上皮MLCK缺乏通过树突状细胞–Th17细胞轴缓解酒精相关性肝病

《JHEP Reports》：Epithelial MLCK deficiency alleviates alcohol-associated liver disease via dendritic–Th17 cell axis

　　新达王 | 胡安 | 雷雄 | 唐三南 | 吴双 | 赵俊浩 | 王志涵 | 朱佳仪 | 李亚群 | 庄佳瑜 | 吴俊杰 | 张金若 | 周子祺 | 黄建上 | 申海元 | 吴淼苗 | 亓丽娜 | 何伟 | 胡若蕾 | 杰罗德·R·特纳 | 安徽医科大学第一附属医院肿瘤科，合肥，中国

**摘要**
**背景与目的**
肠道树突状细胞（DCs）在免疫调节中起着关键作用，尤其是在损伤过程中。肠道上皮细胞间通透性在DCs抗原呈递及其调节中的作用尚不明确。肌球蛋白轻链激酶（MLCK）调控屏障通透性，本研究探讨了其在酒精相关性肝病（ALD）中DCs功能和免疫反应中的作用。

**方法**
我们使用了全身性和肠道上皮特异性Mylk敲除模型（每组6只小鼠）来研究与ALD相关的MLCK介导的渗漏途径。同时评估了持续活性MLCK在肠道上皮细胞中的影响（n = 6）。机制研究集中在LPA-LPAR2-Ca2+依赖的MLCK激活上，并通过流式细胞术评估了紧密连接完整性、DC抗原摄取和呈递情况，以及致病性Th17细胞反应（n = 3）。

**结果**
在ALD中，MLCK介导的渗漏途径上调（n = 6，p < 0.05）。全身性和肠道上皮特异性Mylk敲除均减缓了ALD的进展，表现为肝损伤标志物减少（ALT下降50%，n = 6，p < 0.05）；而持续活性的MLCK则加速了疾病进程（n = 6，p < 0.05）。LPA-LPAR2信号通路通过Ca2+/CaM依赖途径激活MLCK，破坏了紧密连接，并增强了DC抗原的摄取和抗原呈递能力（增加了1.4倍，n = 3，p < 0.05）。这促进了致病性Th17细胞的反应和GM-CSF的产生（增加了2倍，n = 6，p < 0.05），导致肝脏炎症。

**结论**
本研究强调了MLCK调节的肠道通透性在ALD中DCs功能和Th17细胞分化中的作用。针对这一途径可能为ALD提供新的治疗策略。

**影响与意义**
该研究揭示了MLCK调节的肠道细胞间通透性在酒精相关性肝病（ALD）中的关键作用，扩展了我们对肠道-肝脏相互作用的理解。这些发现为免疫调节和屏障功能提供了新的科学见解，为ALD的治疗提供了潜在的治疗意义。通过突出MLCK介导的屏障功能在树突状细胞（DCs）功能和Th17细胞分化中的作用，这项研究为临床应用开辟了新的途径，特别是在开发针对ALD的靶向疗法方面。对于研究人员而言，这些发现为肠道微生物群与免疫反应之间的相互作用提供了新的视角，推动了免疫学和胃肠道疾病领域的发展。

