针对具有免疫耐受性的HLA-G基因型，以应对HBV相关肝细胞癌（HCC）中的免疫逃逸和适应性抵抗力

《JHEP Reports》：Targeting a tolerogenic HLA-G genotype to tackle immune evasion and adaptive resistance in HBV-driven HCC

　　雅妮娜·卡赫（Janine Kah）|丽莎·斯塔费尔特（Lisa Staffeldt）|斯文娅·斯特凡斯基（Svenja Stefanski）|娜塔莉·赫尔佐格（Nathalie Herzog）|格雷戈尔·马特尔特（Gregor Mattert）|塔西洛·沃尔茨（Tassilo Volz）|马克西米利安·沃斯（Maximilian Vo?）|科尔内利乌斯·舒尔ze（Kornelius Schulze）|阿斯穆斯·霍伊曼（Asmus Heumann）|维尔纳·达默曼（Werner Dammermann）|莎拉·卡默勒（Sarah Kammerer）|扬-海纳·库珀（Jan-Heiner Küpper）|帕布洛·维利亚维森西奥-洛里尼（Pablo Villavicencio-Lorini）|莫拉·丹德里（Maura Dandri）|斯特凡·吕特（Stefan Lüth）

德国汉堡大学医学中心埃彭多夫分校（University Medical Center Hamburg-Eppendorf）内科

摘要

背景

乙型肝炎病毒（HBV）相关的肝细胞癌（HCC）具有免疫逃逸特性，并且对免疫疗法的反应存在异质性。然而，驱动肿瘤免疫耐受的机制及其对基于检查点抑制剂（checkpoint inhibitors）的治疗的影响仍不甚明了。为了解决这一难题，我们建立了一种由患者来源的HBV诱导的HCC细胞系，该细胞系保留了通过HLA-G表达介导的临床相关免疫逃逸机制。

方法

对两个空间分离的肿瘤区域进行了全外显子组测序（Whole-exome sequencing, WES），重点关注HLA-G基因座。使用Upcyte?技术对患者来源的肿瘤细胞进行了改造，从而生成了up-LC14A1细胞系。分子分层包括内部的HCC队列（n=13）、健康捐赠者（n=4）、早期肝病患者的血清样本（n=4）、确诊的HCC患者（n=10）以及全球数据集（TCGA活检样本（n=24）；HCC（n=120）。功能表征包括NK92共培养实验（1:1、1:5、1:10）和在小鼠体内的原位移植（HUH7（n=3）、Hep3B（n=4）、HepG2H1.3（n=4）、up-LC14A1（n=14））。

结果

WES显示，该HCC携带与免疫耐受相关的HLA-G 3′UTR单倍型。队列分层证实患者#14的 soluble HLA-G水平升高。衍生的up-LC14A1细胞系保留了肝胆和病毒特征，并表现出低水平的HBV DNA产生和稳定的增殖能力。转录组分析将up-LC14A1定位在HCC谱系中。在体内，原位移植产生了结构化的肝肿瘤，并且比永生化HCC细胞系具有更长的生存期。up-LC14A1通过动态调节HLA-G来抵抗NK92的细胞毒性，而HLA-G的沉默则恢复了免疫杀伤作用并诱导了PD-L1的表达。

结论

up-LC14A1模型代表了一个由患者来源的HBV-HCC系统，能够捕捉到克隆稳定但动态调控的HLA-G介导的免疫耐受状态。这一平台有助于机制研究免疫逃逸机制，并为测试HBV相关HCC的靶向免疫疗法提供了转化模型。

影响与意义

乙型肝炎病毒（HBV）相关的肝细胞癌（HCC）具有显著的免疫逃逸能力，且对免疫疗法的反应不足。尽管如此，模拟病毒持续存在和肿瘤抵抗的临床前模型仍较为缺乏。免疫调节分子HLA-G由于其直接抑制T细胞和NK细胞的能力，已成为HCC免疫疗法的强大靶点。在此，我们建立了一种新的由患者来源的HBV-HCC细胞系（up-LC14A1），该细胞系通过HLA-G上调来介导免疫逃逸。

