智利‘西拉’葡萄及葡萄酒在不同气候条件下的酚类成分与萃取性研究

《Journal of Agriculture and Food Research》：Phenolic composition and extractability of Chilean ‘Syrah’ grapes and wines under contrasting climatic conditions

　　马科·布斯塔曼特（Marco Bustamante）、伊格纳西奥·加西亚-埃斯泰维斯（Ignacio Gacía-Estévez）、克里斯蒂娜·阿尔卡尔德-埃翁（Cristina Alcalde-Eon）、马丁·L·范佐内（Martín L. Fanzone）、圣地亚哥·萨里（Santiago Sari）、玛丽亚·特蕾莎·埃斯克里瓦诺-巴伊龙（María Teresa Escribano-Bailón）、阿尔瓦罗·佩尼亚-涅拉（álvaro Pe?a-Neira）、马里奥娜·吉尔·伊·科蒂埃拉（Mariona Gil i Cortiella）
智利大学农业科学学院农工与酿酒学系，智利圣地亚哥882000，拉平塔纳（La Pintana）圣罗莎11315

**摘要**
气候变化对葡萄酒生产地区提出了重大挑战，尤其是由于温度上升加快了葡萄中糖分的积累，导致技术成熟度（与糖分和酸含量相关）与酚类成熟度（与花青素积累和种子壳木质化相关）之间的脱钩。本研究旨在评估来自智利两个气候条件不同的山谷的“西拉”葡萄及其葡萄酒的酚类组成和可提取性。通过长期和季节性生物气候指数对这两个地区进行了农业气候特征分析，证实了马伊波山谷（Maipo Valley）温暖的气候和卡萨布兰卡山谷（Casablanca Valley）较凉爽的气候。分析了在同一技术成熟度下收获的葡萄的果皮、种子和葡萄酒中的酚类化合物（花青素和黄酮类）及其可提取性。马伊波山谷的温暖气候降低了果皮中的酚类含量，但提高了其可提取性，并且促进了种子中酚类化合物的提取以及可溶性多糖的释放。总体而言，快速的糖分积累和技术成熟度与酚类成熟度的脱钩对最终葡萄酒的酚类组成产生了负面影响。这些发现突显了气候条件对葡萄中酚类物质形成的影响，并揭示了气候变化对红葡萄酒质量可能产生的后果。

**1. 引言**
葡萄栽培和酿酒分别是世界上最古老的农业实践和农工业过程之一。几个世纪以来的知识和经验表明，要生产出具有强烈风土特色的高质量葡萄酒，通常需要在生长季节结束时（初秋）达到葡萄的完全成熟。这种时机安排有助于确保关键的成熟期不会与季节中最热的部分重合，因为后者可能对葡萄酒的香气表达产生不利影响[1][2]。因此，大多数葡萄种植区在较冷的地区种植早熟品种，而在较温暖的地区传统上种植晚熟品种，以增加在夏末或初秋达到适当成熟的可能性[1]。然而，人为引起的气候变化给传统葡萄酒产区带来了重大挑战，表现为平均温度升高、干旱频率和持续时间增加、成熟期出现热浪、极端天气事件（如冰雹和洪水）的预计增加，以及野火的发生频率和严重程度的增加[3][4]。这些气候变化正在改变历史上建立的葡萄酒产区的适宜性[5]。已经提出了多种适应策略，包括长期措施（例如葡萄园选址、品种选择、砧木选择、种植行方向、修剪系统以及土壤管理）和短期措施（例如水分管理、冠层管理或晚修剪，以及使用抗蒸腾剂或彩色遮阳网）[6][7]。
尽管智利仍被认为是“新世界”葡萄酒生产国，但它拥有近五个世纪的葡萄栽培和酿酒传统[8]，目前是全球第四大葡萄酒出口国。其独特的地理位置——包括广泛的纬度范围和因靠近太平洋和安第斯山脉而形成的高海拔差异——加上明显的气候多样性，使其成为研究气候变化影响及其适应性的天然实验室。智利的马伊波山谷（Maipo Valley）是一个温暖的葡萄种植区，位于圣地亚哥大都会区（Metroplitan Region of Santiago）的安第斯山脉脚下，以生产优质红葡萄酒而闻名，尤其是使用“赤霞珠”（Cabernet Sauvignon，一种晚熟品种）酿造的红葡萄酒。距离马伊波山谷不到100公里的同一纬度处是较年轻的卡萨布兰卡山谷（Casablanca Valley），由于靠近太平洋（该纬度的低温受洪堡洋流影响），该地区传统上专门种植早熟品种，如“长相思”（Sauvignon Blanc）和“黑皮诺”（Pinot Noir）。
由于全球变暖，生长季节的积温正在增加——这通常用于分类葡萄酒生产区，并通过温克勒指数（Winkler Index）和胡格林指数（Huglin Index）等指标进行评估——因此许多葡萄酒产区正在从一个农业气候类别转变为另一个类别[9]，从而改变了它们生产某些类型葡萄酒的能力[5]。例如，马伊波山谷的种植者开始面临成熟加速和难以达到满意花青素水平的挑战，从而影响了葡萄酒的颜色。相比之下，在过去的几十年里，卡萨布兰卡山谷的种植者越来越多地种植“梅洛”（Malbec）和“西拉”（Syrah）等红葡萄品种，获得了令人满意的结果。由于加速成熟促进了技术成熟度与酚类成熟度之间的脱钩[10]——这是当代优质红葡萄酒生产中的一个主要问题——因此选择了马伊波和卡萨布兰卡山谷作为温暖和凉爽气候的对比模型，以评估它们生产红葡萄酒的潜力。为此，选择了两个种植相同品种“西拉”的商业葡萄园，这些葡萄园采用自根嫁接的方式，以获得同等技术成熟度的葡萄，从而能够比较葡萄果皮和种子中的酚类组成以及最终葡萄酒的品质。选择“西拉”作为研究模型首先是因为它在这两个山谷中都有种植，其次是因为它是全球广泛种植的红葡萄酒品种之一，目前在31个国家都有栽培[11]。此外，作为一种中熟品种，“西拉”可以根据不同的气候条件表现出不同的特性，从而产生具有多样性和商业相关感官特性的葡萄酒[12]。这种方法有助于了解加速成熟和酚类-技术脱钩在田间条件下的影响对葡萄酒颜色和化学成分的影响。此外，将葡萄和葡萄酒的成分数据与两个地点的历史和季节性农业气候指数结合起来，有助于更全面地了解它们在温暖和凉爽气候条件下生产优质红葡萄酒的潜力，同时为智利葡萄酒产业以及面临类似挑战的世界其他葡萄酒产区提供适应气候变化的长期策略指导。

