锌在皮肤中的转运机制：金属硫蛋白1+细胞在皮肤稳态中的身份与功能

《JID Innovations》：Zinc flux in skin: Identity and function of Metallothionein 1+ cells in skin homeostasis

　　索菲娅·布里托（Sofia Brito）| 郑允真（Jeong-Yun Kim）| 朱成权（Sung Kweon Cho）| 李光斌（Gwangbin Lee）| 朴智焕（Ji-Hwan Park）| 金智允（Jiyoon Kim）| 闵 bum-ho（Bum-Ho Bin）
韩国天主教大学医学院药理学系，首尔 06591，韩国

**摘要**
锌对皮肤稳态至关重要，然而富含锌的表皮细胞的身份和功能仍不明确。金属硫蛋白-1（Metallothionein-1，简称MT1）是一种对锌具有反应性的蛋白质，常被用作细胞内锌的标记物，但尚不清楚MT1+细胞是否代表表皮干细胞或特化的细胞群体。在这里，我们构建了一个Mt1-P2A-EGFP-2A-CreERT敲入小鼠模型，实现了对MT1+细胞的谱系追踪。报告基因的激活证实了锌依赖性的表达，并揭示MT1+细胞从胚胎阶段到成年期广泛分布在毛囊间表皮、下方连接区和毛囊中。单细胞RNA测序表明，MT1+细胞是一个独特的细胞群，与已知表皮干细胞的标记物重叠较少，这表明MT1并不定义一个典型的干细胞群体，而是标记了一类异质性的表皮细胞。在稳态状态下进行谱系追踪时，发现MT1+细胞参与了多种表皮细胞的生成，包括皮脂腺和毛囊区域。然而，在伤口愈合过程中，MT1+细胞的迁移或参与再生作用有限，而MT1-细胞则主要驱动表皮修复和毛囊重建。这些发现表明，MT1标记的是与锌相关的表皮细胞，这些细胞参与了皮肤的维持而非再生过程，同时也揭示了富含锌的表皮细胞群内部的异质性，突显了MT1+细胞和MT1-细胞在皮肤生理和修复中的不同作用。

**引言**
作为主要的锌储存库，皮肤依赖于锌来维持稳态和再生，但锌缺乏特别容易引发各种皮肤疾病（Al-Khafaji等人，2022年；Bin B. H.等人，2017年；Brito等人，2020年）。锌是铁和钙之后第三大丰富的必需矿物质，支持众多酶、转录因子和结构蛋白的功能，人类超过10%的蛋白质都与锌结合。由于锌倾向于在未分化的祖细胞中积累，因此富含锌的细胞常被认为是皮肤干细胞（Bin等人，2018年；Chen等人，2024年；Sahibdad等人，2023年）。尽管锌对皮肤至关重要，但其详细的动态变化和干细胞特性仍不完全清楚。

金属硫蛋白1（MT1）是一种依赖锌的分子，作为细胞稳态的锌储存分子，并广泛用作细胞内锌水平的标志物（Bin Bum-Ho等人，2017年；Heuchel等人，1994年）。细胞内锌浓度的升高增强了其与金属调节转录因子1（MTF-1）的结合，使其转移到细胞核并与DNA中的金属响应元件（MREs）结合，从而触发转录，尤其是MT1的转录。虽然先前的研究已将MT1的表达与主要位于毛囊中的富含锌的细胞联系起来（Karasawa等人，1991年），但MT1+细胞在皮肤中的更广泛分布和具体功能仍不清楚。了解这些细胞的功能可能为锌稳态如何影响皮肤再生和疾病提供关键见解。

**结果与讨论**
**MT1标记一种独特的表皮细胞群体，这种细胞在毛囊和基底层中富集**
我们首先构建了Mt1-P2A-EGFP-2A-CreERT敲入小鼠模型（图1a和1b），并将其与R26R报告基因小鼠杂交（图1c）。这使得通过他莫昔芬诱导的Cre激活和随后的X-Gal染色来追踪特定时间点的MT1+细胞成为可能。小鼠皮肤切片的免疫荧光染色显示内源性MT1和EGFP报告基因信号之间存在明显的共定位，证实了敲入等位基因在体内的忠实表达（图1d）。从Mt1-EGFP小鼠中分离出的原代角质形成细胞在锌剂量依赖性条件下显示出增强的EGFP信号（图1e）。

