转录组研究的新起点：解码导致斑秃与慢性炎症性皮肤疾病相互关联的基因与信号通路

《JID Innovations》：Transcriptomic Crossroads: Decoding Genes and Pathways that Connect Alopecia Areata with Chronic Inflammatory Skin Disorders

　　哈迪斯·阿卜杜拉扎德（Hadis Abdolahzadeh）、萨布丽娜·亨内（Sabrina Henne）、阿米尔·莫克莱西（Amir Mokhlesi）、约尔格·文泽尔（J?rg Wenzel）、斯特凡妮·海尔曼-海姆巴赫（Stefanie Heilmann-Heimbach）、雷吉娜·C·贝茨（Regina C. Betz）和F·布克特·巴斯马纳夫（F. Buket Basmanav）来自德国波恩大学医学学院和大学医院的人类遗传学研究所。

**摘要**
斑秃（Alopecia areata，AA）是一种免疫介导的脱发疾病，常与慢性炎症性皮肤病（CISDs）如特应性皮炎（Atopic dermatitis，AD）、白癜风（Vitiligo）和银屑病（Psoriasis，PSO）同时发生。新证据表明，这种共病模式代表了具有不同病因基础的临床亚型。然而，由于缺乏来自共病患者群体的分子数据集，对其机制的理解仍然有限。在本研究中，我们利用公开可用的斑秃、AD、白癜风和PSO的病例对照基因表达数据集进行了综合分析。我们的结果发现，斑秃与其他CISDs的基因表达谱存在统计学上的显著重叠，这表明它们之间的共病并非偶然现象。进一步分析显示，儿茶酚胺信号传导和毛发/皮肤色素沉着相关过程可能是斑秃与白癜风共同发展的驱动因素，而皮肤屏障缺陷和特定免疫反应通路的失调可能是斑秃与AD或PSO共病的机制基础。本研究为未来探索皮肤、毛囊和免疫系统相互作用在驱动不同亚型斑秃中的作用提供了基础。

**引言**
斑秃是一种常见的自身免疫性脱发疾病（终生发病率约为2%），影响所有年龄和性别的个体（Pratt等人，2017年；Villasante Fricke和Miteva，2015年）。其临床过程变化很大且难以预测。一些患者经历一次脱发后自发缓解，而另一些患者则可能持续脱发且无法恢复。在大多数情况下，该病表现为复发-缓解的过程，复发 episodes 的严重程度和持续时间各不相同（Lintzeri等人，2022年；Tosti，2023年）。脱发的范围可以从一个明确的斑块到多个斑块不等，严重情况下可能导致头皮全部脱发（全秃，alopecia totalis）或全身脱发（普秃，alopecia universalis）。

流行病学研究表明，斑秃与多种慢性炎症性皮肤病（CISDs）有很强的临床关联，尤其是特应性皮炎（AD）、白癜风（Vitiligo）和银屑病（PSO）（Holmes等人，2023年；Kridin等人，2020年；Lee等人，2019年；Ly等人，2023年；Mohan和Silverberg，2015年）。Friedrich等人在一个中欧队列中表明，26.7%、4.6%和2.7%的斑秃患者分别报告合并AD、白癜风或PSO（Friedrich等人，2025年）。重要的是，研究发现，合并AD的斑秃患者早期出现严重和长期脱发的风险显著增加，而合并白癜风的斑秃患者则表现出较低的长期脱发风险。这些发现以及其他研究的结果（Goh等人，2006年；Kageyama等人，2021年）表明，斑秃的共病表现可能代表临床不同的亚型，每种亚型可能有独特的病因和病理生物学基础。然而，由于缺乏根据共病特征分层的患者群体中的分子和细胞数据，对这些机制的理解进展受阻。

在本研究中，我们通过比较分析公开可用的斑秃、AD、PSO和白癜风的病例对照基因表达数据集来填补这一知识空白。这种综合方法使我们能够识别出共同的分子特征，从而揭示可能导致斑秃与特定CISDs共病的生物学途径。我们的发现为更精细的斑秃亚型分子分类提供了基础，并为未来的机制研究指明了方向。

