《Journal of Advanced Research》：CsZAT6/12 response auxin signaling to differentially regulate theanine-dominated nitrogen flow in tea roots (Camellia sinensis)
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L-茶氨酸是茶树根中独特合成的含氮化合物，是茶风味核心决定因子和氮的关键载体。其代谢动态与根系发育紧密相关，然而生长素信号是否参与调控茶氨酸生物合成及其潜在分子机制仍不清楚。本研究旨在阐明在茶苗根系特异性茶氨酸生物合成中调控生长素信号的分子途径和关键调控因子。
L-茶氨酸是茶树根中独特合成的含氮化合物，是茶风味核心决定因子和氮的关键载体。其代谢动态与根系发育紧密相关，然而生长素信号是否参与调控茶氨酸生物合成及其潜在分子机制仍不清楚。本研究旨在阐明在茶苗根系特异性茶氨酸生物合成中调控生长素信号的分子途径和关键调控因子。研究人员通过高效液相色谱（HPLC）、气相色谱-质谱（GC–MS）和液相色谱-质谱（LC-MS）分别检测了茶苗根、茎、叶在五个发育阶段（S1-S5）的自由氨基酸（FAA）、乙胺和内源激素含量的变化。通过整合时间序列转录组和加权基因共表达网络分析（WGCNA），构建了茶氨酸生物合成调控网络。此外，还采用了外源吲哚-3-乙酸（IAA）处理、酵母单杂交实验、体内功能验证和DNA亲和纯化测序（DAP-seq）来筛选和鉴定关键调控因子。在茶苗胚根发育过程中，茶氨酸含量从占总FAA的10%迅速增加到80%以上。多组学关联分析揭示了快速茶氨酸生物合成与生长素信号水平之间存在反馈抑制关系。外源IAA处理及体内/体外实验证实，响应生长素信号的CsZAT6/CsZAT12-CsAlaDC模块对茶氨酸代谢发挥双向调控作用：CsZAT6通过激活CsAlaDC（乙胺生产限速酶）的表达正向调控茶氨酸生物合成，而CsZAT12则通过抑制CsAlaDC表达负向调控茶氨酸生物合成。本研究揭示了CsZAT6和CsZAT12作为响应生长素信号的核心因子，在茶苗胚根发育过程中通过差异调控CsAlaDC表达来调控茶氨酸生物合成速率和氮流分配。这些发现探索了生长素信号与茶氨酸代谢之间的反馈调节机制，为理解茶树中茶氨酸为中心的独特氮营养分配系统提供了新的分子见解。
一、研究背景与目的
茶树（Camellia sinensis）是重要的经济作物，其特色次级代谢产物L-茶氨酸不仅贡献茶叶鲜爽风味，还具有多种生理活性。茶氨酸的合成特异性地发生在茶树根部，由茶氨酸合成酶（CsTSI）催化谷氨酸和乙胺缩合而成，其中乙胺由丙氨酸脱羧酶（CsAlaDC）产生。茶氨酸不仅是次级代谢物，在茶苗发育早期，它替代谷氨酰胺成为主要的氮储存和长距离运输载体，对氮营养分配具有关键作用。
在植物中，氮信号与生长素（IAA）信号存在广泛的互作，共同调控根系构型以适应氮环境变化。在茶树中，初步研究表明低氮条件促进侧根生长并提高IAA含量，而高氮条件则抑制侧根生长。此外，有研究发现氮缺乏促进侧根发育但降低了茶氨酸含量，而外源茶氨酸处理显著抑制侧根发育并下调生长素含量及相关代谢基因的表达，这提示茶氨酸可能作为一种活性信号反馈调节生长素稳态，从而影响根系发育。然而，生长素信号是否介导氮可用性响应的茶氨酸生物合成，并参与茶树根系的生长发育，仍不明确。