**2. 材料与方法**
**2.1. 研究地点和植物材料**
本研究选择了智利中部的两个气候条件不同的葡萄园：一个位于马伊波山谷的温暖气候区，即佩雷兹·克鲁斯家族葡萄园（Pérez Cruz Family Vineyards，坐标33°50′20.5″S, 70°37′33.0″W；海拔470米）；另一个位于卡萨布兰卡山谷的凉爽气候区，即马特蒂克葡萄园（Matetic Vineyards，坐标33°27′57.3″S, 71°23′30.0″W；海拔240米）。这两个葡萄园在2018年生长季节均处于全面生产状态，且都种植了未嫁接的“西拉”（Vitis vinifera L. cv. Syrah，克隆174），以尽量减少地点之间的遗传差异。葡萄采用垂直枝条定位（VSP）栽培系统，朝南北方向种植，并使用双Guyot修剪方法进行修剪。两个葡萄园的种植密度一致，行距为1.6米，株距为1.0米。每个生物重复样本由20株具有均匀生长势和冠层发育的连续葡萄组成。采用这种采样策略是为了尽量减少由于土壤性质、水分可用性和植物表现的空间异质性导致的块内变异，这些是商业葡萄园的固有特征。由于本研究是在已经建立的葡萄园进行的，而不是在受控实验田中进行的，因此无法采用随机完全区组设计。相反，这种针对性的采样方法确保了重复样本之间的可比性，同时保持了真实葡萄园条件的代表性。每个葡萄园设置了三个独立的生物重复样本（n = 3）。
补充材料中提供了两个葡萄园地点的地理位置地图（图S1）。该地图使用QGIS软件（版本3.34.9）根据NASA Earthdata（https://search.earthdata.nasa.gov/search）的卫星数据生成，并使用Surfer软件以0.0001的垂直夸大因子构建了三维表示。图中所示的范围仅代表研究范围，并不一定与已建立的国家边界对齐。
除了气候差异外，两个地点还具有典型的智利中部土壤来源和地貌特征。卡萨布兰卡葡萄园建立在古老的花岗岩基础上，土壤质地粗糙、排水良好，但由于风化过程严重，天然肥力较低，保水能力较差。相比之下，马伊波阿尔托葡萄园（Maipo Alto）位于安第斯山脉山脚下的冲积和沉积物上，形成了具有高石含量的异质土壤，有机质含量低，排水性能优良，这是高品质葡萄种植的典型特征。尽管土壤类型和海拔存在差异，但两个葡萄园位于相似的纬度上，解释本研究观察到的不同物候发育和成熟动态的主要因素是与太平洋靠近相关的温度制度。卡萨布兰卡山谷受到洪堡洋流的强烈影响，形成了较冷的气候、较高的相对湿度和较低的热积累，导致物候延迟和成熟期延长。而内陆的马伊波山谷则经历较温暖的气候和更快的成熟过程，这突显了其中间气候因素在其他环境因素中的主导作用。

**2.2. 生物气候指数计算**
气候数据来自每个葡萄园的气象站，并从智利“Red Agroclimática Nacional”网站下载[13]。表1中列出的生物气候指数是根据40年的历史数据计算得出的。这些指数包括生长季节温度指数（GST；[14]）、生长累积度日指数（Winkler Index, GDD；[15][16]、日照温度指数（HI；[17]）、凉夜指数（CI；[18]）和三月平均温度幅度（MTA；[19]）。这些指数也针对2018年生长季节进行了计算，即试验的收获年份。2018年葡萄酒生产季节期间，Maipo（MV）和Casablanca（CV）两地每日温度振幅的十日移动平均线图。虚线垂直线表示每个葡萄园的转色日期；实线垂直线表示每个葡萄园的收获日期；灰色实线在5月31日进行调整，这一天是根据定义计算MTA值的关键日期。

2.3. 收获与酿酒
从每个葡萄园中挑选出三个实验单元，每个单元包含20株生长状况均一的葡萄藤，作为三个生物学重复样本（n=3）用于后续分析。2018年季节中，当葡萄糖分达到23°Brix时进行收获，这一温度被认为是技术成熟的标志。每个实验单元收集30公斤的葡萄，并使用三个15公斤的塑料箱运输。葡萄被立即送往智利大学农业工业与酿酒学系的试验工厂进行加工：每批葡萄随机抽取2公斤样本并储存在-20°C下以备后续酚类成分分析；剩余的葡萄则用于酿酒过程。
具体步骤如下：首先将葡萄在2°C下冷藏24小时，然后使用Top 5去梗机（EnoVeneta，Vinicas SA）进行去梗和压榨。压榨后的葡萄放入25升的食品级塑料发酵罐中，并加入5克/升浓度的焦亚硫酸钾（K2S2O5）进行硫化处理。从每个重复样本中抽取50毫升样品，按照国际葡萄与葡萄酒组织的官方方法测定可溶性固形物（°Brix）、可滴定酸度和pH值。
发酵过程中，每两天使用Densito 30PX（Mettler Toledo，Precision）仪器监测一次密度和温度。每天轻轻压下发酵罐盖两次，直到葡萄汁密度达到1,010毫克/升。当密度连续两天保持不变且还原糖含量降至2克/升以下时，表明酒精发酵完成，通常发生在接种后约两周。
完成后，葡萄酒被倒入8升的食品级塑料容器中，再次加入5克/升的K2S2O5进行硫化处理，并在0°C下储存两周以促进酒石酸的稳定。随后向葡萄酒中加入1克/升的商业乳酸菌（Oenococcus oeni，Lalvin VP41?，Lallemand），并使用纸层析法监测苹果酸发酵的进程。苹果酸发酵完成后，再次对葡萄酒进行硫化处理（10克/升K2S2O5），装入750毫升的绿色玻璃瓶中，并用天然软木塞密封，储存在约16-18°C的地下酒窖中进行进一步分析。

