迈向无动物心脏安全性测试：通过多模式体外检测参数早期发现心脏毒性反应

《Journal of Advanced Research》：Toward animal-free cardiac safety testing: Early detection of cardiotoxic reactions via multimodal in vitro readouts

　　

随着美国食品药品监督管理局等监管机构在临床前研究中逐步淘汰动物测试，对人类相关的、基于细胞的心脏安全性评估模型的需求日益增长。人类诱导多能干细胞来源心肌细胞已成为评估基因型特异性心脏毒性的有力工具，特别是在长QT综合征等遗传性心律失常综合征患者中。然而，这些模型的预测准确性仍受到不同检测平台间变异性的限制。本研究旨在通过三种互补的检测平台，系统地表征奎尼丁在对照组和长QT综合征hiPSC-CMs中诱导的心脏毒性，并确定无标记机械表型分析是否比单一的传统电生理学检测能提供更早、更敏感的心脏毒性标志物。研究人员系统地评估了已知的QT延长剂奎尼丁，在对照组和长QT综合征hiPSC-CMs中使用三种互补技术——多电极阵列、膜片钳和数字全息成像，并在匹配的实验条件下进行。多电极阵列和膜片钳用于评估场电位和动作电位，而数字全息成像则用于量化收缩动力学，包括舒张期和静息期。多电极阵列和膜片钳检测到浓度依赖性的电生理异常，包括动作电位延长和早期后除极。而数字全息成像在低至1微摩尔浓度的奎尼丁处理下，即在长QT综合征样本中量化到收缩功能障碍，与基线相比显著延长舒张期，并缩短静息期。当多电极阵列信号丢失或膜片钳记录变得不稳定时，这些机械变化仍可被检测到，表明数字全息成像能为奎尼丁诱导的心脏毒性提供更早、更敏感的标志物。将无标记机械表型分析与传统电生理学结合，可改善药物诱导心脏毒性的早期检测。随着该领域朝着更加伦理和预测性的方向推进，多模式hiPSC-CM平台对于推进体外心脏安全性测试至关重要。

药物开发与临床护理中的心脏毒性仍是一大挑战，尤其对于有潜在心律失常疾病的个体。尽管许多药物通常被认为是安全的，但近期研究表明，部分药物可能在遗传易感个体中引发严重的药物不良反应。这突显了对整合患者特异性遗传背景的体外模型的需求，以更好地预测个体心脏毒性反应。人类诱导多能干细胞来源的心肌细胞正越来越多地用作心脏毒性筛选的生理相关工具。近期监管方向的转变进一步强调了人类相关的基于细胞的检测在临床前安全性测试中的重要性。目前广泛使用的电生理学技术，如多电极阵列和传统膜片钳记录，在评估心脏兴奋性等方面存在局限，且两者仅限于电生理表型分析，无法直接评估收缩功能障碍。为了克服这些限制，研究人员引入了无标记成像技术，如数字全息成像，作为一种用于心脏功能分析的补充工具。本研究系统地考察了奎尼丁的毒性效应，该药物是常用的hERG K⁺通道阻滞剂，用于模拟QT间期延长和评估促心律失常风险。研究人员在健康对照组和长QT综合征患者来源的hiPSC-CMs上应用了三种平台，揭示了药物诱导功能障碍的多面性。特别地，无标记机械传感的整合使得能够检测到早期收缩损伤，而这些损伤在传统电生理学方法中并不明显。这些发现强调了多模式评估策略在准确评估心脏毒性风险，特别是在遗传易感患者群体中的关键价值。

本研究使用了几个关键技术方法。研究人员采用了离轴数字全息成像作为一种无标记、非侵入性的方法来量化活体心肌细胞在生理条件下的收缩动力学。从记录的全息图中，通过相位解包裹数值重建出定量相位图像，从而得到时间序列的QPI序列。随后，通过一个自动化的计算流程处理这些QPI序列，以提取两种互补的收缩动力学信号，随后通过自动峰值检测算法识别和分割单个搏动时相。研究人员从健康个体和长QT综合征患者生成了hiPSC-CMs。分子和免疫细胞化学表征通过定量逆转录聚合酶链反应和心肌标志物的免疫荧光染色来评估。研究人员使用常规全细胞电流钳配置记录自发搏动的hiPSC-CMs的动作电位。使用24孔多电极阵列系统在基线和奎尼丁处理条件下记录细胞外场电位。统计使用Origin Pro 2016和GraphPad Prism 8.0进行。

研究结果

人类iPSC-CMs的制备与表征：研究人员从健康个体和LQTS患者生成了人类iPSC-CMs。自发搏动的心肌细胞在分化约第7天被观察到。分化后的心肌细胞中CM特异性标记基因的表达显著增加。免疫细胞化学分析进一步证实了hiPSC-CMs强烈表达CM特异性标记。流式细胞术分析显示，在所有细胞系中，TNNT2阳性细胞的比例超过90%。与广泛使用的参考心肌细胞对照组相比，所有hiPSC-CM细胞系中这些基因的表达水平普遍在参考对照的约0.5至3倍范围内。这表明本研究中生成的hiPSC-CMs具备进行药物反应评估所需的关键电生理分子特征。