**引言**
酒精相关性肝病（ALD）是全球主要的健康负担之一。[1],[2],[3] 2019年，ALD导致了约1100万人年的生命损失，死亡率显著增加。流行病学研究表明，普通人群中ALD的患病率约为3.5%，在危险饮酒者中上升到26.0%，而在酒精使用障碍患者中达到55.1%。[4] 其严重形式——酒精相关性肝炎（AH）预后非常差，30天死亡率高达30-50%。[5] 目前的临床治疗方法有限，迫切需要探索新的治疗靶点。[6],[7],[8]
肠道-肝脏轴被认为是ALD发生和进展的核心驱动因素。[9],[10] 最近的研究进一步表明，肠道屏障功能障碍与多种肝病密切相关，包括酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪肝病和肝硬化。[11],[12] 在NAFLD患者和动物模型中均观察到肠道通透性显著增加。[13] 类似地，在ALD中，乙醇会破坏肠道屏障结构和免疫稳态，导致微生物产物和病原体转移到肝脏，从而加剧肝脏损伤。[14],[15] 因此，针对肠道屏障功能被认为是干预肝病进展的潜在策略。[16]
紧密连接是调节细胞间通透性的关键结构，[17],[18] 从而维持肠道上皮的完整性并防止腔内抗原转移到固有层。[19] 然而，上皮紧密连接调节肠道-肝脏轴的精确机制仍不完全清楚。肌球蛋白轻链激酶（MLCK）家族是一种丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶，[20] 在多种细胞过程中起着关键作用。先前的研究表明，钙调蛋白（CaM）是通过与其钙调蛋白结合调节域的Ca2+依赖性结合来调节MLCK活性的关键Ca2+传感器。当Ca2+与CaM的四个EF-hand Ca2+结合位点结合时，构象变化促进了Ca2+/CaM与MLCK的钙调蛋白结合域的相互作用，从而激活激酶。[21],[22] 活化的MLCK随后磷酸化肌球蛋白轻链，[23] 诱导肌动蛋白收缩，重组紧密连接蛋白（如Ocludin和ZO-1），最终导致上皮通透性增加。[24] 因此，MLCK是肠道屏障功能的关键调节因子。然而，MLCK介导的渗漏途径是否对肝病有贡献及其潜在机制尚未完全阐明。
我们的研究发现，肠道上皮MLCK的缺失恢复了酒精引起的肠道屏障功能障碍，降低了DCs的抗原呈递能力，减弱了DC-Th17细胞相互作用，并减少了门静脉介导的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和白细胞介素-17A（IL-17A）向肝脏的转移，最终减轻了乙醇引起的肝脏损伤。这项研究揭示了一种新的MLCK介导的途径，通过调节DCs功能影响肠道-肝脏相互作用，不仅加深了对ALD免疫病理学的理解，还确定了该疾病的一个潜在新治疗靶点。

**方法**
Mylk敲除（MylkKO）、Mylkflox/flox（Mylkf/f）和Villin-CA-Mylk（tMylk）Tg（MylkCA）小鼠由杰罗德·R·特纳教授（Brigham and Women's Hospital）提供。Villin-Cre、Alb-Cre和C57BL/6J小鼠（7-8周龄）从GemPharmatech（南京，中国）获取。[25],[26],[27] 通过将Mylkflox/flox小鼠与相应的Cre系杂交，生成了肠道上皮特异性敲除小鼠（MylkΔIEC）和肝细胞特异性敲除小鼠（MylkΔHep）。所有小鼠均具有C57BL/6J背景，以Cre阴性的同窝小鼠作为对照。所有动物实验方案均经过了安徽医科大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的审查和批准（批准号LLSC20252903）。对于ALD模型，8-10周龄的雄性小鼠被喂食Lieber-DeCarli乙醇液体饮食10天，随后单次给予约5克/千克体重的乙醇（体积为20微升/千克体重，使用31.5%（v/v）乙醇）。[28] 对照小鼠接受等热量饮食和麦芽糖-葡聚糖灌胃。小鼠在灌胃后9小时被安乐死，并收集血清和肝组织进行分析。使用雄性小鼠是为了减少激素变异，并确保遗传和机制分析的一致性。

**补充方法**
关于肠道类器官极性反转、肠道类器官屏障完整性评估、悬浮类器官的共聚焦免疫荧光成像、单细胞RNA测序和生物信息学分析、基于非靶向LC-MS的粪便代谢组学分析、使用Luminex检测血清生物标志物、酶联免疫吸附测定（ELISA）、钙蛋白酶活性测定、肠道通透性测定、血清ALT/AST和肝脏TG定量、肠道损伤的组织学评分、组织病理学和免疫组织化学（IHC）、免疫荧光染色（IF）、肠道树突状细胞的体内抗原摄取测定、细胞内钙浓度测量、Caco-2细胞转染、Western blot分析（WB）和实时定量PCR（RT-qPCR）的详细方法见补充材料。

**统计**
数据以平均值±标准误差（SEM）表示。所有数据集均进行了正态性评估。组间比较使用非配对学生t检验（正态分布）或Mann-Whitney U检验（非正态分布）进行。多组比较使用带Welch校正的单因素ANOVA（正态分布）或Kruskal-Wallis检验（非正态分布）进行。统计显著性定义为P < 0.05。所有分析均使用GraphPad Prism（v10.1.1）软件进行。