引言

肝细胞癌（HCC）占原发性肝癌的90%以上，仍然是全球范围内的健康负担，慢性HBV感染是主要的致病因素（1）。尽管在HCC的分子和免疫学理解方面取得了进展，但由于诊断延迟、复发率上升以及治疗后的耐药性发展，治疗的完全反应率仍然有限（2）。HCC的免疫抑制性质复杂，受到病毒因素、慢性炎症和纤维化的影晌，这使得寻找广泛有效的治疗策略变得困难（3）。值得注意的是，随着索拉非尼（Sorafenib）的出现以及几种其他治疗方案的批准，包括酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）和免疫检查点抑制剂（ICIs），HCC的治疗取得了进展（4, 5）。然而，联合使用TKI-ICI或ICI-ICI治疗后的客观反应率（ORR）仍然不令人满意（3）。此外，出现耐药性的患者可能会出现进行性复发，导致更严重的临床状况。为了改善这些难治性患者的预后，评估新的靶点以管理耐药性及其在治疗过程中的发展是必要的。

在HCC中调控的多种免疫逃逸机制中，非经典MHC I类分子HLA-G在50%的原发性HCC中存在（6），已成为一个强有力的免疫检查点（7）。与PD-L1不同，HLA-G通过不同的途径介导免疫抑制，抑制细胞毒性T细胞和NK细胞，促进耐受性树突状细胞的生成，并促进调节性T细胞的扩增（7）。膜结合型和非膜结合型HLA-G（sHLA-G）的表达升高与肿瘤进展、高复发率和对ICI治疗的耐药性有关（6, 8, 9）。在HBV感染的情况下，HLA-G稳定性的功能性抑制剂miR-152的水平降低，导致在活跃感染期间免疫耐受分子的过度表达（10）。此外，HLA-G基因的遗传多态性与HBV感染的易感性增加有关（11）。HLA-G的整体免疫调节特性使其成为免疫疗法后的一个有趣靶点，特别是在病毒引起的HCC中，因为它可以诱导耐药机制。由于常用的永生化HCC细胞系无法处理功能性免疫调节蛋白（www.proteinatlas.org），即使它们能够合成HLA-G mRNA [6]，因此基因改造的细胞系仍然是阐明HLA-G介导的免疫耐受的金标准。在这方面，目前缺乏适合研究动态免疫耐受途径及其导致表型适应的模型。在此，我们建立了一种由患者来源的HBV-HCC模型，展示了HLA-G介导的免疫耐受的动态过程。该模型的优势在于其在体内的低进展率，使其能够进行原位移植，并保留了原始的肿瘤特征。该模型是由一位HLA-A*03:01P、*30:01P HBV阳性个体的材料生成的，该个体患有混合肝细胞（70%）和胆管细胞（30%）癌。该患者最初接受了核苷类似物（替诺福韦）治疗，随后在复发后接受了阿特珠单抗（Atezolizumab）和贝伐单抗（Bevacizumab）治疗，但疾病迅速进展，并在切除后18个月去世。我们从肿瘤中心材料中提取了具有增殖能力的原发性肝癌细胞（LC14），然后使用Upcyte?技术对其进行基因改造，以实现长期培养和持续增殖（命名为up-LC14A1）。预测性转录组分类将up-LC14A1细胞与HBV复制的HepG2H1.3细胞归为一类，表明病毒相关的分子特征得到保留。通路富集和疾病关联分析证实其与肝癌特征高度一致，同时我们证明up-LC14A1细胞在体和体外均保持了患者的特征和动态的HLA-G表达。

