基于多肽的电化学免疫传感器用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白抗体的建立

《Sensors & Diagnostics》：Establishment of a peptide-based electrochemical immunosensor for detecting antibodies against the GP5 protein from the porcine reproductive and respiratory syndrome virus

　　

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是影响全球养猪业最具经济破坏性的疾病之一。尽管酶联免疫吸附试验（ELISA）是分析病毒抗体的金标准，但其存在样本运输和分析时间长以及成本高等局限性。PRRSV的快速血清学监测仍然是猪健康管理的关键挑战。免疫传感器是一种可行的诊断替代方案，能够立即定量确定抗原-抗体相互作用。电化学传感器的操作基于工作电极表面界面电子转移的变化，这些变化通过电化学阻抗谱（EIS）进行监测。在该方法中，使用氧化还原探针（[Fe(CN)6]3?/[Fe(CN)6]4?）来评估电极界面的电荷转移电阻（Rct）。分析物浓度的变化导致电极界面特性的改变，特别是在抗体结合等生物分子相互作用后。这些相互作用阻碍了电子转移，导致Rct增加。因此，分析信号基于Rct变化（ΔRct）与目标分析物浓度之间的相关性，通过校准图实现定量分析。本研究的目标是建立一种基于多肽的电化学免疫传感器，用于定量检测抗PRRSV抗体。研究人员利用EIS、GP5-B肽和酪蛋白对金电极功能化进行了表征。Balb/c小鼠按照对照组、BSA免疫组和GP5-B肽免疫组进行免疫。对照猪无猪呼吸道疾病复合体（PRDC）且未接种疫苗。接种猪按照制造商的说明注射商业Ingelvac疫苗，研究中还包括自然感染猪。使用ELISA和免疫传感器测量抗体。该免疫传感器识别抗原-抗体相互作用，检测限（LOD）为6 ng mL?1，批内变异系数（CV）重复性为5.05%，批次间重现性CV为4.08%。此外，其灵敏度为100%，特异性至少为93%。综合所有数据，与通过ELISA检测免疫球蛋白G相比，所提出的基于多肽的电化学免疫传感器在检测抗PRRSV抗体方面具有重要价值。这些结果表明了该生物传感器在猪血清学诊断中的可行性。

论文解读：基于GP5多肽的电化学免疫传感器在PRRSV抗体检测中的应用

研究背景与动机

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的，对全球养猪业造成巨大经济损失。目前，酶联免疫吸附试验（ELISA）虽是血清学检测的金标准，但存在依赖专业实验室、耗时较长及成本较高等问题，难以满足现场快速检测（POCT）的需求。相比之下，电化学免疫传感器因其高灵敏度、快速响应及便携性，在兽医诊断领域展现出巨大潜力。特别是基于多肽的生物传感器，相较于全蛋白，具有稳定性高、合成成本低且易于在电极表面定向固定的优势。鉴于PRRSV的主要免疫原性糖蛋白GP5含有诱导中和抗体的关键B细胞表位，研究人员假设源自GP5的合成肽可作为电化学检测抗PRRSV抗体的稳定识别元件，从而开发了一种基于GP5衍生肽的电化学阻抗免疫传感器，并对其在实验鼠免疫及接种/自然感染猪群中的性能进行了评估。

关键技术方法

研究人员采用的主要技术方法包括：首先，化学合成了源自PRRSV型GP5蛋白的GP5-B多肽。其次，利用硫基乙酸（TGA）在金涂层丝网印刷电极（AuSPEs）上形成自组装单层（SAM），并通过N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）化学法将GP5-B肽共价固定在电极表面，随后用酪蛋白封闭非特异性位点。检测原理基于电化学阻抗谱（EIS），利用铁氰化钾/亚铁氰化钾（[Fe(CN)₆]^3?/[Fe(CN)₆]^4?）氧化还原探针对电极界面电荷转移电阻（R_ct）的变化进行监测。样本队列来源包括：免疫GP5-B肽的Balb/c小鼠血清、接种商业Ingelvac PRRS MLV疫苗的仔猪血清、自然感染PRRSV的猪血清以及相应的阴性对照血清。