**结果**
在斑秃（AA）、白癜风（Vitiligo）、银屑病（PSO）和特应性皮炎（AD）中分别鉴定了2106个、257个、391个和183个差异表达基因（DEGs）（图1）。我们没有发现跨所有表型的DEGs重叠（图2a）。在三种表型中共有的35个DEGs中，32个同时存在于AA、AD和PSO中，2个同时存在于AA、Vitiligo和PSO中，1个同时存在于AD、Vitiligo和PSO中（图2a）。针对表型对的富集分析显示，AA与每种CISD之间的DEGs有显著重叠，其中与AD的重叠最强（FDR=0.0006，OR=2.01），其次是Vitiligo（FDR=0.0007，OR=1.88）和PSO（FDR=0.0017，OR=1.60）（图2b，表S1），表明这些共病现象并非偶然。AD和PSO也显示出显著的DEGs重叠，而Vitiligo与AD或PSO之间没有显著的DEGs重叠（表S1）。

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**图1.** 斑秃（AA）、白癜风（Vitiligo）、银屑病（PSO）和特应性皮炎（AD）中差异表达基因的鉴定。火山图显示了病例组和健康对照组病变皮肤活检中的上调和下调基因。

**图2.** 四种表型之间的分子特征共享评估。
- （a）四种表型之间重叠的DEGs数量；
- （b）通过Benjamini-Hochberg假发现率（FDR）校正多重检验后，确定AA与Vitiligo、PSO或AD之间观察到的DEGs重叠是否具有统计学意义。Vitiligo、PSO和AD之间DEGs重叠的富集结果见表S1。

**AA_vitiligo**中 gemeinsam 的DEGs显著富集在多个生物学过程中，包括上皮细胞凋亡过程的负调控、对儿茶酚胺或胰岛素刺激的细胞反应、SNARE复合体组装、胞吐作用的负调控、活性氧（ROS）生物合成过程的调控、参与细胞周期和增殖的MITF-M依赖性基因的调控以及细胞内受体的SUMO化（图3a）。值得注意的是，AA或Vitiligo的单个DEGs中没有发现这些过程的显著富集（图3a）。AA_vitiligo gemeinsam 的DEGs以及Vitiligo的个别DEGs还富集与头发颜色/色素沉着相关的人类表型本体，如蓝色虹膜、眼白化、虹膜色素减退、前额白发和斑状色素减退（图6a）。另一方面，AA的个别DEGs显著富集与头发结构和生长相关的人类表型本体，如生长速率异常、生长缓慢的头发、羊毛状头发和脆弱的头发（图6a）。根据AA_vitiligo gemeinsam DEGs的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）映射确定的十个枢纽基因包括LEF1、MITF、NR1D1、CAST、SNCA、DCT、L1CAM、CIART、SLC45A2和SOX10（图3b），与这些基因相互作用最频繁的转录因子（TFs）分别是AR、MYC和STAT3，分别调控九个、七个和六个AA_vitiligo枢纽基因的表达（图3b）。连接这些基因最多的微RNA（miRNAs）是hsa-miR-18a-5p和hsa-miR-34a-5p（图3c），它们各自调控八个AA_vitiligo枢纽基因的表达。

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**图3.** 连接斑秃（AA）和白癜风（Vitiligo）的通路、生物学过程和调控网络。
- （a）左侧列显示AA个别DEGs、Vitiligo个别DEGs及其共同DEGs的基因集富集分析；
- （b）右侧和中间列分别显示基于AA_vitiligo共同DEGs的PPI网络及其与TFs相互作用的AA_vitiligo枢纽基因；
- （c）根据每个miRNA调控的枢纽基因数量显示抑制AA_vitiligo枢纽基因的miRNAs。

**图4.** 连接斑秃（AA）和银屑病（PSO）的通路、生物学过程和调控网络。
- （a）左侧列显示AA个别DEGs、PSO个别DEGs及其共同DEGs的基因集富集分析；
- （b）基于AA_PSO共同DEGs的PPI网络及其与TFs相互作用的AA_PSO枢纽基因；
- （c）根据每个miRNA调控的枢纽基因数量显示抑制AA_PSO枢纽基因的miRNAs。

**图5.** 连接斑秃（AA）和AD的通路、生物学过程和调控网络。
- （a）左侧列显示AA个别DEGs、AD个别DEGs及其共同DEGs的基因集富集分析；
- （b）基于AA_PSO共同DEGs的PPI网络及其与TFs相互作用的AA_PSO枢纽基因；
- （c）根据每个miRNA调控的枢纽基因数量显示抑制AA_PSO枢纽基因的miRNAs。