2.4. 葡萄与葡萄酒的一般参数
从每个重复样本中随机选取50颗葡萄进行总体特性分析。使用WAS 220/C/2分析天平（Radwag?，LabTec）测量50颗葡萄的质量（m50），并通过量筒排水法测定体积（V50）。这些葡萄经过手工去皮后，用于计算皮部、种子和果肉的质量百分比（% m/m）。
葡萄酒的参数（包括酒精含量、可滴定酸度和pH值）按照国际葡萄与葡萄酒组织的官方方法进行分析。颜色强度和总花青素含量采用之前描述的实验协议（[22]），使用UV-Vis分光光度计（UV-1900，Shimadzu，Cromtek）进行测定。总酚类化合物的含量通过测量稀释样品在10毫米光程石英比色池中的OD280值来评估。[22]
结果以没食子酸当量表示，校准曲线是在相同条件下使用纯没食子酸作为外部标准建立的。
CIELab颜色坐标是通过在450纳米、520纳米、570纳米和630纳米处测量吸光度，并使用相同的分光光度计计算得出的。[23][24]

2.5. 果皮与种子的提取与分析
从冷冻样品中手工分离出每批葡萄的皮部和种子，然后按以下步骤进行分析：

2.5.1. 总皮部提取
将2克皮部组织与100毫升0.5 M甲醇/盐酸溶液（95:5，v/v）混合，并放入超声波浴器（Delta-K ultrasonic bath，WSLABS，Tecnigen）中加热30分钟。随后将该混合物置于-20°C下保存4小时。之后通过真空过滤分离皮部和液体，滤液同样储存在-20°C下，皮部再次经过提取处理，然后继续在-20°C下保存18小时。重复此过程直至皮部完全无色。所有得到的液体提取物合并后储存在-20°C下直至提取完成。最后将提取物用旋转蒸发器（Büchi Rotavapor R-210，配备Büchi B-491加热浴和Büchi V-300真空泵及Büchi I-300压力控制系统，Cientec）浓缩至干燥。干燥后的残留物用超纯水（Elga-Veolia PURELAB? Chorus 2，Arquimed S.A.）复溶至最终体积20毫升。
总酚类化合物含量通过测量1:100稀释后的样品在280纳米处的吸光度来测定。[22] 结果以没食子酸当量表示。为防止酚类化合物降解，水提取物立即冷冻以待进一步分析。
花青素谱系分析采用HPLC-DAD-MS技术，首先用0.1 M盐酸进行1:3稀释，然后按照[25]所述方法进行处理。对于黄酮类化合物的鉴定，将提取物与0.1 M盐酸以1:1比例稀释，使用Oasis MCX柱（Waters Corp., Milford, MA, USA）进行分离，并按照García-Estévez等人的方法[26]通过RP-HPLC-MS进行分析。

2.5.2. 类似葡萄酒的皮部提取
将5克皮部组织与100毫升类似葡萄酒的溶液（10% v/v乙醇，5克/升酒石酸，pH 3.5）混合，使用Stuart? SHM1/EURO匀浆器（Cole-Parmer?，Thermo Fisher Scientific Inc.）进行匀浆。调整体积至120毫升后，在MAXQ 2000 A-Class Barnstead Lab-Line（Thermo Fisher Scientific Inc.）中以200转/分钟的速度振荡2小时。随后在15°C下使用NuWind C200R多用途离心机（Nuwind，Nuaire，USA）以1500 g离心15分钟。上层清液通过0.45微米孔径的Immobilon?-MCE膜过滤器（Merck-Millipore，Merck S.A., Chile）过滤并储存在-20°C下备用。
类似葡萄酒的皮部提取物的总酚类含量采用与2.5.1节相同的方法测定。花青素谱系分析采用RP-HPLC-DAD技术，过滤前使用0.22微米孔径的注射器驱动过滤器。校准曲线以malvidin-3-O-glucoside作为外部标准制备。[27] 对于黄酮类化合物的鉴定，使用Sep-Pak C18柱（Waters Corp., Milford, MA, USA）进行分离，按照Fanzone等人的方法[28]进行分离和纯化。单体和寡聚体组分合并后浓缩至干燥，再用1毫升甲醇/水（1:1）重新溶解，然后注入Agilent 1200系列HPLC-DAD系统进行分析。[28] 商业纯化的儿茶素、表儿茶素和表儿茶素-3-O-没食子酸（Extrasynthese，Genay，法国）被用作定量标准。
皮部的可溶性多糖谱系通过高分辨率尺寸排阻色谱（HRSEC-RID）结合折射率检测法获得，方法与葡萄酒分析中的相同（第2.6节）。

2.5.3. 类似葡萄酒的种子提取
将3克种子与120毫升类似葡萄酒的溶液（10% v/v乙醇，5克/升酒石酸，pH 3.5）混合，并在Stuart? SHM1/EURO匀浆器（Cole-Parmer?，Thermo Fisher Scientific Inc.）中匀浆。调整体积至120毫升后，在MAXQ 2000 A-Class Barnstead Lab-Line（Thermo Fisher Scientific Inc.）中以200转/分钟的速度振荡2小时。之后使用NuWind C200R多用途离心机（Nuwind，Nuaire，USA）以1500 g离心15分钟。上清液通过0.45微米孔径的Immobilon?-MCE膜过滤器过滤并储存在-20°C下备用。
类似葡萄酒的种子提取物的总酚类含量采用与2.5.1节相同的方法测定。花青素谱系分析同样采用RP-HPLC-DAD技术。[27] 对于黄酮类化合物的鉴定，采用Sep-Pak C18柱（Waters Corp., Milford, MA, USA）进行分离。[27] 单体和寡聚体组分合并后浓缩至干燥，再用1毫升甲醇/水（1:1）重新溶解，然后按照Fanzone等人的方法[28]注入Agilent 1200系列HPLC-DAD系统进行分析。
皮部的可溶性多糖通过高分辨率尺寸排阻色谱（HRSEC-RID）结合折射率检测法获得，沉淀步骤与葡萄酒分析中的相同（第2.6节）。