**结果**
在ALD中，肠道上皮中的MLCK上调。[29] 为了研究ALD中的肠道屏障功能，我们建立了高剂量乙醇摄入的小鼠模型（图S1A-E）。同时，乙醇直接破坏了肠道黏膜的完整性，导致“肠道泄漏”表型（图1A）。我们观察到乙醇对十二指肠的损伤最为严重（图1B）。先前的数据表明MLCK是渗漏途径的关键调节因子。[30] 因此，我们测量了ALD小鼠十二指肠中的MLCK表达。[31] 结果显示，与对照组相比，乙醇暴露后十二指肠中的MLC磷酸化和MLCK表达显著上调（图1C-E和图S1F）。此外，在空肠、回肠和结肠中也观察到pMLC和MLCK的一致性上调（图1D-E）。值得注意的是，MLCK与肠道通透性呈正相关（图1F），表明乙醇可能通过MLCK激活破坏肠道紧密连接和屏障完整性。重要的是，MLCK表达与血清ALT和AST水平以及肝脏TG含量呈正相关（图1F）。总体而言，这些数据表明，肠道上皮MLCK表达的上调与ALD相关。

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**图1. 肠道上皮中MLCK的上调促进了ALD的发病机制。**
(A) 血清荧光素水平表明来自正常喂养和乙醇喂养小鼠的肠道通透性（n = 6）。
(B) 来自正常喂养和乙醇喂养小鼠的十二指肠、空肠、回肠和结肠组织的代表性H&E染色图像。比例尺：100 μm。
(C) 来自正常喂养和乙醇喂养小鼠的十二指肠中pMLC的Western blot（n = 6）。
(D) 来自正常喂养和乙醇喂养小鼠的十二指肠、空肠、回肠和结肠组织的pMLC免疫荧光染色（n = 6）。比例尺：20 μm。
(E) 来自正常喂养和乙醇喂养小鼠的十二指肠、空肠、回肠和结肠组织的MLCK免疫荧光染色（n = 6）。比例尺：20 μm。
(F) 十二指肠组织中Mylk mRNA表达与肠道通透性、血清ALT水平、血清AST水平和肝脏TG水平的相关性分析（n = 6）。数据以平均值±标准误差表示。对于（A）和（C-E），使用双尾非配对学生t检验。对于（F），使用皮尔逊相关系数分析变量之间的线性关系。

**Mylk敲除减轻乙醇引起的肝脏损伤和肠道屏障功能障碍**
为了研究MLCK在ALD进展中的潜在作用，我们使用了全身性Mylk敲除（Mylk KO）小鼠，并让它们摄入乙醇（图S2A）。敲除效率通过qPCR和免疫荧光染色验证（图S2B-C）。乙醇摄入后，MLK敲除显著减轻了乙醇引起的肝脏损伤，并改善了肝脏脂肪变性和脂质代谢紊乱（图2A和图S2D-E）。此外，Mylk敲除显著减少了肝内中性粒细胞浸润（图2A）和炎症细胞因子相关基因的表达（包括Tnf-α、Il-1β和Il-6）（图2B）。

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**图2. Mylk敲除减轻乙醇引起的肝脏损伤和肠道屏障功能障碍。**
(A) 来自Mylk敲除（MylkKO）或未敲除（MylkWT）小鼠喂养乙醇饮食的肝脏组织的H&E、Oil Red O和MPO染色代表图像及相对染色量（n = 6）。比例尺：50 μm。
(B) 来自Mylk敲除（MylkKO）或未敲除（MylkWT）小鼠喂养乙醇饮食的肝脏中Tnf-α、Il-1β和Il-6基因的实时qPCR分析（n = 6）。
(C) 血清荧光素水平表明来自Mylk敲除（MylkKO）或未敲除（MylkWT）小鼠喂养乙醇饮食的肠道通透性（n = 6）。
(D) 来自Mylk敲除（MylkKO）或未敲除（MylkWT）小鼠喂养乙醇饮食的十二指肠的H&E代表图像（n = 6）。比例尺：100 μm。
(E) 来自Mylk敲除（MylkKO）或未敲除（MylkWT）小鼠喂养乙醇饮食的十二指肠中ZO-1、Occludin、F4/80和MPO的免疫荧光染色（n = 6）。比例尺：50 μm。
(F) 来自Mylk敲除（MylkKO）或未敲除（MylkWT）小鼠喂养乙醇饮食的十二指肠中Tnf-α、F4/80和Ly6g基因的实时qPCR分析（n = 6）。数据以平均值±标准误差表示。对于（A-C），使用双尾非配对学生t检验。对于（D-F），使用单因素ANOVA和事后Tukey’s HSD检验。