方法

研究批准、人体材料和动物实验

人体组织和血液的收集、处理、保存及伦理审批均按照先前的描述进行（12, 13），具体流程列于表S1中。患者和健康捐赠者来源的组织和血细胞的HLA-A分型也按照先前的描述进行（12）。该研究获得了汉堡医事会（?rztekammer Hamburg）的伦理审查委员会批准（PV-3578），并遵循国家指南和1975年赫尔辛基宣言（1975 Declaration of Helsinki）进行。动物实验按照欧洲共同体委员会指令（86/EEC）进行，并得到了德国汉堡市的批准（N056/2020）。小鼠的生成、繁殖、饲养和外科手术程序也按照先前的描述进行（13）。

up-LC14细胞的生成

患者来源的HCC细胞的分离和基因改造按照先前的描述进行（13），并按照已建立的原代肝细胞培养方案进行改造（14, 15）。细胞在标准HCC培养条件下扩增并冷冻保存以供长期存储。详细的转导、培养和冷冻程序见补充方法（Supplementary Methods）。

细胞培养、基因标记和球形体形成

解冻后，up-LC14细胞在Advanced DMEM/F-12培养基条件下维持。通过慢病毒转导稳定整合了LeGO-iG2-Puro+-Luc2构建体（13）。永生化HCC细胞系（HUH-7、Hep3B、HepG2-H1.3）的维护也按照先前的描述进行（16, 17）。对于2D实验，细胞接种在96孔或24孔板中，并在24小时后进行处理。对于3D实验，将荧光素酶转导的up-LC14细胞在超低附着条件下培养，以监测随时间形成的球形体。完整的培养基组成、接种密度、siRNA转染描述和成像设置见补充方法（Supplementary Methods）。

NK92共培养实验和实时活力监测

NK92细胞在IL-2补充的培养条件下扩增，并以1:1、1:5和1:10的效应细胞与靶细胞比例应用。在指定时间点收集上清液和/或细胞进行下游分析。使用xCELLigence基于阻抗的测量技术实时监测靶细胞的活力。详细的NK92培养条件和下游分析结果见补充方法（Supplementary Methods）。

分子分析

使用基于柱子的试剂盒从细胞系和组织中分离RNA和DNA（12, 13, 18）。基因表达通过基于TaqMan的qPCR进行定量（表S2），随后进行cDNA合成。全外显子组测序（WES）和RNA测序（RNA-seq）在Illumina平台上完成，并使用已建立的流程进行分析；下游分析在R中进行。详细的文库制备、测序和生物信息学工作流程见补充方法（Supplementary Methods）。

流式细胞术、免疫荧光和蛋白质测量

流式细胞术按照先前的描述进行（13），使用的抗体面板列于表S3和S4中。培养细胞和组织冰片的免疫荧光染色使用表S5中列出的 primary antibodies 和荧光 secondary antibodies 进行。可溶性HLA-G、人α-1抗胰蛋白酶（AAT）和穿孔素（perforin）的定量按照制造商的说明使用ELISA进行。完整的实验条件和试剂详细信息见补充方法（Supplementary Methods）。

病毒DNA和cfDNA的分离与分析

HBV DNA通过TaqMan qPCR进行定量，使用克隆的标准品（18）。cfDNA从上清液中分离出来，并通过ALU基于的qPCR（表S6）和位点特异性的HLA-G检测（表S2）进行片段分析。完整的实验条件和试剂详细信息见补充方法（Supplementary Methods）。

统计分析

图表和统计分析在GraphPad Prism v10软件（GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA）中进行。统计测试和重复次数详见补充方法和/或图例。显著性阈值定义为*p < 0.05、**p ≤ 0.01、***p ≤ 0.001、****p ≤ 0.0001。

结果

HLA-G基因足迹的鉴定确定了一个免疫调节性的、由HLA-G调控的基因组特征

为了对患者材料进行分类，我们对切除肿瘤的两个空间分离区域（中心区和边缘区）进行了全外显子组测序（WES）（图1A）。两个区域显示出高度重叠的变异谱型，表明它们具有共同的克隆起源，并允许基于稳定的基因组特征而非空间异质性进行患者级别的分类（图1A；图S1）。在过滤掉假定的功能性变异（非同义、高/中等影响、VAF ≥ 0.05）后，变异数量、影响分布和VAF谱型在两个区域之间具有可比性，这与纯度相似的恶性组织一致。