**图6.** 人类表型本体分析。
- 左侧列显示AA个别DEGs以及三种选定共病CISDs（Vitiligo、PSO、AD）的个别DEGs及其共同DEGs的人类表型本体分析。
- （a）AA_Vitiligo；
- （b）AA_PSO；
- （c）AA_AD。

**AA_PSO**中 gemeinsam 的DEGs显著富集在白细胞介素-27（IL-27）介导的信号通路、中间丝组织、角质化以及角质化包膜的形成（图4a）。个别AA或PSO DEGs也显示出这些过程的显著富集。从AA_PSO共同DEGs的PPI映射中检索出的前十个枢纽基因包括CTSB、STAT1、SERPINA1、IL1B、CXCL9、CASP1、GAPDH、MX1和OASL（图4b）。与这些基因相互作用最多的调节元件是EGR1（作为TF，调控八个AA_PSO枢纽基因的表达）、hsa-miR-26a-5p和hsa-miR-26b-5p（作为miRNAs，调控九个AA_PSO枢纽基因的表达）。

**讨论**
本研究进行了比较转录组分析，并对AA与其他CISDs（包括AD、Vitiligo和PSO）之间共享的DEGs进行了后续研究，旨在识别可能导致斑秃与这些疾病共病的共同分子特征和生物学通路。我们的结果揭示了一个明显的模式：在AA_vitiligo组合中，与末端组织相关的因素（即与皮肤和毛囊生物学相关的细胞过程）的收敛性更强，而在AA_AD和AA_PSO组合中则不明显。这一点尤其明显，因为在AA_vitiligo gemeinsam DEGs或其PPI网络中识别的枢纽基因中，没有显著的免疫反应相关注释富集。相比之下，许多从AA_AD和AA_PSO gemeinsam DEGs中获得的显著富集注释和枢纽基因与免疫相关过程相关。

