《International Journal of Pharmaceutics》：A bioengineered extracellular vesicle-based platform for targeted codelivery and multi-mechanistic therapy of skin fibrosis
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方玉清|胡晨晨|刘勇|王璐|沈 Wang|孙斌|张永利|祖若菲|邓洋洋|方凯|夏红梅安徽中医学院药学院，中国合肥市龙子湖路350号，230012摘要系统性硬化症（SSc）是一种自身免疫性纤维化疾病，目前有效的治疗方法有限。山柰酚（Kaempferol，简称K）具有显著的抗纤维化作
方玉清|胡晨晨|刘勇|王璐|沈 Wang|孙斌|张永利|祖若菲|邓洋洋|方凯|夏红梅
安徽中医学院药学院，中国合肥市龙子湖路350号，230012
摘要
系统性硬化症（SSc）是一种自身免疫性纤维化疾病，目前有效的治疗方法有限。山柰酚（Kaempferol，简称K）具有显著的抗纤维化作用，但其溶解度和递送效率较低。在本研究中，我们采用薄膜分散法制备了载有山柰酚的脂质体，通过超速离心结合PEG沉淀法提取外泌体，并通过反复冻融融合成功构建了山柰酚负载的脂质体-外泌体复合纳米粒子（KLE）。表征显示，KLE具有理想的理化性质：平均粒径为189.87±12.62 nm，多分散指数（PDI）为0.40±0.09，包封率为66.00±3.07%。KLE在体外表现出缓释行为，并通过激活Nrf2/ARE抗氧化通路，增强了DPPH自由基的清除能力（在0.2 mg/mL浓度下为55.92±4.34%）。在博来霉素诱导的小鼠局部硬化模型中，局部给药KLE显著减轻了皮肤增厚和胶原蛋白沉积，抑制了肌成纤维细胞的活化。同时，它还下调了TGF-β/Smad信号通路，减少了促炎因子，并调节了VEGF的表达。本研究表明，KLE结合了脂质体的高载药能力和外泌体的递送优势，为SSc相关的皮肤纤维化提供了一种安全有效的多靶点治疗策略。
引言
系统性硬化症（SSc）是一种复杂的自身免疫性疾病，其特征是免疫失调、血管病变以及皮肤和内脏器官的进行性纤维化（Faber等人，2024年；Jantarat和Muangchan，2022年；Ramahi等人，2020年）。皮肤纤维化是SSc的标志性特征，由慢性炎症、过度转化生长因子-β（TGF-β）信号传导以及细胞外基质（ECM）过度沉积所驱动（Andréasson等人，2016年；Do和Eming，2016年；Russo等人，2022年）。TGF-β激活真皮成纤维细胞的Smad通路，促使它们分化为表达α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的肌成纤维细胞，这些细胞产生过多胶原蛋白，从而导致皮肤增厚和组织功能障碍（Fei等人，2024年；Gr?nberg等人，2024年；Li等人，2016年）。氧化应激进一步加剧了炎症和纤维化过程，形成了维持疾病进展的恶性循环（Wang等人，2025年；Xie等人，2022年）。
当前针对SSc的治疗策略受到单一靶点设计的限制，难以全面调节复杂的发病机制，并存在脱靶风险（Dabeek和Marra，2019年；Periferakis等人，2022年）。山柰酚（Kaempferol，简称K）是一种天然黄酮类化合物，通过调节TGF-β/Smad通路具有抗纤维化、抗炎和抗氧化作用（Cuijpers等人，2025年；Huang等人，2025年；Ji等人，2020年）。然而，由于其水溶性差、皮肤渗透性低、代谢迅速以及在纤维化病变区域局部保留不足，山柰酚的临床应用受到严重限制，这些都大大降低了其局部治疗效果（Billowria等人，2024年；Calderón-Monta?o等人，2011年；Li等人，2025年）。