图1. 患者肿瘤中心和边缘区的空间全外显子组测序。（A）对HBV相关HCC切除样本（患者#14；n=2个技术重复/样本）的肿瘤中心和边缘区进行了空间全外显子组测序（WES）（A）。共享和区域特异性的变异通过Venn图进行了总结。（B）显示了中心和边缘区前15个富集变异的基因，按预测影响进行分层（高影响，红色；中等影响，绿色）。（D）对携带高/中等影响变异的基因进行了GO生物过程富集；条形图表示?log10调整后的p值。LILRB1和HLA-G的变异位置和交替等位基因分数（AltAF）分别显示在（E）和（F）中，并通过基因组背景进行注释；虚线表示中位数AltAF。

在区域间，具有最高变异负担的基因在很大程度上是共享的（图1B–C）。前15个富集变异的基因包括黏膜相关基因和结构基因（例如，MUC3A、MUC6、ZNF717、AHNAK2）以及HLA位点内的几个免疫相互作用基因（HLA-DQB1、HLA-DRB1/5、HLA-C）和HLA-G受体LILRB1。尽管排名存在轻微差异，但总体基因组成和中等影响变异的占比一致，表明免疫相互作用途径是核心的基因组特征，而不是区域特异性的适应。区域特异性高影响变异的通路富集证实了在抗原处理和呈现以及T细胞介导的细胞毒性调节方面的显著富集（图1D）。

接下来，我们检查了LILRB1和HLA-G位点的变异（图1E–F）。HLA-G位点包含杂合的14-bp插入（rs371194629）、rs1063320 G和rs1049033，这些变异与HBV易感性和HCC风险相关（11, 19）。额外的多态性（rs1130363、rs915667、rs1707、rs1710、rs1610696）位于3′UTR调控区，影响转录稳定性、microRNA结合以及可溶性HLA-G异构体和膜结合型HLA-G之间的平衡（20）。结合14-bp插入、rs1063320 G和rs1610696 G等位基因，它们与典型的HLA-G 3′UTR UTR-2单倍型最为一致，这种调控配置与免疫耐受和持续病毒感染相关（21, 22），定义了一个与增强免疫耐受信号传导相容的患者特异性HLA-G单倍型。

建立了一个高表达HLA-G的患者来源HBV-HCC模型

使用确诊的HCC组织样本（内部HCC队列n13；n = 13；表S1）对患者#14的恶性材料进行了基因表达分析。在绘制的基因中（图2A），患者#14（红点）与队列的中心分布对齐，支持其作为代表性HCC的分类，并为重构免疫耐受性HLA-G单倍型提供了合适的基础。来自重叠队列（n = 4个早期活检；n = 10个HCC；表S1）的血清进一步分析了sHLA-G（图2B）。与数据集相比，患者#14（红点）的sHLA-G水平升高，这与其基因表型一致。

图2.患者来源的HBV相关HCC细胞系up-LC14A1的生成与特性分析。(A) 患者来源的HBV相关HCC细胞系up-LC14A1的生成与特性分析。患者#14中选定分类基因的基因表达与13个患者来源的HCC样本相比情况(B)。早期活检（n=4）和确诊HCC（n=9）的血清sHLA-G水平（LOD 4.9 ng/mL）；患者#14用红色标记。(C) up-LC14的分离和Upcyte试剂盒转移、克隆选择以及up-LC14A1建立的流程。(D) 上清液和患者血清中的HBV DNA（切除当天）包括HepG2-H1.3对照组（n=3）。(E) 免疫荧光标记物；Hoechst核；比例尺100 μm。(F) 流式细胞术标记物频率（n=3）。(G) HLA-G表达（健康样本n=4；患者样本n=9；up-LC14A1）。(H) TCGA HLA-G（活检样本n=24；HCC样本n=120）。为了建立一个功能性患者来源的HCC细胞系，将亲本肝癌细胞（p-LC14）通过慢病毒 transferring专利的Upcyte基因试剂盒（14）（图2C），使其能够在体外持续增殖，否则在短期培养后会丢失这种能力。经过选择性扩增后，up-LC14A1在标准条件下表现出稳定的增殖能力，并且具有恒定的倍增时间（图S2A）。与之前生成的类似原代细胞的细胞系相比，up-LC14A1的中位倍增时间（43小时）高于永生化细胞系（20小时）（13）。在二维培养中，up-LC14A1产生的HBV DNA水平较低，与患者切除时的血清病毒载量相当（图2D），而HepG2H1.3细胞的病毒产生量较高。