研究结果

小鼠免疫与ELISA定量

研究人员先前已报道了合成GP5-B肽在猪体内的免疫原性。为了进行比较，小鼠通过马来酰亚胺连接子用BSA偶联的GP5-B（GP5-B–BSA）进行免疫。通过间接ELISA定量抗体滴度。结果显示，免疫GP5-B的小鼠抗体反应显著增加，在免疫后15天（dpi），肽特异性IgG水平较基线显著上升，并在30和45 dpi时保持高水平。这表明GP5-B能有效引发强烈的体液免疫反应，适合作为抗体检测的识别元件。

免疫传感器的制备与表征

利用EIS对免疫传感器的制备过程进行了逐步表征。裸AuSPE电极的R_ct值为62 Ω。经TGA修饰后增至90 Ω，固定GP5-B肽后进一步升至150 Ω，表明表面修饰成功。经酪蛋白封闭后，R_ct增至约400 Ω。对30个独立制备的电极进行的重复性评估显示，批内CV为5.05%，批间CV为4.08%，证明了传感器制备的良好重现性。使用非免疫小鼠、猪和兔血清进行特异性评估，结果显示阻抗响应与基线值相当，表明非特异性结合极低。

免疫传感器的分析性能

研究人员测量了不同浓度抗GP5-B抗体的电荷转移电阻。随着血清抗体浓度从0增加至42 ng mL^?1，R_ct逐渐增加，ΔR_ct与抗体浓度在0-42 ng mL^?1范围内呈线性相关（R²= 0.9541）。通过与ELISA结果的比较，两者显示出很强的一致性（R²= 0.9636）。该免疫传感器的检测限（LOD）确定为6 ng mL^?1。

小鼠血清中的抗体检测

将免疫传感器对GP5-B免疫小鼠血清的响应与对照组（完整动物对照和BSA免疫组）进行比较，结果显示GP5-B免疫组的R_ct值显著高于对照组和BSA免疫组，证实了测量的阻抗变化源于特定的抗原-抗体相互作用。

猪血清中的抗体检测

将免疫传感器对自然感染和接种猪的抗体响应与对照猪（无PRDC且未接种）进行比较。结果显示，感染猪和接种猪的ΔR_ct值均显著高于对照组，表明该生物传感器能够可靠地检测由自然感染或免疫产生的循环抗PRRSV抗体。

诊断性能评估

通过受试者工作特征（ROC）曲线分析确定临界值。该生物传感器表现出100%的灵敏度和93.33%的特异性，证明了基于GP5-B探针的免疫传感器在检测抗PRRSV抗体方面的实际应用可行性。

结论与讨论

综上所述，金涂层丝网印刷电极表现出稳健的分析性能，适用于抗体检测平台。该免疫传感器仅需少量样本，比传统抗体检测方法成本更低且结果即时。校准曲线显示分析物依赖性线性，LOD为6 ng mL^?1。该免疫传感器选择性检测抗PRRSV抗体，不受其他物种血清蛋白的干扰。生物传感器的灵敏度为100%，特异性为93.3%。该传感器成功应用于小鼠模型和农场猪的特异性抗体检测，代表了检测PRRSV抗体、助力生物安全和动物健康的有用工具。由于多肽比蛋白质化学稳定性更高，基于多肽的识别元件能够改善传感过程。尽管初步结果令人鼓舞，但仍需广泛的现场验证研究以确认不同流行病学条件下的诊断性能。总体而言，该研究提出的GP5衍生肽免疫传感器代表了快速检测PRRSV抗体的一种有前途的替代方案，结合了分析灵敏度、特异性和操作简便性，有助于在养猪生产系统中进行现场血清学监测。