**进一步研究Mylk敲除对肠道屏障功能的影响**
通过荧光示踪剂灌胃实验，我们发现乙醇摄入显著增加了肠道通透性，而Mylk敲除减轻了这种效应（图2C）。H&E染色进一步证实Mylk敲除改善了十二指肠组织损伤并提高了组织学评分（图2D）。此外，Mylk敲除恢复了乙醇诱导的紧密连接基因Tjp1的下调（图S2F），并有效增加了十二指肠中ZO-1和Occludin的蛋白表达（图2E）。有趣的是，乙醇摄入导致十二指肠中F4/80和MPO的表达升高，而这被Mylk敲除所缓解（图2E-F）。这些数据进一步表明，Mylk通过损害肠道屏障功能促进阿尔茨海默病（ALD）的进展，而其缺失可以减轻十二指肠损伤和炎症，从而减轻酒精引起的肝脏损伤。仅在肠上皮细胞（IEC）中缺乏Mylk，而在肝细胞中不缺乏Mylk，可以减轻小鼠的乙醇（EtOH）诱导的肝脏损伤。为了避免与全身敲除相关的潜在人为效应，我们使用了肠上皮细胞特异性的Mylk敲除小鼠（MylkΔIEC），并在这些小鼠中建立了一个过度饮酒模型（Mylkfl/fl; Villin-cre）（图S3A-D）。与全身敲除小鼠的观察结果一致，MylkΔIEC小鼠在乙醇喂养后表现出较少的肝脏损伤和脂肪变性，这通过降低血浆ALT和AST水平、较低的肝甘油三酯含量以及H&E染色和Oil Red O染色的肝脏切片中改善的组织病理学表现得到证实（图3A-B和图S3E）。此外，MylkΔIEC小鼠中的肝脏炎症基因（Tnf-α、Il-1β和Il-6）的mRNA表达显著下调（图3C），同时肝脏中的MPO阳性细胞浸润也减少（图3B）。为了确定MLCK是否影响酒精代谢，我们测量了关键的酒精代谢酶。结果显示，在乙醇喂养的MylkΔIEC小鼠和Mylkf/f小鼠中，细胞色素P450 2E1（Cyp2E1）、酒精脱氢酶1（Adh1）和酒精脱氢酶2（Adh2）的表达水平相当（图S3F）。

值得注意的是，MylkΔIEC小鼠的酒精引起的绒毛损伤明显减轻，其肠道绒毛结构保持完好（图3D）。紧密连接蛋白的评估显示，与Mylkf/f对照组相比，MylkΔIEC小鼠的ZO-1和Occludin丢失显著减少，表明屏障功能得到增强（图3D和图S3G）。同时，MylkΔIEC还抑制了乙醇诱导的十二指肠中F4/80和MPO的上调（图3D），并减少了炎症基因（Tnf-α、F4/80和Ly6g）的表达（图3E）。此外，与Mylkf/f小鼠相比，MylkΔIEC小鼠显示出Tjp1基因的表达上调和渗透性的降低，从而减轻了肠道屏障的损伤（图3E-F）。值得注意的是，肝细胞特异性Mylk敲除（Mylkfl/fl; Alb-cre）未能改善酒精性肝病（AH）的病理（图S4A-D）。综上所述，这些发现表明从肠上皮细胞中删除Mylk可以防止酒精引起的肠道通透性增加。