为了提高其作为体外和体内模型的实用性，up-LC14A1细胞通过逆转录病毒转导了表达绿色荧光蛋白（GFP）和荧光素酶（LUC）的LeGoVector（图S2B）。经过嘌呤霉素选择后，67.7%的细胞表达了GFP（up-LC14A1_LUC；图S2C），通过流式细胞术确认。在没有进一步嘌呤霉素选择的传代过程中，GFP表达接近100%，这一点通过荧光显微镜得到验证（图S2D）。然后使用up-LC14A1_LUC细胞来评估球形细胞形成情况（图S2E）。在支持球形细胞形成的U-bottom plates中培养四天后，细胞组织成三维网络，并且随着时间的推移逐渐增大。这种球形细胞形成能力使得能够在生理相关的体外环境中模拟肿瘤进展和治疗反应。

为了将up-LC14A1与常用的永生化HCC细胞系进行比较，我们应用了标准的免疫荧光特性分析面板（13）（图2E, S2F）。up-LC14A1细胞表达了高水平的CK19、Calnexin、AFP、HLF4A、AACAD、VIM和Actin。观察到的细胞质中B型肝炎表面蛋白ALB、MICA/B和CK7的表达较低，同时核内CD44的表达也较低。up-LC14A1细胞对NTCP、EGFR、CD68、CD31和PD-L1呈阴性。总体而言，up-LC14A1保持了亲本LC细胞的蛋白质表达特征，这一点通过流式细胞术得到确认（图2F），包括HLA-G的表面展示。高水平的HLA-G表达与较低的总体生存率相关（图S3G），因此我们使用n13HCC队列（包括健康供体样本）分析了患者#14的亲本组织和衍生细胞的HLA-G表达情况（图2G；表S1）。总体上，健康样本和疾病样本之间没有显著差异，这与全球数据集显示的早期和晚期肝病中相似的HLA-G表达分布一致（图2H）。然而，患者#14的组织和up-LC14A1细胞的HLA-G表达水平高于病原体组的中位数（图2G）。这些表达水平与之前观察到的sHLA-G模式相符（图2B），表明HLA-G基因和蛋白质表达是稳定的。

up-LC14A1细胞的高度侵袭性和迁移性特征，结合其稳定的HLA-G表达，使其有可能模拟HBV相关肝癌的免疫耐受性质。

通过对up-LC14A1细胞的转录组分析，评估了其临床相关性和与常用永生化HCC细胞系的相似性。RNA-seq分析包括了up-LC14A1、HepG2H1.3、Hep3B、HUH7和原代人肝细胞（PHH）（图3A）。在全局DEG数据集中，up-LC14A1细胞在与胆管癌（CCC）、肝细胞癌（HCC）和肝母细胞瘤的z-score评分激活匹配度最高，表明其保持了潜在的临床疾病特征（图3B）。来自HCC细胞系和up-LC14A1的方差稳定数据集通过t分布随机邻域嵌入（t-SNE；图3C）进行了DEG分析。分析的基因与经典信号通路以及应激和毒性相关程序相关。降维处理生成了跨细胞系的共享基因水平坐标，然后将相对表达差异投影到这些坐标上。在经典通路中，up-LC14A1显示的激活模式与已建立的HCC细胞系重叠，表明其保留了核心的肿瘤相关信号通路。对于毒性和应激相关通路也观察到类似的分布，up-LC14A1映射在参考HCC模型的转录空间内，而不是形成一个独立的簇。这些发现表明up-LC14A1再现了肝细胞癌的全局通路结构，同时保留了患者特异性的转录特征。