2.6. 葡萄酒分析
葡萄酒中的总单宁含量采用Sarneckis等人[29]描述的无机纤维素沉淀法测定。总酚类含量、花青素谱系和黄酮类化合物的测定方法与类似葡萄酒的皮部提取物分析中的相同（2.5.2节）。葡萄酒中的可溶性多糖通过HRSEC-RID法结合冷酸化乙醇沉淀后进行测定。[28] 类黄酮化合物（包括反式白藜芦醇和皮塞苷）的浓度通过反相HPLC-DAD法结合液-液萃取后测定，[30] 并以反式白藜芦醇作为外部标准进行定量。

2.7. 统计分析
所有关于葡萄特性以及葡萄和葡萄酒化学成分的数据均以三个生物学重复样本的平均值±标准偏差表示。在确认数据符合正态性假设（Shapiro–Wilk检验）和方差齐性假设（Levene检验）后，使用Sidak事后检验（α = 0.05）来评估两个山谷间样本的统计差异。所有分析和图形表示均使用GraphPad Prism（版本10.5.0）软件完成。

3. 结果与讨论
3.1. 葡萄园的位置及其长期农业气候分类
表1展示了Maipo和Casablanca葡萄园的主要生物气候指数及其相应的分类（地图位置见图S1），基于40年的时间框架。根据平均生长季节温度（GST）、日照热指数（HI）和Winkler生长积温（WI），Maipo和Casablanca代表了两种不同的农业气候区。Maipo被归类为温暖气候区，而Casablanca则被视为寒冷或极寒冷气候区。
根据全球葡萄酒产区的GST、HI和WI值[31]，两种地点的差异更加明显。Casablanca的位置可以被认为是全球最寒冷的葡萄酒种植区之一，其气候比Mosel（德国）、Champagne地区（法国）或Willamette Valley（美国俄勒冈州）更冷（见图S2、HI图S3和WI图S4）。相比之下，Maipo被归类为温暖气候区，与Portugal的Douro Valley或Italy的Chianti地区相当（见图S2）。从HI（图S3）来看，Maipo比Spain的Sherry产区或California的Napa Valley更温暖；而从WI（图S4）来看，Maipo与Napa、Douro或Chianti相当。需要注意的是，这些生物气候指数是基于单个气象站的数据计算的，因此不能将结果推广到整个山谷。尽管文中简单地提到了Casablanca Valley和Maipo Valley，但这里特指本研究选择的两个葡萄园地点。
尽管Maipo Valley和Casablanca Valley在积温积累和平均季节温度方面存在显著差异，但它们都具有夜间温度极低的共同特征（见表1中的Cold Night Index，CI）。与其他全球葡萄酒产区相比，它们的CI值属于最低范围（见图S5）。Casablanca Valley靠近太平洋——由于洪堡洋流的影响，这一纬度的海洋性气候使得夜间温度较低。而Maipo Valley位于安第斯山脉的山脚下，有利于夜间降温。因此，表1中显示的3月份平均温度振幅（MTA）在Maipo几乎是Casablanca的两倍。

3.2. 季节条件与葡萄成熟度
从宏观角度来看，历史生物气候指数有助于对全球不同葡萄酒产区进行分类和比较，以及评估它们生产各种类型葡萄酒的潜力[31]。然而，特定生长季节的年度天气条件可能更能解释某一地点葡萄藤的生理行为。因此，本文计算了2018年Maipo和Casablanca两个地点的生物气候指数（GST、HI、WI、CI和MTA）（见表1）。2018年的大多数生物气候指数与其历史值一致，保持了相同的分类类别——卡萨布兰卡山谷的WI（葡萄酒产区指数）除外，该地区在2018年被归类为Ia区，而历史上它被归类为“太冷”的地方。这一结果并不意外，因为众所周知，人为气候变化正在影响平均气温，进而影响生物气候指数[32]。预计这一趋势将持续下去，这将对全球传统葡萄酒产区的葡萄种植适宜性产生影响[33]、[34]、[35]。然而，由于这一观察基于仅一个生长季节的生物气候指数，因此不能将卡萨布兰卡山谷在2018年的WI分类变化推广到其他季节。

众所周知，葡萄藤需要一定的热量才能达到不同的物候阶段[36]。因此，由于马伊波山谷和卡萨布兰卡山谷的天气条件不同，物候阶段的进展时间也不同（表2）。例如，马伊波山谷的葡萄在1月底达到成熟期，而卡萨布兰卡山谷的葡萄则在2月28日才达到成熟期。虽然收获并不被视为一个真正的物候阶段——因为它是由人类决定的——但两个葡萄园的葡萄在大约23°Brix时被收获，没有显示出显著的统计学差异（表2）。马伊波山谷从成熟到收获的时间为29天，而卡萨布兰卡山谷为78天（图S1），这与Cabodevilla等人的研究结果一致[37]，他们指出高温和低相对湿度会因增加果串的蒸腾作用而加速成熟过程。这些从成熟到收获的时间差异与两个山谷的热量积累不同有关，如图1中HI（热量指标）和WI指数的日累积度日所示。根据定义，HI在3月31日确定（实线垂直线）；然而，马伊波葡萄园在那时之前就已经收获，因此在收获时植物累积的度日数（虚线垂直线）低于2,100°C。相比之下，卡萨布兰卡葡萄园在季节后期收获，以使葡萄达到技术成熟度。因此，收获时的累积度日数接近1,500°C。对于WI指标，其定义为5月1日结束，马伊波葡萄园的累积度日数约为1,440°C，卡萨布兰卡葡萄园约为950°C。因此，如前所述，基于生物气候指数的分区并不一定是理解特定地点葡萄行为的可靠工具[36]，因为物候发展和成熟过程会受到季节内温度和天气条件的不同影响[38]、[39]。