基于数字全息成像的收缩动力学分析的定性与定量结果：通过离轴数字全息成像，研究人员获取了正常和LQTS患者来源的CMs在不同浓度奎尼丁处理下的定量相位图像。视觉检查确认，计算的收缩动力学主要由细胞搏动活动驱动，而非形态学伪影或细胞丢失。在正常CMs中，收缩动力学的时间参数在测试的奎尼丁浓度范围内保持稳定。相比之下，LQTS CMs表现出浓度依赖性的收缩动力学改变。尽管搏动幅度和频率基本保持不变，但搏动周期的构成发生了变化，舒张期延长，静息期缩短。这些机械变化在奎尼丁浓度低至1微摩尔时即可检测到，证明了基于数字全息成像的方法具有早期检测能力。

膜片钳揭示hiPSC-CMs中对奎尼丁的基因型特异性电生理反应：在对照组和LQTS患者来源的hiPSC-CMs中记录了动作电位。代表性记录显示，两种细胞类型中均存在奎尼丁诱导的浓度依赖性APD₉₀延长。定量分析显示，在对照细胞中，APD₉₀随着更高的奎尼丁浓度逐渐增加。相比之下，LQTS hiPSC-CMs表现出更陡峭的APD₉₀增加，从1微摩尔开始即出现显著延长。这种显著的电生理不稳定性伴随着明显的搏动间隔延长和频繁的EAD样事件。这些基因型特异性的药物反应差异与两个细胞系的基线电生理特性一致。LQTS细胞在基线时表现出显著更长的APD₉₀和更大的搏动间隔变异性。这种兴奋性的基线异质性很可能导致了LQTS细胞对奎尼丁诱导的APD延长和心律失常发生的易感性增加。

多电极阵列揭示对奎尼丁的基因型特异性电沉默：从培养在24孔MEA板上的hiPSC来源的CMs获得场电位记录，以评估对奎尼丁的细胞外电生理反应。在基线时，对照组和LQTS细胞系均表现出稳定的自发电活动。在对照细胞中，代表性场电位记录显示，随着奎尼丁浓度升高，尖峰幅度呈浓度依赖性降低。相比之下，LQTS来源的CMs表现出明显更高的敏感性。在大多数孔中，稳定且可分析的场电位波形在3微摩尔及以上浓度不再可检测到，表明网络水平电活动的同步性丧失，并过渡到静息状态。这些结果证明了MEA记录在早期检测网络水平电同步性破坏以及揭示疾病模型CMs之间对药物诱导传导异常的不同敏感性方面的效用。

讨论：研究人员通过数字全息成像、膜片钳和MEA等多个平台对奎尼丁诱导的心脏毒性进行了比较评估。这一分析揭示了不同平台之间不同但互补的敏感性。每种检测方法捕捉了CM功能的不同方面，从而能够更全面地理解药物诱导的功能障碍如何在兴奋-收缩序列中产生。虽然对照hiPSC-CMs表现出电生理参数的浓度依赖性变化，但LQTS来源的细胞显示出显著更高的敏感性。在MEA记录中，对照细胞在高达10微摩尔奎尼丁时仍保持电活动，而LQTS细胞在3微摩尔时即完全丧失场电位。膜片钳分析进一步证实，两种细胞类型均表现出APD₉₀延长和搏动频率降低；然而，LQTS细胞在更高浓度下显示出更陡峭的APD增加和频繁的EAD样事件。这些促心律失常特征在对照组中不存在。本研究在先前研究的基础上，通过整合DHI的机械表型分析来检测收缩功能障碍，从而解决了先前确定的关键限制。将机械表型分析与MEA和膜片钳分析相结合，可以弥补每个平台的灵敏度限制。这种互补性加强了体外心脏安全性测试的可解释性和鲁棒性。本研究的首要目标是建立一个多模式平台的概念验证，该平台在患者特异性遗传背景下整合电生理和机械检测结果。因此，我们使用了2D单层模型，以便在平台之间进行受控、可重复的实验。未来的一个关键方向是将这个经过验证的多模式框架应用于更具生理相关性的三维心脏类器官系统。同时，应努力致力于标准化机械生物标志物，并建立与临床风险一致的收缩功能障碍定量阈值。随着监管机构越来越多地远离基于动物的测试，在人类相关的细胞系统中整合电学和机械检测结果的平台对于下一代心脏毒性筛选至关重要。

结论：研究人员建立了一个多模式体外框架，整合了多电极阵列、膜片钳和数字全息成像，以评估奎尼丁在对照组和LQTS hiPSC来源的心肌细胞中诱导的心脏毒性。结合电学、离子和机械检测结果，能够全面检测基因型特异性功能障碍，并阐明了导致电生理衰竭的事件序列，其中机械损伤先于电生理恶化。这些结果凸显了机械表型分析作为药物诱导心脏毒性的一个敏感的补充标志物。尽管我们评估了2D单层模型中的单一化合物，但该框架易于扩展到多种药物、基因型和3D类器官系统。总之，这些进展支持开发用于下一代心脏安全性测试的预测性、人类相关的、无动物的平台。