转录组分析将up-LC14A1定位在HCC细胞谱系中，并揭示了保守的肝脏和肿瘤相关通路活性。NK92细胞转移揭示了up-LC14A1细胞的凋亡免疫逃逸表型。 (A) NK92共培养显示up-LC14A1的适应性免疫逃逸。实验方案如图所示。 (B) 显示了HepG2-H1.3和(C) up-LC14A1在不同效应子与靶标(E:T)比率下的xCELLigence细胞指数（n=2×5重复/条件）。 (D) 上清液中的穿孔素被定量（pg/mL，线性比例）。 (E) 通过ALU-115/ALU-247定量和比率分析评估cfDNA片段（n=4），以及(F) 相对于RPL0的HLA-G gDNA的定量（n=4）。 (G) 显示了24小时共培养后的细胞内HLA-G mRNA（n=4个生物学重复）。 (H) 流式细胞术比较了第2天和第4天高（1:10）与低（1:1）E:T比率下的标记物倍数变化。为阐明潜在的细胞死亡机制，我们分析了指定条件下上清液中无细胞（cf）DNA的长（247bp）和短（115bp）ALU片段的发生情况（图5 E）。在两种共培养设置中，我们观察到短cfDNA片段的水平高于长片段，导致图5E中显示的DNA完整性系数较低，进一步证明细胞死亡是由凋亡引起的（27）。同时，使用cfDNA进行了HLA-G的位点特异性分析（图5F），揭示了HepG2H1.3和up-LC14A1之间的不同释放模式。HepG2H1.3显示出显著更高的基础HLA-G阳性cfDNA，而up-LC14A1则表现出较低的基线水平，与其不同的HLA-G调控状态（HLA-G单倍型）一致。对于HepG2H1.3培养，HLA-G阳性cfDNA的水平与总体cfDNA释放和细胞毒性相关，表明位点特异性检测主要反映了与细胞周转相关的被动DNA释放（图5F）。相比之下，在低细胞毒性压力（1:1效应子与靶标比率）下，up-LC14A1细胞表现出HLA-G位点阳性cfDNA的相对增加，这不能仅用凋亡相关的DNA释放来解释。值得注意的是，在NK92介导的细胞毒性更强条件下，尽管凋亡增加和生存能力降低，HLA-G阳性cfDNA仍然减少（图5C, F）。综合这些发现，我们的结果表明，对于up-LC14A1细胞，HLA-G位点的cfDNA并不与细胞死亡成正比，而是反映了在免疫压力下含有HLA-G的DNA片段的释放，这是肿瘤-免疫交流的一部分（28）。细胞内基因表达模式（图5G）证实了HepG2H1.3和免疫耐受性up-LC14A1细胞之间的这种不规则模式。有趣的是，在应用NK92细胞后24小时内，低HLA-G表达的up-LC14A1细胞的表达增加了20倍，而在HepG2H1.3细胞中未观察到这种动态变化。这一NK92细胞转移引起的动态和静态反应发现与两种细胞类型的表达模式以及up-LC14A1细胞的HLA-G单倍型一致。第4天对NK92细胞的流式细胞术分析显示，在1:10条件下CXCR4和CCR7表达增加，同时活化标志物NKp30和NKp46下调（图5H）。这种模式与在更高效应子与靶标比率下观察到的增强杀伤效果相关，表明在1:10条件下比1:1条件下有更有效的靶细胞清除。总体而言，NK92细胞从主要具有细胞杀伤性转变为更具迁移性的表型，显示出这种永生化NK细胞系对动态、免疫耐受性靶细胞相互作用的表型适应。