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**图1. Mt1敲入谱系追踪小鼠模型的构建与验证。**
(a) Mt1-P2A-EGFP-2A-CreERT敲入小鼠模型的示意图。
(b) 尾部基因组的基因分型PCR结果。
(c) Mt1iCre/WT; R26Rfl/+小鼠模型的示意图。
(d) P20时小鼠皮肤切片的免疫荧光染色，显示内源性MT1（红色）、EGFP报告基因信号（绿色）和DAPI（蓝色）。合并图像显示MT1和EGFP信号的重叠部分。
(e) 流式细胞术分析显示，分离出的细胞表达的EGFP依赖于锌浓度。数据代表三个独立实验中的一个。

他莫昔芬处理三天后，LacZ染色和EGFP荧光在毛囊中共定位（图2a），证实了我们的Cre系统的正常功能。虽然大多数表皮细胞未被标记，但在胚胎E12.5天时就在胚胎板区域检测到了LacZ阳性细胞（图2b）。在成年小鼠中，这些细胞主要分布在毛囊间表皮和下方连接区（图2b和2c）。为了评估相对上皮静止状态下的长期细胞命运，我们在出生后第55天的休止期（telogen）开始了谱系追踪实验。P58时检测到的LacZ标记细胞主要位于毛囊间表皮、下方连接区和毛囊生发区（图2c(i)）。这些细胞随后增殖并参与了多个表皮细胞的生成，包括皮脂腺和毛囊生发区的形成，这一点通过组织学分析和定量评估得到了证实（图2c和2d）。高倍显微镜图像（图2c(ii)）显示，LacZ+细胞主要存在于毛囊间表皮的基底层和下方表层。然而，只有少数毛囊完全由LacZ标记细胞组成（图2e）。在生长期（anagen），MT1报告基因活性进一步增强，跨毛囊周期的分析显示，生长期的MT1+细胞数量高于休止期（图2f和2g）。

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**图2. MT1+表皮细胞的稳态定位和谱系追踪**
(a) X-Gal/伊红染色（left）显示MT1+细胞在毛囊中富集。EGFP荧光成像（right）同样证实了MT1+细胞在毛囊中的富集。比例尺，50 μm。
(b) X-Gal/伊红染色显示E10-E12.5和P20-P23阶段的MT1+细胞。箭头指示MT1+细胞。比例尺，20 μm（E10-E12.5）和50 μm（P20-23）。
(c) X-Gal/伊红染色显示P55-P58和P55-P112阶段皮肤切片中的MT1+细胞，放大倍数分别为x40和x63。比例尺，50 μm（i）和25 μm（ii）。
(d) 与图(e)相关的MT1+细胞数量量化。X-Gal/伊红染色和EGFP荧光图像显示MT1+细胞的分布。比例尺，100 μm。
(f) 发生期（P35）小鼠皮肤的代表性LacZ染色，显示毛囊中的MT1谱系标记细胞。
(g) 毛发周期中MT1阳性细胞数量动态变化的示意图，生长期（A）数量较多，休止期（T）数量较少。E表示胚胎日，P表示出生后日。

为了进一步表征MT1+细胞，我们分析了已发布的表皮单细胞RNA测序数据集，并将MT1的表达与已知的表皮干细胞标记物进行了比较（Clevers，2015年；Joost S.等人，2016年）。使用Seurat软件包进行的聚类分析识别出12个转录上不同的细胞群体（图3a(i)）。MT1表达主要在群集3中富集，表明其在表皮细胞状态中的分布并不均匀（图3a(ii)）。此外，特征图显示了MT1、Trp63、Itga6、Krt14和Krt15在表皮细胞群体中的分布（图3b(i–v)）。表达MT1的细胞与经典表皮干细胞标记物（包括Lrig1、Prdm1、Lgr5、Lgr6、Gli1和Cd34）的重叠极少（图3c(i–vi)）。同样，与广泛表达的基底/干细胞相关标记物（如Trp63（图3b(ii)）和Itga6（图3b(iii)）的重叠也有限。相比之下，MT1的表达与Krt14（图3b(iv)）和Krt15（图3a(v)）群体部分重叠，这与它们在基底表皮区和毛囊中的定位一致（图2a、2c和3d）。比较MT1高表达和MT1低表达细胞之间的差异表达分析发现了多个显著改变的基因（图3e）。通路富集分析进一步揭示了它们与上皮分化、离子稳态、炎症反应和氧化应激相关过程的关联（图3f）。总体而言，这些发现表明MT1并不特异性地标记典型的表皮干细胞群体，而是标记了一类具有独特空间定位和潜在特化功能特性的基底相关表皮细胞。