在肠上皮细胞中持续激活的Mylk会加剧阿尔茨海默病（ALD）。为了进一步验证肠道MLCK在酒精相关损伤中的致病作用，我们系统地评估了肠上皮细胞特异性持续激活小鼠（MylkCA）的肠道屏障功能和肝脏病理变化（图S5A-D）。与前述敲除实验相反，肠上皮细胞特异性激活的Mylk显著加剧了酒精引起的肠道屏障功能障碍，表现为肠道通透性的显著增加（图4A）。在分子水平上，十二指肠组织中炎症基因（Tnf-α、F4/80和Ly6g）的表达显著上调，而紧密连接蛋白基因Tjp1的表达下调（图4B），表明Mylk的持续激活加剧了肠道炎症并破坏了上皮屏障的完整性。组织学分析进一步证实，MylkCA酒精喂养组的十二指肠中炎症细胞浸润和黏膜结构损伤更为严重（图4C）。免疫荧光和Western blot分析的结果一致，显示该组肠道中紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达显著减少，同时巨噬细胞标记物F4/80和中性粒细胞标记物MPO的表达显著增加（图4C和图S5E）。

MylkCA酒精喂养的小鼠表现出更严重的肝脏损伤，血清ALT、AST和肝甘油三酯水平显著升高（图4D）。与对照组相比，MylkCA组的肝脂肪变性程度增加（图4E）。此外，酒精暴露还增加了总体体重和肝体重比（图4D），这证实了肠上皮细胞特异性激活的MLCK会加剧全身代谢紊乱和肝脏病理。与这些发现一致，中性粒细胞浸润显著加剧，肝脏炎症相关基因（Tnf-α、Il-1β和Il-6）的mRNA表达也显著上调（图4F）。这些结果支持了MLCK在ALD发展中的关键作用。

LPA-LPAR2-Ca2+/CaM信号通路介导MLCK激活和肠道屏障破坏。为了阐明乙醇破坏肠道屏障功能的上游机制，我们对粪便样本进行了非靶向代谢组学分析。主成分分析（PCA）清楚地区分了乙醇喂养组和对照组小鼠（图5A），表明乙醇暴露后肠道代谢景观发生了显著重塑。代谢产物集富集分析（MSEA）显示，与肠道炎症高度相关的甘油磷脂代谢是变化最显著的代谢途径之一（图S6A）。有趣的是，我们观察到乙醇处理组中溶血磷脂酸（LPA）的水平显著增加（图5B-C）。鉴于LPA是已知的细胞骨架重组和钙动员调节因子，我们假设乙醇诱导的LPA产生是一个关键的上游信号，触发MLCK介导的屏障破坏。

LPA主要通过G蛋白偶联受体（LPARs）传递信号。为了确定哪些LPARs介导这种效应，我们检查了据报道在肠上皮细胞中表达的主要受体（LPAR1-3）。RT-qPCR分析显示LPA选择性地上调了LPAR2的表达（图5D），而LPAR1和LPAR3没有显著变化（图S6B）。为了确定LPAR2的功能需求，我们进行了siRNA介导的敲低，并通过RT-qPCR确认了沉默效率（图S6C）。使用Fluo-4 AM进行的流式细胞术分析显示，LPA刺激导致细胞内Ca2+水平显著增加，而在LPAR2敲低后这种增加显著减弱（图5E）。因此，LPA增强了钙调素（CaM）的Ca2+结合形式，而LPAR2敲低则抑制了这种增强（图5F）。这些结果表明LPA通过LPAR2激活Ca2+/CaM信号通路。为了测试LPA是否足以破坏屏障功能，我们使用了顶端向外排列的小鼠肠道类器官（图5G），这是一个生理上相关的模型，可以模拟腔内-上皮界面用于机制研究。在悬浮培养后一天内，类器官就开始表现出顶端极性（图5H）。同时，我们建立了FITC-葡聚糖通透性测定法来定量评估细胞旁通量动态（图5I）。LPA处理显著增加了FITC-葡聚糖的渗透，表明屏障功能受损（图5J）。免疫荧光染色显示，LPA处理的类器官中紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达显著下调，而MLCK的表达增强（图5M-N）。这些发现支持了一种机制途径，即酒精诱导的LPA积累可能通过LPAR2依赖的Ca2+/CaM信号通路发挥作用，导致MLCK激活和紧密连接破坏。对于(E)和(G-I)，我们使用了单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA）并进行了Post-hoc Tukey的HSD检验。为了确定上皮MLCK是否是导致肝毒性的必要因素，我们在WT和MylkCA小鼠中使用了抗CD11c单克隆抗体来耗尽DCs（图S8A）。通过流式细胞术确认了耗尽效率，显示肠道固有层中的CD11c+MHC-II+细胞减少了80%以上（图S8B）。在MylkWT小鼠中，DCs的耗尽显著改善了酒精引起的肝损伤，这体现在血清ALT和AST水平的降低（图6G），以及肝脂肪变性和损伤的减轻（图6H-I）。值得注意的是，DCs的耗尽也减少了MylkCA小鼠中的肝损伤（图6G-I）。综合这些发现表明，上皮MLCK的病理性效应主要通过DCs介导，表明DCs是MLCK驱动的上皮-免疫相互作用中的关键下游效应器。