HLA-G敲低降低了up-LC14A1细胞的免疫耐受性，并迫使它们转为PDL-1抑制。通过siRNA介导的HLA-G沉默后进行NK92共培养，评估了HLA-G在up-LC14A1细胞中的免疫调节作用（图S7A）。所有三种siRNA都显著降低了HLA-G的表达，其中siRNA1产生了最强的敲低效果（图6A）。纵向生存能力测量证实了NK92介导的细胞毒性压力，并显示在HLA-G沉默后免疫耐受性降低（图6B–C）。在效应子与靶标的比率分别为1:5和1:10时，HLA-G敲低一致导致了细胞指数的显著下降，并伴随穿孔素的显著增加，表明细胞杀伤性活化增强（图6D）。表型分析支持了这一效应。CD56dim/CD16low的比例在不同条件下向PD-1+/Lag3?转变，其中在siRNA1处理后观察到CD56dim/CD16low/NKp46?/CD226+/PD-1+/Lag3?细胞的比例最高，这也产生了最强的细胞毒性影响（图6B–C, 6E）。对该主导NK92亚群内HLA-G受体的分析显示，HLA-G减少促进了向ILT2/ILT4双阴性细胞的转变，而HLA-G表达条件下则表现出适度的ILT2诱导（图6F）。效应子-靶标相互作用通常导致ILT4显著下调，而siRNA1导致ILT2表达的最明显下降以及该活化亚群的最高频率。在基线条件下，检测到KIR2DL4与ILT2和/或ILT4的共表达。在siRNA1作用下，34%的ILT2/ILT4双阳性细胞和8%的ILT2阳性细胞保留了KIR2DL4（图S7B）。免疫荧光显示，在NK92转移后HLA-G蛋白显著诱导，而siRNA处理后显著减少，尤其是在siRNA1作用下（图6G）。同时，在HLA-G敲低条件下PD-L1表达显著上调，而在siRNA2和siRNA3条件下诱导较弱。这些数据表明，HLA-G抑制增强了NK92介导的细胞毒性，同时触发了补偿性的PD-L1介导的免疫逃逸，突出了免疫调节通路之间的动态转换。

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图6. HLA-G沉默对NK92细胞对up-LC14A1细胞反应的功能影响。 (A) siRNA在up-LC14A1中沉默HLA-G对NK92反应的功能影响。通过NK92共培养时标准化HLA-G mRNA在指定比率（1:1, 1:5）下量化HLA-G敲低效果。 (B-C) 显示了指定条件下up-LC14A1的xCELLigence细胞指数。 (D) 显示了72小时NK92共培养后上清液中的穿孔素（pg/mL；表示LLoD；每个条件下的百分比）。 (E) 显示了CD56dim NK92细胞中CD16?dim和CD16low的频率。 (F) 显示了CD56+/CD16low/NKp46?/CD226+ NK92细胞的PD-1/LAG-3分布。 (G) 在27小时（E:T 1:10）时，显示了ILT2/ILT4的变化倍数相对于基线（BL）。 (H) 48小时的免疫荧光显示了HLA-G或PD-L1（水色）与CD45（紫色）和Hoechst细胞核；比例尺100 μm。
HLA-G定位于靶标-效应子接触位点，与接触依赖的免疫调节一致。
通过免疫荧光显微镜分析了表达HLA-G的up-LC14A1细胞与NK92细胞之间的空间关系（图7）。up-LC14A1细胞表现出强膜结合和胞质HLA-G表达（青色），而NK92细胞则通过CD45表达（紫色）识别。共培养导致形成了密集的细胞簇，NK92细胞聚集在表达HLA-G的up-LC14A1细胞周围，指向活跃的免疫-肿瘤细胞相互作用。在高倍视野1, 2, 3, 4, 5中，突出了NK92细胞与up-LC14A1细胞之间的多个直接接触区域。在界面处，HLA-G信号经常集中在接触位点，并在某些情况下出现在相邻CD45+ NK92细胞的表面（白色箭头）。这些观察表明HLA-G在免疫突触处积极参与，并在这些靶标-效应子相互作用过程中重新分布。