在AA_vitiligo gemeinsam DEGs中，出现了几个有趣的显著富集注释，这些注释彼此相关。其中四个与儿茶酚胺信号传导、ROS生物合成过程的调控、上皮细胞凋亡过程的调控以及参与细胞周期和增殖的MITF-M依赖性基因的调控有关。儿茶酚胺通过两种关键机制参与斑秃和白癜风的病理生物学：它们可以诱导氧化应激并调节心理压力对皮肤和毛囊的影响（Matarrese等人，2024年；O'Sullivan等人，2022年）。这两个因素都被认为是银屑病（AA）和白癜风（vitiligo）发病的潜在触发因素，部分原因是它们对细胞凋亡和细胞调控途径的影响。值得注意的是，急性应激介质去甲肾上腺素（norepinephrine）和多巴胺（dopamine）已被证明可以影响毛囊周期，而去甲肾上腺素的突然释放会导致毛囊内的黑色素细胞干细胞耗尽（O'Sullivan等人，2022年；Rachmin等人，2021年）。另一组值得注意的注释涉及SNARE复合体的组装和外泌作用的负调控，这突显了囊泡介导的黑色素体从黑色素细胞向角质形成细胞转移过程中的潜在失调，这是皮肤和头发色素沉着的关键最后一步。两个在AA和vitiligo中共同出现的差异表达基因（DEGs）是STXBP6和SNCA（后者也被鉴定为一个枢纽基因），分别编码syntaxin结合蛋白6和α-突触核蛋白（alpha-synuclein），它们直接参与这一过程。具体来说，STXBP6是SNARE复合体组装的负调节因子，从而影响囊泡运输；而在人类表皮黑色素细胞中敲低SNCA会改变黑色素细胞的形态，并导致协同培养中黑色素体向角质形成细胞的转移减少（Rachinger等人，2022年）。进一步支持色素沉着途径的相关性的是，AA和vitiligo的共同DEGs在与头发颜色和色素沉着相关的人类表型本体中富集，同时几个其他枢纽基因，如MITF、DCT、LEF1和SLC45A2，这些基因都已知与黑色素细胞生物学有关，并且通过全基因组关联研究（GWAS Catalog，https://www.ebi.ac.uk/gwas/）与头发颜色特征相关联。综上所述，这些发现支持了先前关于AA与色素沉着特征之间病因学联系的假设（Messenger和Bleehen，1984年；Ortonne和Jeune，1978年；Xie等人，2022年；Yousaf等人，2021年），并表明表皮和毛囊黑色素细胞以及/或角质形成细胞中与色素沉着相关的过程的共同失调可能是AA和vitiligo共病的机制基础。我们还观察到一个有趣的现象，即SOX10成为AA和vitiligo对中的顶级枢纽基因，它直接与其他五个枢纽基因相互作用（图3b）。SOX10是调控黑色素细胞发育和分化的关键转录因子（TF）。先前的研究（Hedstrand等人，2001年）将SOX10和SOX9确定为可能驱动1型自身免疫多内分泌综合征（APS 1）中白癜风发展的自身抗原。这种单基因疾病由AIRE变异引起，涉及器官特异性（多）自身免疫，约30%的患者会发展为AA（Collins等人，2006年）。作者发现，在19名患有白癜风的APS I患者中，12名（63%）同时患有AA，其中9名（75%）的血清中检测到SOX10抗体阳性。值得注意的是，对SOX9和SOX10的血清反应性与AA和vitiligo的共病有关，而与单独的AA无关（Hedstrand等人，2001年）。因此，我们假设至少在某些患者中，AA和vitiligo的共病可能具有经典的自身免疫病因学基础，即SOX9和/或SOX10是同时针对表皮和毛囊黑色素细胞的共同自身抗原。这一假设可以与之前发表的令人信服的组织化学图像相符，该图像显示了病变AA毛囊中的CD8+ T淋巴细胞与毛囊黑色素细胞之间的直接相互作用（Bertolini等人，2017年），并需要通过机制研究进一步探索。此外，沿着这一线索的另一个有趣观察是STAT3作为转录因子枢纽基因交互网络中的关键调控节点的出现。STAT3的杂合功能获得变异已知会导致多系统自身免疫，影响多个器官系统（Flanagan等人，2014年）；我们观察到，在我们的研究中，STAT3直接调控六个AA和vitiligo枢纽基因的表达。在AA_PSO中共同发现的DEGs在四个注释中显著富集，其中IL-27介导的信号传导尤其引人注目。根据不同的背景，IL-27既可以作为促炎细胞因子，也可以作为抗炎细胞因子（Xu等人，2024年），而且它之前并未与AA的病理生物学相关联。值得注意的是，IL-27促进IFN-γ的产生，并支持Th1免疫反应，这是AA的已知驱动因素。同时，它抑制Th17免疫轴（Xu等人，2024年），而Th17免疫轴是PSO病理发生的关键。这表明IL-27信号传导的失调可能是AA与特定Th1主导型的PSO共病的基础，而不是典型的Th17驱动型。或者，IL-27介导的Th1和Th17反应之间的转换可能导致Renb?k现象，这是一种临床观察，即一种疾病在同一解剖部位抑制另一种疾病的发展。此外，我们观察到CASP1（NLRP3炎性小体的核心成分）和IL1β（炎性小体激活的关键下游效应物）也是AA_PSO枢纽基因之一（Fetter等人，2023年）。这一发现提示炎性小体的激活可能在AA和PSO的共病发展中起作用，需要通过机制研究进一步调查。在AA_AD中共同发现的DEGs在与免疫反应和皮肤生物学相关的途径和生物过程中显著富集。在枢纽基因中，MX1在早期抗病毒防御中起作用，C1QB是经典补体途径的成分，这表明先天免疫系统的参与。同时，适应性免疫反应的成分也通过HLA-DRA和HLA-DPA1（参与抗原呈递的MHC II类分子）以及LCK（编码对T细胞受体信号传导至关重要的酪氨酸激酶）的鉴定而被涉及。值得注意的是，只有一个枢纽基因CCL18直接与Th2免疫轴相关，而Th2免疫轴通常与AD相关。相反，PSMB9、IRF1、MX1、CXCL9和两个HLA-D基因的存在表明了一种以IFN-γ为主的免疫环境，这与这种共病特征中的Th1偏倚免疫激活一致。这一观察与先前关于Th1在特定AD亚型中发挥作用的见解相符。特别是Kageyama等人（Kageyama等人，2021年）的研究表明，同时患有AA和AD的患者的免疫特征因AD亚型而异——内在型AD表现为正常的IgE水平和对屏障功能障碍的影响较小，倾向于Th1主导的反应，而外在型AD则通常以Th2为主。因此，我们的转录组数据分析结果可能反映了具有内在型AD的AA的特定共病特征，表现为更强的Th1免疫特征。本研究存在两个主要限制。首先，分析数据集中临床元数据（包括年龄、性别、疾病严重程度和种族背景）的不完整性和非均匀性限制了对潜在混杂变量的系统性评估，可能会影响 findings 在不同人群中的普适性。其次，由于缺乏共病患者组和适当匹配的健康对照组的病变皮肤活检样本，因此无法对鉴定出的枢纽基因和途径进行实验验证。通过使用表型明确的队列进行前瞻性研究来解决这些限制对于未来的机制研究至关重要。尽管存在这些限制，我们应用的保守分析框架已经证明，AA与其他CISDs之间的共病并非偶然，而是涉及重叠的病理生物学过程。虽然AA和vitiligo的共病发展可能更多归因于内在的皮肤/毛囊因素，而不是系统性免疫反应的失调，但两者都参与了AA与AD或PSO之间的共病。我们的发现为基于其与不同CISDs的共同共病表现对AA亚型进行更精细的分类提供了基础，并为未来的机制研究指明了方向。