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**图3. MT1+表皮细胞的单细胞转录组谱型分析。**
(a) 12个细胞群的UMAP可视化（i）和MT1表达的特征图（ii），显示其在群集3中的富集。
(b) 特征图显示（i）MT1，（ii）Trp63，（iii）Itga6，（iv）Krt14，（v）Krt15在12个细胞群中的表达情况。
(c) 特征图显示MT1+细胞与经典表皮干细胞标记物（包括（i）Lrig1，（ii）Prdm1，（iii）Lgr5，（iv）Lgr6，（v）Gli1，（vi）Cd34）之间的有限重叠。
(d) 组织学切片显示Krt14的表达情况（来自The Human Protein Atlas）。比例尺，200 μm。
(e) 火山图显示MT1高表达（Mt1 > 3）细胞与MT1低表达（Mt1 = 0）细胞中差异表达的基因。选定的上调和下调基因被突出显示。
(f) MT1高表达与MT1低表达细胞中差异表达基因的基因本体/通路富集分析。

**MT1-细胞主要参与表皮伤口再生**
鉴于锌对皮肤稳态的重要性（Miller等人，1965年），我们研究了MT1+细胞对伤口愈合的贡献。在第二个休止期（P55）开始谱系追踪，在背部皮肤上制造了一个1平方厘米的切口，并追踪了4个月内的MT1+细胞。尽管MT1+细胞在基底层和毛囊中有广泛表达，但它们对伤口再生的贡献很小。伤口形成后2天（2DPW），表皮再生已经开始（图4a），但LacZ标记细胞在结痂和新形成的表皮中很少见，主要存在于原有的毛囊和残余的表皮中（图4b）。定量分析证实，早期再生的表皮主要由MT1-细胞组成（图4c）。在7DPW时，伤口边缘的MT1+细胞保持分散的分布，与其稳态模式相同（图4c和4d），并未向伤口区域迁移。这种缺乏迁移的现象表明MT1+细胞并未积极参与再生过程。值得注意的是，表皮再生不完全规则，形成了过度增殖的区域（图4d，红色虚线区域），这些区域主要由MT1-细胞占据。表皮最终闭合，但再生的真皮层胶原蛋白纤维密度较低，且未观察到新的毛囊（图4d，下层）。这表明MT1-细胞而非MT1+细胞主要负责表皮增殖和伤口闭合。为了确定MT1-细胞在伤口愈合后期是否仍然占主导地位，我们在伤口形成后49天（49DPW）检查了伤口部位，此时伤口已肉眼不可见。横截面分析显示伤口边缘和缺乏毛囊的明显三角形区域，该区域充满了松散排列的胶原纤维（Wallace等人，2017年）（图4e）。虽然在伤口外的毛囊和毛囊间表皮中检测到了MT1+细胞，但在再生的表皮中未发现它们。到133DPW时，毛囊重新出现在伤口区域，并含有MT1+细胞（图4f）。由于在损伤前使用了他莫昔芬进行标记，LacZ阳性细胞的存在证实这些新形成的毛囊源自最初重新填充伤口部位的MT1-细胞。由于CreERT和EGFP受内源性MT1启动子的驱动，最初的报告基因激活是对锌敏感的。然而，谱系追踪实验中的LacZ表达反映了他莫昔芬诱导时的历史MT1启动子活性，并不能反映当前的锌水平。

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**图4. MT1-细胞主要参与表皮伤口修复。**
(a) X-Gal和伊红染色显示2DPW时从原伤口区域再生出来的表皮（re-epi）。伤口是用5毫米的打孔器制造的。箭头表示分层的表皮（SE）生长方向。比例尺，200 μm。
(b) X-Gal和伊红染色显示再生表皮主要由未分化的角质形成细胞组成。比例尺，200 μm（左上），100 μm（a），50 μm（右上），20 μm（b,c）。
(c) 不同细胞类型中MT1表达的量化（n = 100）。数据代表五个独立实验的平均值±标准差（***P < 0.001）。
(d) X-Gal和伊红染色显示7DPW时MT1+细胞的过度增殖。比例尺，200 μm。
(e) X-Gal和苏木精/伊红（H&E）染色显示49DPW时的再生区域（红色虚线轮廓）。黑色箭头指示毛囊的方向，粉色箭头表示表皮收缩的方向，蓝色箭头表示伤口边缘的真皮收缩。比例尺，50 μm。(f) X-Gal和eosin染色显示，在133 DPW时，再生表皮内的所有毛囊都含有MT1+细胞。比例尺，250 μm。DPW，表示受伤后的天数。我们的研究发现，MT1标记的是一种多样且异质性的表皮细胞群，而不是作为干细胞的特异性标志物。虽然MT1+细胞主要参与毛囊的维持，但它们对伤口愈合的贡献有限，这表明它们在皮肤生理学中扮演着更专业的角色。相反，再生过程主要由MT1-细胞驱动，这突显了表皮微环境中不同的功能角色。MT1+细胞和MT1-细胞之间的这种区别凸显了锌稳态在皮肤再生中的复杂性。未来研究MT1+细胞的具体功能及其与MT1-细胞的相互作用，可能会改进针对皮肤中锌相关通路的治疗方法。