为了系统分析茶苗发育过程中以茶氨酸为主导的氮流与生长素信号之间的互作及反馈调节机制，本研究通过对不同发育阶段的茶苗组织进行转录组测序和激素代谢组学分析，利用WGCNA构建了以茶氨酸为中心的分子调控网络，并筛选和验证了关键调控因子。
二、主要研究方法
本研究以茶树品种‘舒茶早’成熟种子和一年生扦插苗为材料。种子播种后，分别在胚根露白（S1）、胚根伸长（S2）、幼茎生长（S3）、一芽二三叶（S4）和侧根及叶片充分发育（S5）六个阶段采样根、茎、叶。利用HPLC、GC-MS、LC-MS分别测定各组织中的自由氨基酸、乙胺和内源激素含量。采用携带UMI标签的绝对定量转录组对S1-S5阶段的30个cDNA文库进行测序，并进行了差异表达分析和功能富集分析。基于根转录组数据，通过WGCNA构建基因共表达网络，筛选与茶氨酸代谢高度相关的模块和转录因子。对筛选出的候选转录因子（CsZAT6/10/12）进行了基因克隆、亚细胞定位、酵母单杂交、双荧光素酶报告基因、电泳迁移率变动分析、反义寡核苷酸基因沉默、叶片瞬时过表达以及DNA亲和纯化测序等体内外功能验证实验，以明确其与茶氨酸合成关键基因（CsAlaDC, CsTSI）的调控关系。
三、研究结果
1. 茶籽萌发和幼苗发育过程中茶氨酸含量的动态变化
在成熟茶籽中茶氨酸含量极低，但在胚根发育过程中，根中茶氨酸含量从占总FAA约10%迅速增加到S3阶段（幼茎生长）的80%以上。茎和叶中也观察到类似趋势。谷氨酸和乙胺等茶氨酸合成关键前体含量在胚根发育过程中也显著增加。在幼苗进一步生长和组织分化过程中，各组织的茶氨酸含量逐渐下降，表明茶氨酸被转化为其他氮形态参与地上器官的构建。
2. 转录组分析及差异表达基因的表达模式
对根、茎、叶的转录组进行主成分分析和差异表达分析，发现根S1阶段与其他阶段差异显著。在茶氨酸含量急剧增加的S2_vs_S1和S3_vs_S1比较中，鉴定出7864个共同差异基因。GO和KEGG富集分析显示，这些基因显著富集于转录调控、植物生长、激素信号转导、氨基酸转运蛋白、TCA循环等通路。
3. 利用WGCNA构建茶苗发育过程中与茶氨酸代谢相关的转录因子调控网络
WGCNA将基因分为27个模块，其中绿模块和黄模块与茶氨酸、乙胺含量呈显著正相关，而青模块与二者呈显著负相关。KEGG富集分析表明，这些模块与氨基酸代谢、植物激素信号转导等通路高度相关。进一步构建共表达网络，发现MYB、C2H2、bHLH、ERF和WRKY家族的转录因子占主导地位。通过与已发表的氮处理转录组数据关联分析，筛选出与CsTSI和CsAlaDC高度相关的转录因子子网络，其中包含已知的CsMYB40和CsHHO3，证实了筛选结果的可靠性。
4. 生长素影响茶苗发育过程中茶氨酸的积累
激素代谢组学检测到77种激素化合物，主要包括生长素、细胞分裂素、脱落酸、赤霉素、乙烯和独脚金内酯。在茶苗发育早期，各组织激素含量最高。相关性分析显示，大多数生长素类物质与茶氨酸含量呈显著负相关。转录组分析显示，在茶氨酸积累的同时，生长素信号通路相关基因（YUCCA, AUX/IAA, ARF, GH3, SAUR等）显著富集。外源IAA处理证实，IAA浓度增加会降低茶氨酸含量，并显著抑制CsTSI和CsAlaDC的表达。同时，从共表达网络中筛选出的转录因子CsZAT6、CsZAT10、CsZAT12的表达在IAA处理后显著上调。
5. CsZAT6/10/12基因的鉴定与分析
通过序列比对和进化树分析，将筛选出的三个C2H2家族转录因子命名为CsZAT6、CsZAT10和CsZAT12。亚细胞定位显示它们均定位于细胞核。组织表达谱分析表明，这三个转录因子与CsTSI、CsAlaDC在茶树根中高表达的模式相似。它们对不同形态氮处理（尤其是乙胺）及非生物胁迫处理均有响应。