MLCK通过调控DCs介导的Th17细胞激活来加剧酒精性肝病（ALD）。为了进一步证明屏障功能的破坏会增强DCs对抗原的捕获能力，我们进行了体内抗原追踪实验。通过口服荧光标记的OVA抗原（OVA-AF647），我们直接评估了体内DCs的抗原摄取能力。流式细胞术分析显示，乙醇喂养小鼠的肠道DCs中OVA+ DC的比例显著高于对照组（图7A）。

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图7. MLCK的破坏会损害肠道中的促炎性DC-Th17细胞轴，从而改善酒精诱导的肝病。
(A) 对照组和乙醇喂养小鼠的肠道树突状细胞对OVA-Alexa Fluor 647的摄取情况的流式细胞术分析。
(B) 乙醇-MylkWT组和乙醇-MylkKO组中DCs与CD4+ T细胞之间的相互作用强度。
(C) 乙醇-MylkWT组和乙醇-MylkKO组中DC与Th17细胞之间的配体-受体共表达的细胞间通讯分析。
(D) 十二指肠中Plcb2和Mavs mRNA表达的RT-qPCR测量（n = 6）。
(E-G) 乙醇-MylkΔIEC小鼠与乙醇-Mylkf/f小鼠十二指肠、血清和肝脏中GM-CSF和IL-17A的ELISA检测（n = 6）。
(H-J) 乙醇-MylkWT组和乙醇-MylkCA小鼠十二指肠、血清和肝脏中GM-CSF和IL-17A的ELISA检测（n = 6）。
(K) 人类健康（HC）和酒精性肝病（ALD）样本中的GM-CSF和IL-17A血清水平（HC n = 16；ALD n = 54）。数据以平均值±标准误（SEM）表示。对于(A)和(D-K)，使用了双尾非配对Student’s t检验。

为了进一步研究DCs增强的抗原呈递如何影响肠道免疫和ALD的发展，我们对DCs进行了生物信息学分析。细胞通讯分析显示，酒精刺激增强了DCs与Th17细胞之间的相互作用，而Mylk敲除显著降低了这种相互作用（图7B和图S9A-B）。此外，Mylk缺乏减弱了DCs上的主要组织相容性复合体II类（H2）分子与Th17细胞上的CD4分子之间的相互作用（图7C）。KEGG通路富集分析显示，Th17细胞中下调的基因在多个与免疫和炎症相关的通路中显著富集（图7D和图S9C），这与体内发现一致（图2和图3）。先前的研究表明，DCs可以驱动Th17细胞向致病性Th17细胞转化[43],[44],[45],[46]，这些致病性Th17细胞以产生大量细胞因子（如GM-CSF和IL-17A）为特征，从而促进疾病进展[47],[48]。为了直接验证体内的Th17细胞功能极化，我们进行了肠道CD4+ T细胞的流式细胞术分析，发现酒精暴露增加了致病性Th17细胞（IL-17A+GM-CSF+）的比例，同时减少了非致病性Th17细胞（IL-17A+IL-10+）的比例，而MLCK的破坏逆转了这一变化（图S9D-F）。然后，我们使用qPCR验证了每组小鼠肝脏和十二指肠组织中Csf2（编码GM-CSF的基因）和Il-17a的表达水平（图S9G-H）。我们使用ELISA测量了不同组织中的GM-CSF和IL-17A水平。我们发现，肠道特异性敲除Mylk减少了十二指肠组织（图7E）、门静脉血液（图7F）和肝脏组织（图7G）中的GM-CSF和IL-17A表达，而Mylk的持续激活则增强了它们的表达（图7H-J）。值得注意的是，GM-CSF和IL-17A在人类ALD样本中也上调（图7K）。这些发现表明，肠道产生的GM-CSF和IL-17A可能通过门脉循环到达肝脏，从而导致酒精引起的肝损伤。