**材料与方法**
**动物实验**
所有动物实验均得到机构动物护理和使用委员会的批准，并按照《非人类动物在研究中的护理和使用伦理准则》进行。Mt1iCre/iCre突变小鼠是在C57BL/6N背景上使用Biocytogen（编号EGE-CYX-038）通过将P2A-EGFP-2A-iCreERT2 cassette插入Mt1的外显子3中生成的（图S1a）。两个P2A序列允许在同一个个子 promoter下表达天然的Mt1和EGFP蛋白。通过两种不同的引物进行基因分型来确认敲入等位基因（图S1a和S1b）。这些小鼠表达了他莫昔芬（TAM）诱导的Cre重组酶。Mt1iCre/iCre小鼠与R26Rfl/fl（JAX编号003474）报告基因小鼠交配，以生成Mt1iCre/WTR26Rfl/+（Mt1-iCre）小鼠，以便研究Mt1+细胞及其谱系的作用（图1A和图S1c）。该小鼠模型产生的所有后代都表现健康且具有生育能力，没有不适的迹象。PCR确认了Mt1和R26R的基因型，所用引物列在图S1中。为了激活Cre重组酶，将200 μL的TAM（10 mg/ml，溶于葵花籽油）通过腹腔注射给Mt1-iCre小鼠（Snippert等人，2010）。三天后收集小鼠皮肤，利用TAM检测显示半乳糖苷酶活性的MT1+细胞。

**流式细胞术**
如之前所述（Bin Bum-Ho等人，2017），从新生Mt1-EGFP小鼠中分离并培养原始角质形成细胞。细胞用不同浓度的ZnSO4（0、1、5或10 mM）处理24小时。细胞分析按照之前的方法进行（Brito等人，2025；Gerena-Lopez等人，2004）。处理后，细胞用PBS洗涤并用于流式细胞分析。在所有条件下，使用相同的采集设置通过流式细胞仪测量EGFP荧光强度。数据使用FlowJo软件进行分析，并比较了不同锌浓度下的EGFP强度分布。展示了三个独立实验中的一个代表性直方图。

**单细胞RNA-seq**
亚型分类按照之前的方法进行（Joost Simon等人，2016）。简而言之，根据细胞Mt1的标准化对数表达值将细胞分为三种亚型：表达值大于3的细胞定义为Mt1+细胞，表达值等于0的细胞定义为Mt1-细胞，表达值在0到3之间的细胞定义为Mt1-细胞（0 ≤ Mt1 ≤ 3）。为了后续分析，我们重点比较了Mt1+（Mt1 > 3）和Mt1-（Mt1 = 0）两组。

**伤口愈合评估**
在TAM处理三天后，使用含有80 mg 2,2,2-三溴乙醇（#T48402，Sigma Aldrich）、50 μl t-戊醇（#PHR1667，Sigma Aldrich）和4 ml生理盐水（Cleancle，JW Pharmaceutical，韩国首尔）的avertin溶液（350 mg/kg）对Mt1-iCre小鼠进行麻醉，该方法基于之前的报道（Huang等人，2021）。剃除小鼠背部皮肤后，按照Brubaker等人描述的方案制备切口伤口模型（Brubaker等人，2015）。受伤后，在受伤后的第2、7、49和133天对小鼠实施安乐死，并收集背部皮肤。

**β-半乳糖苷酶染色（X-Gal染色）**
将解剖的皮肤样本用固定液（2%甲醛和0.2%戊二醛溶于PBS）在室温下固定30分钟，然后用冲洗缓冲液（2 mM MgCl2、0.1% NP-40溶于PBS）冲洗20分钟。将组织浸入X-Gal溶液中（1 mg/ml X-gal、5 mM K3Fe(CN)6、5 mM K4Fe(CN)6溶于冲洗缓冲液），并在37°C下染色24小时。

**组织学分析**
样本通过石蜡包埋、切片和复染（eosin或hematoxylin和eosin染色）在韩国非临床技术解决方案中心（京畿道）制备成切片。使用配备DP74数字相机的Olympus BX53显微镜获取所有切片的宏观和显微图像，用于组织学分析。

**统计分析**
使用双尾Student’s T检验分析两组之间的差异。P值小于0.05被认为是统计学上显著的。

**未引用的参考文献**
Bin等人，2017；Wallace等人，2026。