**材料与方法**

**微阵列数据和基因表达特征的识别**
来自Gene Expression Omnibus (GEO, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) 的AA（GSE68801）、vitiligo（GSE65127）、PSO（GSE63741；JW自有数据）和AD（GSE63741；JW自有数据）的病例对照、基于微阵列的转录组数据集被检索（表1）。原始研究分别在美国、法国和德国进行，所有研究都表明，皮肤活检样本来自采样时临床活动性疾病的患者。为了识别每种表型特有的基因特征（即DEGs），首先使用R语言中的limma包单独分析数据集。AA数据集是在六个微阵列批次中生成的；因此，微阵列批次被作为差异表达分析的协变量纳入考虑。其余数据集未报告批次结构。DEGs的定义是基于调整后的p值<0.05和|log FC| ≥ 0.58（图1）。确定了跨表型的DEG重叠，即共同的DEGs（图2a），并使用单侧Fisher精确检验进行统计显著性评估（图2b，表S1）。使用Benjamini–Hochberg程序对多重检验进行富集p值校正，该程序应用于所有成对比较（n = 6），并以假发现率（FDRs）的形式报告（图2b和表S1）。为了考虑微阵列基因覆盖率的差异，使用特定于比较的背景基因集进行了交叉配对富集分析。GSE63741数据集使用PIQOR? Skin 2.0 Microarray生成，该微阵列针对预定义的一组转录本（N = 1,557），而GSE68801和GSE65127使用具有更广泛基因覆盖范围的通用微阵列平台生成（N = 22,834）。对于每个疾病交叉比较，背景基因定义为两个微阵列平台上检测到的基因的交集，从而将富集分析限制在两个数据集中都能检测到的基因上。

**基因本体和功能富集分析**
对于共同的和单独的DEGs，使用Enrichr web工具（http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/）进行了Reactome途径富集、基因本体（GO）和人类表型本体分析。对于疾病对中共同DEGs的基因本体和功能富集分析，背景基因集定义为两个比较数据集中检测到的基因的交集。对于单独（疾病特异性）DEGs的富集分析，背景基因集包括在相应微阵列平台上检测到的所有基因。使用Benjamini–Hochberg程序对多重检验进行富集p值校正，该程序应用于所有分析的注释数据库。

**蛋白质-蛋白质相互作用网络构建和分析**
在基因水平上，通过检查相应共同DEGs的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，进一步研究了AA与每个选定的共病CISD之间的关联。PPI网络在STRING（https://string-db.org/）中构建，并使用Cytoscape 3.10.1的cytoHubba插件进行分析和可视化。对于每个组合（即AA_vitiligo、AA_AD和AA_PSO），使用度中心性确定了前10个枢纽节点。当MCC不具有区分性时，还应用了边缘渗透组件（EPC）作为额外的标准。

**转录因子和microRNA的识别**
从PPI网络中检索到的枢纽基因被用作输入，以构建转录因子（TF）-枢纽基因和microRNA-枢纽基因调控网络，描绘枢纽基因表达的主要调控元素。在这里，使用NetworkAnalyst 3.0（Xia等人，2014）中的CHEA3来识别TF-枢纽基因相互作用，使用TarBase v9.0检索microRNA-枢纽基因相互作用。构建网络后，使用基于度的方法进行了网络分析，以确定核心TFs和microRNAs。