总之，我们的数据表明，Mylk敲除减弱了DC-Th17细胞相互作用并减少了致病性Th17细胞的极化。结合我们发现MLCK破坏增强了肠道屏障完整性（图2、图3、图4），这些结果支持了一个模型，即上皮MLCK通过促进紧密连接功能障碍后的DCs介导的Th17细胞激活来驱动ALD。

在本研究中，我们确定肠道上皮MLCK是一个核心调节因子，它整合了ALD中的屏障完整性和免疫激活。使用全身性和上皮特异性的遗传模型，我们显示酒精暴露显著上调了十二指肠上皮中的MLCK表达，导致紧密连接破坏、肠道通透性增加和肝损伤加重。Mylk缺乏有效地防止了这些病理变化，而肠道上皮特异性持续的MLCK激活则加剧了脂肪变性、炎症和中性粒细胞浸润。这些发现提供了体内证据，表明上皮MLCK的激活对于驱动ALD中的肠道屏障失败和肝损伤是必要且充分的。尽管Chen等人已经确定MLCK是将肠道炎症与ALD联系起来的中介因子，但他们的工作依赖于全身的Mylk敲除模型[49]。本研究通过特异性操纵IECs中的MLCK表达，提供了直接证据，表明上皮MLCK的激活本身足以驱动酒精引起的肠道屏障破坏和肝损伤。我们证明了酒精暴露上调了肠道上皮中的MLCK表达，特别是在十二指肠中，这与肠道通透性的增加和肝损伤标志物增加相关。重要的是，使用顶端向外的肠道类器官模型，我们观察到在LPA刺激下MLCK转移到紧密连接区域，这种定位模式是其调节屏障功能所必需的[50]。在基础条件下，尽管MLCK有表达，但它主要位于细胞质中，不影响通透性。酒精及其代谢物（如乙醛）通过破坏紧密连接来破坏黏膜完整性，导致“肠道渗漏”[51]。在ALD中，紧密连接蛋白Occludin和ZO-1显著减少，表明屏障功能障碍是最早的病理事件之一。使用全身性和IECs特异性的Mylk敲除模型，我们证实MLCK缺乏可以防止酒精引起的肠道屏障功能障碍和肝损伤，而肠道上皮特异性持续的MLCK激活则加剧了脂肪变性、炎症和中性粒细胞浸润。这些发现牢固地确立了肠道MLCK作为ALD发病机制的关键调节因子。

我们的发现确定LPA是将酒精诱导的代谢重塑与肠道屏障功能障碍联系起来的关键代谢中介因子。Yu等人之前的工作表明，LPA信号失调会通过破坏紧密连接组织来破坏肠道上皮完整性[52]。在此基础上，我们的研究将LPA的作用扩展到与酒精相关的环境中，揭示LPA直接激活了肠道上皮细胞中的MLCK/MLC通路。机制上，我们进一步证明这种效应是通过LPA-LPAR2-Ca2+/CaM信号级联介导的，因为LPA刺激导致细胞内Ca2+迅速升高，而LPAR2敲低显著减弱了Ca2+反应和下游MLCK激活。这种激活诱导了细胞骨架收缩和ZO-1相关的紧密连接解体，最终导致细胞间通透性增加。这些观察不仅提供了连接酒精诱导的代谢变化与上皮屏障破坏的机械桥梁，还表明LPA-MLCK信号代表了一个共同轴，通过该轴，包括酒精暴露在内的多种代谢损伤会破坏肠道-肝脏稳态。这项工作的关键概念进展在于阐明了上皮屏障破坏如何重塑肠道先天免疫。通过单细胞转录组学和功能验证，我们发现MLCK依赖的紧密连接破坏增强了DCs对腔内抗原的接触。为了直接测试这一点，我们使用了OVA-AF647进行了体内抗原追踪，证实酒精喂养小鼠中的DCs增强了抗原摄取。此外，我们证明酒精诱导的DC-Th17细胞相互作用的增强严格依赖于MLCK活性。对Th17细胞异质性的更严格分析显示，酒精喂养优先扩增了致病性（IL-17A+GM-CSF+）Th17细胞，同时减少了非致病性（IL-17A+IL-10+）亚群，这两者都依赖于MLCK。Mylk敲除显著减弱了这种相互作用，并减少了GM-CSF和IL-17A向肝脏的转运，从而减轻了肝炎症。这些发现将MLCK置于上皮完整性和适应性免疫极化的交汇点，说明了局部屏障失败如何通过DC介导的T细胞指令转化为全身性炎症反应。