表2. 马伊波山谷和卡萨布兰卡山谷的葡萄和葡萄酒特征。同一行中不同的字母表示两个山谷之间存在统计学差异（p<0.05）。

参数 | 马伊波山谷 | 卡萨布兰卡山谷 |
|-----------|--------------|-------------------|
| 成熟日期（90%） | 2018年1月31日 | 2018年2月28日 |
| 收获日期 | 2018年3月1日 | 2018年5月17日 |
| 产量（Kg/葡萄） | 1.3 ± 0.1 | 3.3 ± 0.8 |
| 葡萄含糖量（Brix） | 23.1 ± 0.3 | 22.8 ± 0.6 |
| 总酸度（g/L） | a | a |
| pH值 | 3.47 ± 0.03 | 3.00 ± 0.05 |
| 种子含量（m/m） | 50 | 68 |
| 果皮厚度（cm3） | 62 | 62 |
| 果皮占比 | 8.5 ± 0.7 | 7.4 ± 0.4 |
| 种子占比 | 4.2 ± 0.6 | 3.4 ± 0.3 |
| 果肉占比 | 87.3 ± 0.6 | 89.2 ± 0.6 |
| 酒精含量% | 15.1 ± 0.1 | 14.9 ± 0.5 |
| 总酸度（g/L） | a | a |
| pH值 | 3.42 ± 0.03 | 3.44 ± 0.06 |
| 颜色强度 | 16.6 ± 0.5 | 19 |
| L*值 | 36.6 ± 0.8 | 37 |
| T*值 | 57 | 57 |
| a*值 | 12.0 ± 0.5 | 5 |
| 花青素（mg/L） | 238 ± 9 | 284 |
| 卑酚苷含量（mg/L） | 800 ± 40 | 610 ± 50 |
| 可滴定酸度（以酒石酸当量计） |

除了整个季节中度日数的积累差异外，众所周知，成熟期间的夜间（最低）温度会显著影响葡萄的成分和质量，特别是可滴定酸度和pH值[40]。尽管两个葡萄园的CI（颜色指数）相似（表1）——因为该指数定义为南半球三月的平均最低温度——但由于收获日期的不同，最终成熟阶段（大约在收获前一个月）在马伊波山谷发生的最低温度更高（约12°C），而在卡萨布兰卡山谷约为7°C，如图2所示。由于两个山谷的夜间最低温度相似，但每日最高温度不同（见补充数据图S6），马伊波山谷的热幅度远大于卡萨布兰卡山谷，这可以从MTA值（表1）和整个季节的日热幅度（图3）中看出。de Rességuier等人[41]提出，高温度幅度与更高的葡萄酒品质有关，尽管这一假设存在争议，并未得到现有数据的充分支持。由于卡萨布兰卡山谷的最高温度较低且靠近太平洋，因此该地区的相对湿度在整个季节中较高，如图2所示，这可能会影响葡萄藤的生长，例如影响开花期间的授粉和受精[42]、由于果实形成后的气孔行为而影响光合作用和糖分积累[43]，或成熟期间的真菌病害压力[44]。因此，两个山谷之间尤其是在成熟后期相对湿度的差异也可能部分解释了葡萄和葡萄酒成分的差异。

3.3. 马伊波山谷和卡萨布兰卡山谷的葡萄和葡萄酒
卡萨布兰卡山谷的葡萄产量高于马伊波山谷（表2），尽管在果实大小（无论是质量还是体积）方面没有观察到差异。因此，产量差异可能与每株植物的果串数量或每个果串的果实数量有关。如先前报道的那样，温度升高会降低红葡萄品种的产量，影响坐果率（%）、果串重量和每个果串的果实数量[39]，这与本研究的结果一致。尽管在果实大小上没有观察到统计学差异，但当考虑组织比例（果皮、种子和果肉）时，只有果肉的比例显示出统计学差异，卡萨布兰卡葡萄的果肉比例较高，尽管这种差异不显著。这一结果与Bonada等人的研究一致[45]，他们报告在高温和水分不足的情况下，果肉的比例较低。较低的温度和较高的相对湿度可能与较低的果串蒸腾率有关，从而使得更多的水分保留在果肉中[37]。

由于收获决定是基于两个地区的葡萄都达到了相同的技术成熟度，因此在可溶性固体方面没有观察到统计学差异。此外，尽管两个山谷之间的最低温度不同，但可滴定酸度也没有观察到统计学差异，尽管卡萨布兰卡葡萄的pH值低于马伊波葡萄（表2）。尽管可滴定酸度没有差异，pH值的差异可能与马伊波葡萄中阳离子浓度较高有关——因此，果汁的缓冲能力较高——或者与具有不同pKa值的有机酸组成有关。然而，这些pH差异在酒精发酵过程中消失了，可能是由于酒石酸盐的沉淀，因为葡萄酒在酒精度、可滴定酸度或pH值方面没有显示出统计学差异。

图4A显示了果皮提取物中的总酚含量，包括总提取物和类葡萄酒提取物。根据结果，卡萨布兰卡果皮的酚含量较高，但提取率较低（卡萨布兰卡果皮为29%，马伊波果皮为41%），导致类葡萄酒提取物中的酚浓度相似。类葡萄酒种子提取物在两个山谷之间没有表现出统计学差异（图4B）。相反，最终得到的葡萄酒显示出统计学上的差异（p < 0.05），马伊波葡萄酒的总酚含量较低（图4C）。尽管卡萨布兰卡的成熟过程较慢，可能延长了酚类的生物合成时间，从而增加了葡萄酒中的总酚含量，但两个山谷之间葡萄酒的差异也可能归因于结构特征而非浓度本身。这种解释应考虑到用于确定总酚含量的方法（直接测量稀释样本在280纳米处的吸光度），因为酚类化合物的摩尔消光系数（ε）取决于它们的化学结构和聚合程度[46]。

关于表2中葡萄酒的颜色，亮度（L*）没有显著差异，而马伊波葡萄酒的红色较低（a*），黄色较高（b*），这可能与酒精发酵结束到葡萄酒分析之间的时间间隔较长有关。卡萨布兰卡葡萄酒的较高红色与其总（可漂白）花青素含量较高一致。相比之下，卡萨布兰卡葡萄酒的可沉淀单宁浓度较低。总体而言，两种葡萄酒都呈现出深色，马伊波葡萄酒带有更多的黄色调，单宁含量较高，可漂白的花青素含量较低（表2）。