HLA-G通过siRNA介导的沉默后进行NK92共培养，评估了HLA-G在up-LC14A1细胞中的免疫调节作用（图S7A）。所有三种siRNA都显著降低了HLA-G的表达，其中siRNA1产生了最强的敲低效果（图6A）。纵向生存能力测量证实了NK92介导的细胞毒性压力，并显示HLA-G沉默后免疫耐受性降低（图6B–C）。在效应子与靶标的比率分别为1:5和1:10时，HLA-G敲低一致导致细胞指数下降，并伴随穿孔素分泌显著增加，表明细胞杀伤性活化增强（图6D）。表型分析支持了这一效果。CD56dim/CD16low亚群在各种条件下向PD-1+/Lag3?组成转变，其中在siRNA1处理后观察到CD56dim/CD16low/NKp46?/CD226+/PD-1+/Lag3?细胞的比例最高，这也产生了最强的细胞毒性影响（图6B–C, 6E）。在这一主导NK92亚群中分析HLA-G受体显示，HLA-G减少促进了向ILT2/ILT4双阴性细胞的转变，而HLA-G表达条件则表现出适度的ILT2诱导（图6F）。效应子-靶标相互作用通常导致ILT4显著下调，而siRNA1导致ILT2表达的最显著下降以及这一活化亚群的最高频率。在基线条件下，检测到KIR2DL4与ILT2和/或ILT4的共同表达。在siRNA1作用下，34%的ILT2/ILT4双阳性和8%的ILT2阳性细胞保留了KIR2DL4（图S7B）。免疫荧光确认在NK92转移后HLA-G蛋白显著诱导，而siRNA处理后显著减少，尤其是在siRNA1作用下（图6G）。同时，在HLA-G敲低条件下PD-L1表达显著上调，而在siRNA2和siRNA3条件下诱导较弱。这些数据表明，HLA-G抑制增强了NK92介导的细胞毒性，同时触发了补偿性的PD-L1介导的免疫逃逸，突出了免疫调节通路之间的动态转换。

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图6. HLA-G沉默对NK92细胞对up-LC14A1细胞反应的功能影响。 (A) HLA-G沉默对NK92对up-LC14A1反应的功能影响。通过NK92共培养时标准化HLA-G mRNA量化up-LC14A1中的HLA-G敲低效果（1:1, 1:5）。 (B-C) 显示了指定条件下up-LC14A1的xCELLigence细胞指数。 (D) 显示了72小时NK92共培养后上清液中的穿孔素（pg/mL；LLoD已标出；每个条件下的百分比）。 (E) 显示了CD56dim NK92细胞中CD16?dim和CD16low的频率。 (F) 显示了CD56+/CD16low/NKp46?/CD226+ NK92细胞的PD-1/LAG-3分布。 (G) 在27小时（E:T 1:10）时，显示了ILT2/ILT4的变化倍数相对于基线（BL）。 (H) 48小时的免疫荧光显示了HLA-G或PD-L1（水色）与CD45（紫色）和Hoechst细胞核；比例尺100 μm。
HLA-G定位在靶标-效应子接触位点，与接触依赖的免疫调节一致。up-LC14A1模型提供了一个实验平台，用于研究基因组背景、病毒环境以及免疫压力如何影响与HBV相关的肝癌（HCC）中的免疫逃逸现象。

**作者贡献**
JK负责启动并监督了这项研究；JK、LS、SK、PL和MD设计了实验方案；AH和KS负责采集人类样本；JK、LS、GM、NH、MV、SS和TV进行了实验并收集数据；JK、LS、SS、PL和WD对数据进行了分析；JK、WD、JHK、SK、SL和MD共同撰写了论文。所有作者都对数据进行了讨论并对论文进行了修订。所有作者都能访问研究数据，并已审阅并批准了最终版本的手稿。

**数据可用性声明**
本研究中生成和分析的数据集（包括转录组数据和功能测定结果）可应合理请求向通讯作者索取。up-LC14A1细胞系可依据材料转让协议提供给学术研究人员用于非商业用途。额外的方法学细节见补充材料，如需定制实验方案也可另行提供。

**资金支持**
该研究得到了德国研究基金会（DFG）的资助，资助对象为JK（项目编号：KA 5390/2-1）。所有支持本研究工作的资金来源均已得到确认，作者们没有需要披露的信息。