然而，仍存在一些问题。例如，虽然我们证明了Th17来源的细胞因子可以通过门脉循环直接转移到肝脏，我们也观察到酒精喂养在肝脏本身上调了IL-17和GM-CSF的转录。这表明存在一个额外的间接途径：穿透受损屏障的肠道来源的微生物产物可能会激活肝脏的先天免疫细胞，从而在局部上调Th17相关细胞因子[50]。Zeng等人证明酒精诱导白色念珠菌特异性Th17细胞从肠道迁移到肝脏，在那里它们通过IL-17-Kupffer细胞轴加剧了ALD[53]。在MLCK缺失的情况下，改善的屏障功能减少了这些微生物配体的转运，从而减少了肝细胞因子的基因表达。其次，其他破坏屏障的代谢物或细菌成分是否也通过MLCK影响DC功能，值得进一步研究。MLCK抑制作为治疗人类ALD的潜在方法也值得临床评估。

总之，我们的发现确定了MLCK是协调肠道-肝脏通信的核心调节因子，它控制抗原的接触和DCs的激活，从而塑造了肠道免疫景观并决定了酒精引起的肝损伤的严重程度。重要的是，我们确定了LPA是一个关键的上游信号，它激活MLCK并调节酒精反应下的肠道通透性。我们的数据进一步定义了一个完整的LPA-LPAR2-Ca2+-MLCK信号轴，并通过增强DCs的抗原摄取、提高T细胞的启动能力和偏向致病性Th17细胞反应来展示其功能后果。针对上皮-免疫轴，包括LPA-MLCK信号，可能为ALD和其他与屏障相关的炎症性疾病提供新的治疗机会。

作者贡献：J.W. L.X.和X.W.设计了实验、分析了数据并撰写了手稿。L.X.、S.T.、S.W.、Y.L.和J.Z.进行了实验。J.Z.、J.Z.、J.W.、J.Z.、Z.Z.、J.H.、L.Q.、W.H.和R.H.协助了数据分析；Y.H.提供了单细胞测序的生物信息学分析。J.T.提供了小鼠。H.S.和M.W.提供了想法并修订了手稿。L.Z.和H.W.监督了项目并修订了手稿。所有作者都解释了数据，审核并修订了手稿草稿，并批准了最终的手稿提交。

数据可用性声明：小鼠scRNA-seq数据已上传至Zenodo（https://doi.org/10.5281/zenodo.18212354）。本研究中使用和/或分析的其他数据集可以在合理请求下从相应作者处获得。本研究没有报告原始代码。

财务支持声明：本工作得到了中国科学技术部（MOST）国家重点研发计划（资助编号2023YFA1800800和2024ZD0530600）、深圳市医学研究基金（资助编号B2302007）、国家自然科学基金（资助编号82225008、U21A20375、U24A20674、82270589）、安徽省自然科学基金（资助编号2022AH010047、2023AH020034）、安徽省博士后科学研究计划基金（资助编号2025A1009）、安徽医科大学的资助（资助编号2023xkjT008）、以及安徽医科大学的博士和硕士项目（资助编号YJS20230111、YJS20240042、YJS20240062和YJS20240084）的支持。