。第五，通过琼脂糖凝胶阻滞实验和Quant-iT? RiboGreen RNA检测试剂盒分析siRNA的络合与释放。第六，在细胞水平上，利用荧光显微镜、流式细胞术、细胞活力检测、萤光素酶报告基因检测以及共聚焦显微镜成像等技术，在CD44高表达的MDA-MB-231乳腺癌细胞及其三维肿瘤球状体模型中，系统地评估了纳米粒的细胞摄取、内体转运路径、生物相容性和基因沉默功效。

研究结果

制备方案的优化

dcNPs通过多步骤程序制备，其中PLGA核心涂覆PEI形成PLGA@PEI NPs，随后络合siRNA，最后涂覆HA形成PLGA@PEI@HA NPs。初期制备涉及多次离心-重悬步骤，导致纳米粒浓度显著下降。通过优化，研究人员去除了泊洛沙姆188，并将PEI浓度优化至200 μg/mL，实现了PEI的完全吸附。siRNA负载量从1%提高到4%，HA浓度增加至1.5 mg/mL，并简化了洗涤步骤，将制剂产率从约50%提高到90%，并显著提高了工艺重现性。随后，PLGA核心的制备从批量纳米沉淀法转变为微流控生产，实现了对流动速率、试剂浓度和混合动力学的精确控制，获得了单分散性显著提高的纳米粒，多分散指数小于0.1，尺寸分布更窄，从而提高了制剂的再现性，并支持未来临床转化。最终优化的制剂称为dcNPs2.0。

X射线光电子能谱表面与深度剖析

XPS用于研究dcNPs2.0的表面组成和层级结构。深度剖析通过连续溅射进行，能够从颗粒表面向内部评估化学成分。高分辨率C1s光谱揭示了四种不同的碳键合环境。氮信号的原子浓度在颗粒表面富集，并随溅射深度增加而迅速降低，表明含氮组分（源自PEI）表面富集。磷信号也显示出类似的深度依赖性减少，与siRNA（其磷酸基团）和PEI层相关。这些观察结果证实PLGA核心被预期的功能层有效包覆，HA形成外界面，而PEI和siRNA保持在近表面区域，证明了分层多层纳米结构的成功形成。

dcNPs2.0的储存、血清和冻干后稳定性

研究人员在多种储存和生物相关条件下综合评估了dcNPs2.0-siRNA_SC制剂的物理化学稳定性。在室温、4°C和37°C下储存，胶体性质总体保持良好。在生理条件下孵育，siRNA呈现渐进和持续的释放曲线，48小时内达到约100%释放。冻干研究表明，蔗糖作为冷冻保护剂可有效保存纳米粒完整性。在补充了1%或10%胎牛血清的培养基中，制剂在72小时内保持稳定，表明与含蛋白培养基有良好的相容性。在pH 7.4和pH 5.5条件下孵育1小时后，未检测到siRNA释放，证实了siRNA在dcNPs2.0内的稳定络合。这些结果共同表明，dcNPs2.0在不同储存和生物相关条件下均表现出高物理化学稳定性、可控的siRNA释放以及在含血清生物介质中的稳健性能。

二维细胞模型中的生物学评价

在MDA-MB-231细胞中评估dcNPs2.0用于siRNA递送的生物相容性、摄取和功能。结果显示，在测试的任何剂量或暴露时间下均未检测到细胞毒性，证实纳米粒在该细胞模型中具有良好的耐受性。定量荧光分析显示，在72小时内实现了高效且浓度依赖性的纳米粒内化，这与HA介导的CD44靶向作用一致。使用靶向萤光素酶的siRNA进行处理，导致MDA-MB-231细胞中萤光素酶表达显著降低，证明了有效的细胞内释放和所递送siRNA的生物活性。内体转运研究表明，在早期时间点，dcNPs2.0被有效内化，与早期内体标志物的共定位极少，表明CD44介导的摄取可能涉及非经典内存途径和/或快速通过早期内体。在24小时，纳米粒信号在细胞质中更弥散分布，与内体区室重叠有限，表明部分内体逃逸。在48小时，观察到与晚期内体标志物的共定位增加，表明一部分内化的纳米粒经历了向内体-溶酶体途径的延迟运输，但仍有相当大比例的纳米粒信号与内体区室在空间上分离，这与观察到的持续基因沉默一致。

三维细胞模型中的生物学评价

研究人员在MDA-MB-231细胞生成的三维肿瘤球状体模型中进一步评估了dcNPs2.0的性能。荧光标记的dcNPs2.0-siRNA_SC在72小时孵育期间能够有效穿透球状体外层并被肿瘤细胞内化，且呈浓度依赖性。竞争性摄取实验表明，用游离HA预处理球状体以饱和CD44受体，可显著减少纳米粒的内化，证实了CD44在纳米粒转运中的参与。基因沉默效率通过siRNA_LUC和siRNA_GFP进行评估。在萤光素酶表达的球状体中，dcNPs2.0-siRNA_LUC处理导致生物发光显著降低，反映了萤光素酶表达的减少。在GFP表达的球状体中，观察到GFP荧光呈时间依赖性显著下降，证实了荧光报告蛋白的有效沉默。这些结果突出了dcNPs2.0在复杂、类组织环境中穿透、被内化并诱导基因沉默的能力。

讨论与结论

总体而言，本研究建立了一个可扩展、合理设计的PLGA纳米平台，它整合了siRNA治疗应用所需的细胞外靶向与细胞内递送要求。工艺优化，包括过渡到微流控制造和表面组成的合理控制，实现了高制剂产率、优异的胶体稳定性和可重现的纳米粒性质。分层的PEI/HA表面结构使得纳米粒能够实现CD44介导的细胞摄取、可控的细胞内加工，并在TNBC的二维和三维模型中都实现了有效的基因沉默，证明了在日益复杂的生物条件下功能性siRNA的递送。除了siRNA递送，dcNPs2.0的模块化设计提供了一个多功能材料平台，可以很容易地进行调整，在PLGA核心内纳入额外的治疗性载荷。这项工作建立了一个可扩展且经过理性设计的纳米平台，具有进一步发展为治疗实体瘤的组合和多模式策略的强大潜力。