6. CsZAT6正向调控茶氨酸生物合成，而CsZAT12抑制茶氨酸生物合成
酵母单杂交、EMSA和双荧光素酶报告基因实验证实，CsZAT6能够直接结合CsAlaDC启动子（proCsAlaDC）上的AGC/T或ACT元件，并激活其表达。在茶苗根尖进行反义寡核苷酸沉默CsZAT6，可下调CsAlaDC和CsTSI的表达，并降低乙胺和茶氨酸含量。在茶叶中瞬时过表达CsZAT6，则能上调CsAlaDC和CsTSI的表达，增加乙胺和茶氨酸含量。以上结果表明CsZAT6通过正向调控CsAlaDC表达促进茶氨酸生物合成。另一方面，实验证实CsZAT12也能结合proCsAlaDC，但发挥抑制作用。沉默CsZAT12可上调CsAlaDC和CsTSI表达并增加茶氨酸含量，而过表达CsZAT12则产生相反效果。这表明CsZAT12负向调控茶氨酸生物合成。
7. DAP-seq鉴定CsZAT6和CsZAT12的全基因组靶基因
DAP-seq分析获得了CsZAT6和CsZAT12的全基因组结合图谱。结合峰主要分布在基因转录起始位点（TSS）附近。Motif分析发现二者主要结合“AGTGYATC”和“ACACTTYG”等元件，但也存在特异性结合位点。功能富集分析显示，CsZAT6和CsZAT12的靶基因显著富集于氨基酸代谢、次级代谢物生物合成及信号转导等过程。特别地，CsZAT6在CsMYB40（一个已知的CsAlaDC正调控因子）启动子区有结合峰。不同氮处理下的表达谱显示，CsMYB40在缺氮（0 N）下表达最高，而CsZAT6、CsAlaDC、CsTSI则在乙胺（EA）处理下被强烈激活。此外，CsZAT12在茶氨酸转运蛋白基因CsCAT2启动子区有结合峰，且二者表达模式相反，提示CsZAT12可能通过抑制CsCAT2表达来促进茶氨酸向地上部转运。
四、讨论与结论
讨论部分总结：
本研究聚焦于茶氨酸水平发生剧烈变化的胚根萌发阶段，揭示了生长素信号与茶氨酸代谢之间的反馈调节机制。研究发现，CsZAT6和CsZAT12是响应生长素信号、调控茶氨酸生物合成的核心因子。CsZAT6直接结合并激活CsAlaDC启动子，正向调控茶氨酸合成；而CsZAT12则抑制CsAlaDC表达，负向调控茶氨酸合成。这种“激活-抑制”的配对调控模式类似于高氮条件下茶氨酸生物合成的“油门-刹车”模型，为维持茶树根中茶氨酸动态稳态提供了分子基础。
多组学分析表明，茶苗胚根发育过程中快速的茶氨酸积累伴随着生长素信号水平的下降，外源IAA处理显著抑制茶氨酸生物合成，这提示二者存在反馈抑制关系。在发育早期，内源氮激活CsZAT6，触发茶氨酸快速合成，同时生长素合成与信号基因被下调，这可能抑制侧根发育、促进主根伸长，以适应种子萌发初期的氮供应模式。在发育后期，当内源氮储备耗尽，内源生长素信号增强以促进侧根发育吸收外源氮，此时升高的生长素信号抑制CsZAT6、激活CsZAT12，从而调节茶氨酸生物合成，促进氮的再分配。CsZAT6/12通过差异调控CsAlaDC，如同“阀门”一样精确控制着以茶氨酸为主导的氮流，协调茶树根系发育与氮营养分配。
结论部分翻译：
本研究揭示了CsZAT6和CsZAT12作为响应生长素信号的核心因子，在茶苗胚根发育过程中通过差异调控CsAlaDC表达来调控茶氨酸生物合成速率和氮流分配。这些发现探索了生长素信号与茶氨酸代谢之间的反馈调节机制，为理解茶树中以茶氨酸为中心的独特氮营养分配系统提供了新的分子见解。