3.4. 葡萄和葡萄酒中的游离花青素分析
使用RP-HPLC-DAD方法评估了葡萄果皮和葡萄酒中的花青素谱型，结果见表3（单个花青素）和图5（按化学家族分组）。考虑到果皮的总提取物，只有三种游离花青素表现出统计学差异：乙酰化氰苷-3-O-葡萄糖苷和乙酰化马拉维丁-3-O-葡萄糖苷在卡萨布兰卡果皮中含量较高，而咖啡酰化芍药花苷-3-O-葡萄糖苷在马伊波果皮中含量较高。对于类葡萄酒提取物，卡萨布兰卡果皮中含有更多的飞燕草素、矮牵牛素、芍药花苷和马拉维丁葡萄糖苷，而马伊波果皮中含有更多的氰苷、芍药花苷和马拉维丁的乙酰化葡萄糖苷。因此，卡萨布兰卡果皮在总提取物中表现出更高的单糖苷、乙酰化单糖苷和总花青素浓度，在类葡萄酒提取物中表现出更高的单糖苷和总花青素浓度。尽管卡萨布兰卡果皮中的花青素含量较高，但这些化合物在马伊波果皮中的提取率似乎更高，特别是乙酰化花青素，在类葡萄酒条件下几乎完全提取。两个山谷之间花青素提取率的差异可能与果皮细胞壁的降解有关，因为较高的温度会增强果胶的分解[47]、[48]，这解释了马伊波果皮较高的提取率。

表3. 果皮提取物和葡萄酒中的花青素谱型，以μg/100 g鲜重表示。结果以马拉维丁-3-O-葡萄糖苷当量表示。MV：马伊波山谷；CV：卡萨布兰卡山谷。不同的小写字母表示两个山谷在总提取物中的统计学差异（p<0.05）；不同的大写字母表示两个山谷在类葡萄酒提取物中的统计学差异（p<0.05）。不同的希腊字母表示不同葡萄酒山谷之间的统计差异（p<0.05）。

| 类型 | Delph-3-O-gluc | Cyan-3-O-gluc | Petun-3-O-gluc | Peon-3-O-gluc | Malv-3-O-gluc | Ac. Delph-3-O-gluc | Ac. Cyan-3-O-gluc | Ac. Petun-3-O-gluc | Ac. Peon-3-O-gluc | Malv-3-O-gluc |
|------------|------------------|------------------|------------------|------------------|------------------|------------------|------------------|------------------|------------------|------------------|------------------|
| 空细胞 | | | | | | | | | | | |
| 总提取物 | 196 ± 32 | 30 ± 50 | 32 ± 4 | B55 ± 9 | A2.9 ± 0.6 | β18 ± 1 | α | Cyan-3-O-gluc | 30 ± 9 | 28 ± 4 | 9 ± 1 | 11 ± 3 | 1.1 ± 0.3 | β2.06 ± 0.08 | α |
| 类似葡萄酒的提取物 | 200 ± 10 | 240 ± 40 | 43 ± 3 | B67 ± 5 | A5.6 ± 0.7 | β26 ± 1 | α | Peon-3-O-gluc | 168 ± 6 | 180 ± 10 | 46.0 ± 0.3 | B66 ± 9 | A3.6 ± 0.8 | β15.7 ± 0.6 | α |
| Anthocyanin | | | | | | | | | | | | |
| MVCV | | | | | | | | | | | |

图5. 马伊波山谷（红色）和卡萨布兰卡山谷（蓝色）的总果皮提取物（浅色条形图）及类似葡萄酒的果皮提取物（深色条形图）中的花青素浓度，以每100克鲜重的malvidin-3-O-葡萄糖苷毫克数表示。葡萄酒中的花青素浓度以mg/L的malvidin-3-O-葡萄糖苷表示。A：单糖苷；B：香豆素化花青素；C：乙酰化花青素；D：总花青素。条形上方不同的希腊字母表示总提取物之间的统计差异（p<0.05）；条形内不同的字母表示类似葡萄酒的提取物之间的统计差异（p<0.05）。

众所周知，高温会降低浆果中的花青素浓度，因为葡萄在夜间凉爽、白天温度适中的条件下（约25°C）花青素积累最佳，而高温则会减弱这种色素的形成[49]。马伊波山谷的成熟速度比卡萨布兰卡山谷更快，其最高温度分别约为30°C和20–25°C（图6S）；因此，这些气候条件解释了观察到的花青素含量差异。这些结果表明，由于人为气候变化，像马伊波山谷这样温暖的山谷正在失去生产优质红葡萄酒的部分潜力，而卡萨布兰卡山谷这样较凉爽的山谷则越来越适合生产这种类型的葡萄酒。

图6. 马伊波山谷（红色，左侧条形图）和卡萨布兰卡山谷（蓝色，右侧条形图）样本中的黄酮-3-醇化合物含量，其中浅色条形图代表总提取物，深色条形图代表类似葡萄酒的提取物，种子提取物和葡萄酒。黄酮醇图表显示了单体和低聚体黄酮-3-醇的总体含量。每个图表内不同的字母表示不同山谷之间的统计差异（p<0.05）。

关于葡萄酒中的花青素组成，卡萨布兰卡葡萄酒中所有单个花青素的浓度都较高，除了 caffeoylated peonidin-和 malvidin-葡萄糖苷以及 coumaroylated cyanidin-和 malvidin-葡萄糖苷，这些没有显示出统计学上的显著差异。因此，卡萨布兰卡葡萄酒中含有更高水平的所有花青素家族成员，即单糖苷、乙酰化单糖苷、香豆素化单糖苷和总花青素。这些发现与在较凉爽气候条件下生长的葡萄中观察到的更高花青素浓度一致，但也可能受到葡萄酒陈酿过程中花青素变化的影响，这会导致单体花青素形式的减少[50]。由于马伊波葡萄成熟较早，这些葡萄酒的生产时间也较早，因此花青素在分析前有更多时间在葡萄酒基质中进行化学转化，这也可能解释了它们的黄色程度更高（第3.3节）。

综上所述，这些结果表明，区域间花青素组成的差异不仅与气候对浆果代谢的影响有关，还与成熟动态和收获时的提取行为有关。马伊波等较温暖的条件可能会加速浆果发育并促进细胞壁分解，从而在酿酒过程中提高酚类化合物的提取率，而卡萨布兰卡等较凉爽的条件则可能有利于酚类化合物在浆果组织中的保留。这种酚类化合物保留与提取率之间的平衡可能不仅限于花青素，还可能影响其他黄酮类化合物，特别是黄酮-3-醇和原花青素，这些化合物在成熟过程中会发生重要的结构和组成变化。因此，不同山谷之间的气候差异为解释浆果生理如何调节葡萄和葡萄酒中的花青素和黄酮醇行为提供了有用的框架。