为了改善山柰酚的溶解度、稳定性和递送效果，人们开发了多种纳米载体，包括脂质体、聚合物纳米粒子、胶束和纳米晶体。尽管这些制剂在一定程度上提高了药物的分散性和皮肤滞留性，但往往存在生物相容性差、皮肤穿透性低、潜在刺激作用或缺乏协同抗纤维化效果的问题（Huang等人，2017年；Piffoux等人，2022年；Sah等人，2025年）。最近，脂质体-外泌体复合纳米粒子作为一种仿生平台应运而生，它结合了合成脂质体的高载药能力和可控释放机制以及天然外泌体的优异生物相容性和低免疫原性。然而，这类复合系统在SSc相关皮肤纤维化中的应用尚不多，其与单一脂质体或外泌体制剂相比的优势尚未得到充分验证（Chiabotto等人，2025年；Ji等人，2024年；Xu等人，2025年）。
为了解决这些问题，我们设计了一种新型的山柰酚负载脂质体-外泌体复合纳米粒子（KLE），用于经皮给药。这种局部给药方式能够将药物直接沉积在纤维化病变区域，最大化皮肤内的药物浓度，减少全身暴露和脱靶效应，并具有非侵入性和良好的依从性，适用于慢性SSC的长期治疗。KLE由融合的脂质体和天然外泌体组成：脂质体提供高载药能力和结构稳定性，而外泌体则提升了生物相容性和皮肤耐受性。从机制上看，KLE优于单纯的脂质体（KL）和外泌体（KE）：它具有更强的皮肤滞留性和穿透性，以及更高的载药率和稳定性。
KLE通过提高山柰酚的溶解度和皮肤渗透性、延长局部滞留时间、协调缓解氧化应激、抑制炎症以及下调TGF-β/Smad信号通路等多种机制发挥抗纤维化作用。通过这种方式，KLE重塑了病理微环境，并同时针对皮肤纤维化的多个关键步骤，这单一使用山柰酚或单一成分的纳米载体难以实现。
我们假设KLE能够在皮肤纤维化的小鼠模型中克服山柰酚的局限性，展现出更强的抗纤维化效果。本研究提供了一种新型的仿生纳米递送系统，为纤维化性皮肤疾病的治疗提供了有前景的策略。
该图由作者制作，用于说明皮肤纤维化过程中涉及的关键信号通路和细胞过程，包括TGF-β介导的成纤维细胞活化、ROS生成和炎症细胞因子级联反应。在制备过程中未使用任何外部资源、现有图谱或第三方模板。
章节片段
材料
本研究使用的主要化学化合物如下：山柰酚。实验中使用的脂质体、外泌体和纳米载体属于药物递送系统，并非独立的有机小分子化合物。本研究严格遵循期刊要求，仅列出了核心活性化合物（图1）。
山柰酚购自上海麦克莱恩生化技术有限公司（中国上海）；FeSO4·7H2O、蛋黄磷脂和胆固醇等原料亦来自该公司。
制备纳米粒子的理化表征
制备的纳米粒子的形态和关键理化性质如图2所示。KL呈均匀的球形，平均粒径为177.03±12.62 nm，ζ电位为-53.33±0.93 mV，多分散指数（PDI）为0.11±0.03（图2a和b），透射电子显微镜（TEM）观察到其典型的层状双层结构（图2c）。植物来源的外泌体样纳米粒子在显微镜下呈现特有的杯状形态。
讨论
纤维化性疾病（如系统性硬化症）的治疗仍是一个重要的临床挑战，主要由于病变微环境的复杂性以及缺乏能够同时应对其多方面特征的疗法。本研究证明，通过功能优化的纳米递送系统递送生物活性化合物的KLE，为对抗皮肤纤维化提供了一种多管齐下的有效策略。
结论
总之，本研究系统地开发并验证了一种用于治疗与系统性硬化症相关的皮肤纤维化的KLE。KLE具有优异的理化性质：平均粒径为189.87±12.62 nm，多分散指数（PDI）为0.40±0.09，ζ电位为-12.19±2.64 mV。体外释放实验显示其具有缓释特性（60小时释放率：42.31±1.74%）。
伦理审批
所有动物实验均遵循安徽中医学院伦理委员会的指导原则进行，确保了动物的福利。伦理审批编号：AHUCM-mouse-2025019。
CRediT作者贡献声明
方玉清：负责撰写初稿、方法设计、实验实施、数据分析与整理。胡晨晨：负责撰写初稿、方法设计、实验实施、数据分析与整理。刘勇：负责方法设计、实验实施、数据分析与整理。王璐：负责方法设计、实验实施、数据分析与整理。沈 Wang：负责方法设计、实验实施、数据分析与整理。孙斌：负责方法设计、实验实施、数据分析
资助
本研究得到了以下项目的支持：企业委托的研发项目：黄酮类抗氧化生物活性的研究（2022HZ049）、安徽省新时代教育质量工程项目——研究生教育教学改革研究（2023jyjxggyjY168）、安徽省教育厅2021年的质量工程项目（2021jyxm0824）、中国安徽省教育厅（KJ2019A0470）等。
利益冲突声明
作者声明未存在可能影响本研究工作的已知财务利益或个人关系。
