电压门控钠通道NaV1.7被虎纹捕鸟蛛毒素HWTX-I抑制的结构基础

《Journal of Biological Chemistry》：Structural Basis for Inhibition of the Voltage-Gated Sodium Channel NaV1.7 by the Tarantula Toxin HWTX-I

　　

摘要 电压门控钠通道NaV1.7是开发新型强效特异性镇痛药的关键治疗靶点。HWTX-I是从虎纹捕鸟蛛（Ornithoctonus huwena）毒液中分离的多肽，已知可抑制N型钙通道，且已被证实可阻断背根神经节（DRG）神经元中对河豚毒素敏感（TTX-S）的NaV通道。本研究中，研究人员发现HWTX-I可强效抑制NaV1.7电流，半数抑制浓度（IC50）为40.6±16.1 nM，但不显著改变NaV1.7稳态激活与失活的电压依赖性。丙氨酸扫描突变显示，K3、V5、F6、P11、N14、E15、W28和K30残基是HWTX-I抑制NaV1.7活性的关键位点。此外，定点突变分析表明，HWTX-I结合于NaV1.7结构域II（DII）的S3-S4连接区，NaV1.7的D816K突变可显著削弱HWTX-I与NaV1.7的相互作用效力。分子动力学（MD）模拟结合自由能分解分析确定，NaV1.7-D816与HWTX-I-K3是结合的主要能量贡献者，这与长程静电导向作用而非持续短程盐桥的作用机制一致。综上，本研究阐明了HWTX-I与NaV1.7结合的结构基础，鉴定了该毒素的药效团，为多肽毒素与NaV1.7的相互作用提供了重要见解，可为未来开发特异性、安全、高效的NaV1.7抑制剂用于镇痛提供指导。

该研究针对疼痛这一重大公共卫生问题展开，电压门控钠通道Na_V1.7是痛觉信号产生的核心调控分子，其功能增益或缺失突变分别与遗传性疼痛疾病及先天性无痛症直接相关，是极具潜力的镇痛药物靶点。目前已发现的天然多肽类Na_V1.7调节剂虽具有高活性与亚型选择性，但HWTX-I此前仅被报道抑制N型钙通道，其对Na_V1.7的作用机制尚未明确，限制了该毒素的药物开发价值。研究人员通过开展HWTX-I对Na_V1.7的抑制作用机制研究，明确了其结合位点与作用模式，为基于该毒素的镇痛药物优化提供了结构基础，相关成果发表于《Journal of Biological Chemistry》。

研究采用的关键技术方法包括：利用全细胞膜片钳技术检测不同Na_V亚型及hERG通道的电流变化，评估HWTX-I的亚型选择性与电生理效应；通过固相多肽合成与氧化折叠制备野生型及突变型HWTX-I多肽，结合圆二色谱验证突变体的二级结构稳定性；采用丙氨酸扫描突变与定点突变技术鉴定毒素及通道的关键功能残基；借助分子对接与200 ns分子动力学模拟结合MM/GBSA自由能分解方法，解析毒素-通道复合物的动态相互作用机制。

研究结果如下：

1. 1.
   HWTX-I强效抑制Na_V1.7通道
   序列比对显示HWTX-I属于蜘蛛毒素NaSpTx家族1，具有保守的抑制剂胱氨酸结（ICK）与C端“WCK”基序。全细胞膜片钳实验表明，100 nM HWTX-I可完全抑制Na_V1.7电流，对Na_V1.2、Na_V1.3、Na_V1.6有浓度依赖性抑制，IC₅₀分别为108.2±33.5 nM、228.7±30.2 nM、187.8±52.9 nM，但对Na_V1.4、Na_V1.5、Na_V1.8无显著影响，且1 μM浓度下不作用于心脏hERG通道，显示出对Na_V1.7的高选择性。
2. 2.
   HWTX-I对Na_V1.7门控动力学的影响
   0.5 μM HWTX-I对Na_V1.7的抑制作用在30 s内达到稳定，洗脱3分钟后抑制效应无明显恢复，表现为不可逆抑制。50 nM HWTX-I可降低所有测试电压下的电流幅度，但不改变激活起始电位、反转电位及稳态激活与失活曲线，表明其不影响离子选择性及门控电压依赖性。
3. 3.
   HWTX-I突变体对Na_V1.7抑制效应的影响
   丙氨酸扫描突变显示，HWTX-I的功能残基分为两个药效团簇：静电簇中E15A、K30A突变使抑制活性分别降低82.9倍与76.6倍，K3、N14、P11突变也显著降低活性；疏水斑中W28A突变导致活性几乎完全丧失，V5A、F6A、W31A突变使活性降低6.5-10.9倍。圆二色谱证实突变体二级结构与野生型相似，活性下降源于结合界面相互作用受损而非结构破坏。
4. 4.
   HWTX-I结合于Na_V1.7的DII S3-S4连接区
   构建Na_V1.7/Na_V1.8 DII S3-S4嵌合通道后，10 μM HWTX-I对其几乎无抑制作用，活性较野生型降低300倍以上。定点突变显示，Na_V1.7的D816K突变使500 nM HWTX-I仅能抑制约50%的电流，证明D816是结合关键位点。
5. 5.
   HWTX-I与Na_V1.7的分子对接与动力学模拟
   分子对接显示通道酸性残基与毒素碱性残基存在静电互补，疏水残基形成潜在接触界面。200 ns分子动力学模拟中，复合物RMSD稳定在较低水平，毒素半径 of 陀螺（Rg）逐渐减小，溶剂可及表面积（SASA）降低，表明结合过程中结构更紧凑且疏水区域被通道包裹。自由能分解确定Na_V1.7-D816与HWTX-I-K3是主要结合能贡献者，二者以长程静电导向作用为主，W28等残基通过疏水相互作用稳定结合构象，P11通过限制肽骨架构象间接发挥作用。

讨论部分指出，该研究首次系统阐明HWTX-I对Na_V1.7的抑制机制，其双药效团模式与同家族毒素HWTX-IV、HNTX-III一致，验证了其在NaSpTx家族1中的分类。Na_V亚型间D816位点的氨基酸差异（Na_V1.7为天冬氨酸，Na_V1.2/1.3/1.4为天冬酰胺，Na_V1.5为精氨酸）是其亚型选择性的结构基础。HWTX-I对心脏与骨骼肌钠通道无作用、不抑制hERG通道且具有不可逆抑制特性，是极具潜力的镇痛先导化合物，所鉴定的关键残基可为后续理性药物设计提供依据。研究结论强调，HWTX-I通过D816-K3介导的静电作用结合于Na_V1.7的DII电压感受器，抑制通道电流而不改变门控特性，该机制为多肽类Na_V1.7抑制剂的开发提供了重要理论支撑。