图6. 显示了葡萄和葡萄酒中果皮、种子和葡萄酒中的黄酮醇和原花青素含量。卡萨布兰卡的总果皮提取物含有更高浓度的单体黄酮醇、二聚体黄酮醇以及整个黄酮醇家族（包括单体、二聚体和较大的低聚体），而马伊波的总果皮提取物之间没有观察到差异。这些来自总果皮提取物的结果反映了果皮的总体黄酮-3-醇组成，因此可能与它们的季节性生物合成动态有关。补充数据（表S1）提供了这些化合物的详细概况。简而言之，马伊波的果皮中的儿茶素、没食子儿茶素、原花青素二聚体（B环二羟基形式）和三聚体的浓度低于卡萨布兰卡的果皮，这表明在较凉爽的气候条件下黄酮醇的生物合成较为活跃。对于类似葡萄酒的提取物，卡萨布兰卡的提取物中单体和没食子酸化黄酮醇的浓度较高，而马伊波的提取物中二聚体和总黄酮醇的含量较高。无论如何，卡萨布兰卡葡萄果皮中的黄酮醇水平似乎更高，但马伊波的黄酮醇提取率也更高，这也与花青素的情况类似（第3.4节），可能是由于温暖温度导致的浆果细胞壁结构降解。

关于果皮黄酮醇（及其聚合物——原花青素）对高温的反应趋势，没有明确的证据，因为文献中的结果存在矛盾[51]。然而，控制的体外实验表明，较低的温度可能有利于原花青素的积累，这一点得到了相应基因表达模式的支持[52]，这也与卡萨布兰卡果皮中较高的黄酮醇含量相符。重要的是，这些差异不应被解释为成熟过程中持续黄酮醇生物合成的证据。原花青素的积累主要发生在浆果早期发育阶段，并在转色期开始时基本完成。在‘Syrah’葡萄中，编码花青素还原酶（ANR）和白花青素还原酶（LAR）的基因表达在转色期后迅速下降，并在成熟期间无法检测到，表明此时新鞣质的合成基本上停止了[53]。因此，不同山谷之间的差异可能与卡萨布兰卡较长的草本期有关，在此期间黄酮醇合成活跃，但也可能是由于成熟后的修饰所致。在成熟过程中，单宁在液泡内发生结构演变，包括聚合物聚合和聚合程度的增加，这改变了单宁的反应性，而没有额外的合成[54]。这些结构变化可能影响分析结果，特别是基于沉淀的方法（如甲基纤维素测定法），其中较大且更具反应性的聚合物可能导致较高的表观单宁值。同时，氧化反应和单宁与果皮细胞壁成分之间的相互作用会逐渐改变单宁的溶解性和提取率[55]。[56]。因此，卡萨布兰卡果皮中测得的较高黄酮醇浓度可能反映了聚合物结构、氧化状态和细胞壁结合的差异，而不是成熟过程中酚类合成的增加。卡萨布兰卡较慢的成熟条件可能有利于聚合物的演化以及单宁在果皮组织中的保留，而马伊波较快的成熟条件可能促进收获时的更高提取率。

关于在类似葡萄酒条件下提取的种子黄酮化合物，图6中的结果显示，马伊波种子中所有研究组（单体、二聚体、总黄酮醇和没食子酸化单元）的提取率均较高。众所周知，从转色期开始，种子黄酮醇的提取率会由于聚合和氧化交联产物的形成而降低[57]，这些产物会强烈结合到细胞壁成分[58]。这些过程伴随着种子的木质化和脱水，导致颜色从绿色变为棕色[59]。因此，马伊波种子中观察到的更高提取率可能反映了葡萄更快成熟，减少了这些结构变化发生的时间，而卡萨布兰卡较慢的成熟则使种子达到更高的酚类成熟度，从而降低了提取率。由于种子来源的黄酮醇与苦味和涩味密切相关，马伊波加速的技术成熟可能会影响最终葡萄酒的感官平衡[60]。在葡萄酒中，马伊波样品中观察到二聚体、没食子酸化和总黄酮醇的浓度较高，而卡萨布兰卡葡萄酒中观察到单体黄酮醇的含量较高，这与它们较高的果皮浓度一致。马伊波葡萄酒中较高的总黄酮醇水平似乎主要是由于种子中的更高提取率，种子被认为是红葡萄酒中原花青素的主要来源[57]。这种较高的种子单宁提取率可能导致葡萄酒具有更高的苦味和更强的涩味。

综上所述，这些结果强调，马伊波和技术成熟之间的脱钩在马伊波比卡萨布兰卡更为明显，这可能是由于温暖条件下糖分积累更快所致。这种解释得到了马伊波葡萄中种子单宁提取率较高和果皮黄酮醇保留率较低的结合。正如对花青素（第3.4节）的观察，黄酮醇组成表明温暖条件可能会损害深色、结构平衡的红葡萄酒的生产，而卡萨布兰卡等较凉爽的环境可能有利于产生与优质红葡萄酒风格相对应的酚类谱型。然而，卡萨布兰卡的气候条件，以多云的早晨和较高的相对湿度为特征，可能会增加真菌病害的压力[2]。卡萨布兰卡葡萄酒中观察到的较高浓度的芪类化合物，包括反式白藜芦醇及其葡萄糖苷piceid（图4D），与增加的生物胁迫一致，因为这些化合物作为植物防御反应中的植物抗性物质[61]。

图7. 对马伊波和卡萨布兰卡果皮和葡萄酒中的可溶性多糖进行分析，支持了马伊波果皮中更高的提取率与果皮细胞壁结构更大程度分解之间关系的假设（GPC色谱图见补充图S7）。马伊波果皮释放出更高浓度的高分子量和中等分子量的可溶性多糖（分别为FA和FB），以及更高的总多糖水平，表明细胞壁的分解程度更大。与此观察一致，马伊波葡萄酒也显示出更高的总可溶性多糖浓度，尽管高分子量和中等分子量分数之间的差异没有统计学意义。葡萄酒中的可溶性多糖来源于葡萄细胞壁和酵母细胞壁，这可能部分解释了某些分子分数之间有限的差异。然而，先前的研究表明，从更成熟的葡萄中生产的葡萄酒通常含有更高浓度的可溶性多糖[62]，主要与葡萄来源的大分子相关，而非酵母来源的成分[63]。在这种情况下，马伊波样本中观察到的较高多糖浓度表明，尽管技术成熟和酚类成熟之间的脱钩较为明显，但果皮细胞壁的分解仍在进行。这表明，即使在酚类成熟的趋势不同，细胞壁降解和糖分的积累也可能保持紧密联系。葡萄细胞壁的分解与几种细胞壁修饰酶的协同作用有关，包括多聚半乳糖醛酸酶（PG），它们有助于果胶在浆果软化过程中的溶解。虽然PG的活性受发育调控，但其效率受温度条件的影响，在大约40°C时效率最高，在更高温度下稳定性较好[64]。因此，马伊波较温暖的白天条件可能加速了细胞壁降解过程的进展，从而促进了可溶性多糖的释放，并间接有利于酿酒过程中的酚类提取。从技术角度来看，马伊波（Maipo）葡萄酒中较高的多糖含量也可能对感官体验产生影响，因为已知葡萄酒中的多糖能够调节口感并降低涩味感[65]。因此，增加的多糖水平可能会部分抵消马伊波葡萄酒中来自种子的单宁所带来的较大影响，从而减轻其感官上的负面效应。

**图7：**
- 上图：根据GPC分析结果，马伊波（红色，左条形）和卡萨布兰卡（蓝色，右条形）两个山谷葡萄皮中的可溶性多糖含量。
- FA：高分子量组分；FB：中等分子量组分；FC：低分子量组分。
- 下图：根据GPC分析结果，马伊波（红色，左条形）和卡萨布兰卡（蓝色，右条形）两个山谷葡萄酒中的可溶性多糖浓度。
- FI：高分子量组分；FII：中等分子量组分；FIII：低分子量组分。
*号表示调整后的P值：(*) p<0.05；(**) p<0.01；(***) p<0.001；(***) p<0.0001。

**结论：**
本研究结果表明，在实际田间条件下，马伊波葡萄园中技术成熟度与酚类成熟度之间的脱钩改变了果实内酚类化合物的分布和可提取性。在快速成熟的条件下，葡萄皮中的花青素和黄烷醇浓度降低，但它们的可提取性增加；而由于收获时酚类成熟度不完全，种子中的黄烷醇可提取性较高。这种组合表明，加速的糖分积累限制了技术成熟度与酚类成熟度的同步发展，从而导致种子来源的单宁在葡萄酒成分中的占比增加。同时，马伊波葡萄皮和葡萄酒中较高的可溶性多糖浓度表明果实细胞壁的解体更为明显，这可能与温暖的气候条件或较大的温度变化有关。这种结构变化可能提高发酵过程中的酚类化合物可提取性，并部分调节不成熟单宁的感官影响。

尽管本研究仅涵盖了2018年这一个年份的数据，可能会限制结果在不同季节的代表性，但这些发现突显了果实组织中酚类物质的保留与收获时可提取性之间的生理权衡，这种权衡受到温暖和凉爽气候下不同成熟动态的影响。结果表明，马伊波山谷当前的气候条件可能通过加速技术成熟度而相对于酚类发展来说，越来越不利于优质红葡萄酒的生产。相反，像卡萨布兰卡这样的凉爽地区，尽管热量积累较少，但由于成熟过程较慢和收获时间较晚，可能有助于改善酚类物质的平衡；不过，较高的湿度可能会在果实发育期间增加病害压力。

**作者贡献声明：**
玛丽亚·特蕾莎·埃斯克里巴诺-巴伊隆（María Teresa Escribano-Bailón）：撰写、审稿与编辑、验证、资源获取、资金筹集。
阿尔瓦罗·佩尼亚-内拉（álvaro Pe?a-Neira）：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、验证、监督、资源获取、方法论设计、资金筹集、概念构建。
马丁·L·范佐内（Martín L. Fanzone）：撰写、审稿与编辑、方法论设计、概念构建。
圣地亚哥·萨里（Santiago Sari）：撰写、审稿与编辑。
马里奥娜·吉尔·伊·科蒂埃拉（Mariona Gil i Cortiella）：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、验证、项目管理、方法论设计、调查、资金筹集、数据分析、数据整理、概念构建。
伊格纳西奥·加西亚-埃斯特韦兹（Ignacio Gacía-Estévez）：撰写、审稿与编辑、验证、方法论设计、资金筹集。
克里斯蒂娜·阿尔卡尔德-埃翁（Cristina Alcalde-Eon）：撰写、审稿与编辑、验证、方法论设计。
马科·布斯塔曼特（Marco Bustamante）：撰写、审稿与编辑、软件开发、数据分析、正式数据分析、数据整理。

**利益冲突声明：**
作者声明不存在可能影响本文研究的财务利益或个人关系。资金来源未参与研究设计、执行、数据分析或结果传播的过程。

**数据可用性声明：**
支持本研究所有发现的数据均包含在本文及其补充材料中。原始数据可向通讯作者索取（需合理申请）。

**手稿准备过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明：**
在撰写过程中，作者使用了ChatGPT（OpenAI，GPT-5系列，2026年3月版本）来提高文本清晰度并检查语法和拼写错误。使用该工具/服务后，作者根据需要对内容进行了审阅和编辑，并对发表文章的内容负全责。

**资金支持：**
本研究主要得到了智利国家研究与发展机构（ANID）的支持，项目编号为REDI170088。此外，ANID还通过FONDECYT项目（编号1181142和1231751）提供了额外资金支持。此外，还获得了MCIN/AEI/10.13039/501100011033资助的PID2021-127126OB-C21项目以及欧洲区域发展基金（ERDF）“A way of making Europe”的支持。马里奥娜·吉尔·伊·科蒂埃拉还获得了西班牙科学、创新和大学部通过Ramón y Cajal奖学金（RYC2023-043484-I）提供的财政支持。