基于NAD(P)H依赖性还原酶活性的偶联酶级联高灵敏度筛选策略

《Journal of Biological Chemistry》：A high sensitivity strategy to screen NAD(P)H-dependent reductase activity by coupled enzyme cascade

　　

酶作为生物催化工具，在“绿色化学”中扮演着关键角色。氧化还原酶因其能够介导广泛的化学转化（如不对称氢化、氧化、羟基化、环氧化或Baeyer-Villiger氧化）中的关键电子转移（氧化还原）步骤而特别有用，这些转化可能是化学家无法通过常规（非生物）合成方法获得的。筛选氧化还原酶活性对于从自然界中鉴定有用的生物催化剂以及通过定向进化工程化新型催化剂至关重要。许多有价值的氧化还原酶依赖于NAD(P)H作为电子供体辅底物（或反之依赖于NAD(P)+作为电子受体），检测其活性的常用方法是监测NAD(P)H转化为NAD(P)+（或反之）时在340 nm处吸光度的变化。该方法的有限灵敏度对检测极低水平的氧化还原酶活性提出了挑战，当天然酶对目标氧化还原反应的反应速率可能较慢时，这会使将其工程化为改进的生物催化剂变得非常困难。在此，研究人员报道了一种基于荧光的偶联酶级联系统，该系统能够以比传统基于吸光度的测定法高出数个数量级的灵敏度来检测NAD(P)H依赖性的酶催化还原。在将NAD(P)H从NAD(P)+再生的同时，偶联的酶级联触发荧光标记探针的裂解，释放出强荧光信号。这使得研究人员能够检测到非常低水平的特定氧化还原酶活性，并利用该高通量筛选测定法通过定向进化加以放大。

酶工程的最新进展使得绿色化学、生物加工、生物治疗、诊断和制药领域的新型和改进生物催化剂得以开发。通过定向进化优化酶功能的一个关键挑战是高效筛选大型变异文库以识别有益突变，这需要能够将表型与基因型联系起来的高通量测定法。氧化还原酶是具有广泛工业应用价值的商业酶，能够催化氧化反应，在生物燃料、食品农业、药物精细化学品合成和环境生物修复中发挥关键作用。其中，烯还原酶作为NAD(P)H依赖性氧化还原酶的一个亚群，通过其在工业生物催化中的作用展现了工业潜力，例如旧黄酶（Old Yellow Enzymes, OYEs）因能催化电子缺陷烯烃的不对称氢化而引起广泛关注。

尽管氧化还原酶具有广泛的实用价值，但通过酶工程对其进行优化具有重要意义。现有的氧化还原酶活性筛选策略主要涉及比色检测和吸光度光谱法。对于利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸作为辅因子的氧化还原酶，通常通过测量340 nm处的吸光度变化来确定NAD(P)H的浓度，从而评估酶活性。然而，测量吸光度降低提供的灵敏度有限，不足以检测非常低水平的活性，尤其是在背景信号可能相对较高的情况下。虽然已有荧光或发光偶联测定法用于检测催化电子从底物转移到NAD(P)⁺的氧化酶反应，但缺乏设计用于检测将电子反向转移的NAD(P)H依赖性酶催化还原的偶联酶系统。

为应对这一挑战，研究人员开发了基于荧光的偶联酶级联系统，以比传统基于吸光度的测定法高得多的灵敏度检测NAD(P)H依赖性酶催化的还原反应。该系统利用四种下游反应步骤与NAD(P)H依赖性氧化还原反应相偶联。由氧化还原酶催化反应产生的NAD(P)⁺被用于触发级联反应：首先，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）催化甘油醛-3-磷酸（G3P）和无机磷酸盐（P_i）转化为1,3-二磷酸甘油酸，同时将NAD(P)⁺再生为NAD(P)H；其次，磷酸甘油酸激酶（PGK）催化ADP转化为ATP，磷酸基团从1,3-二磷酸甘油酸转移，生成3-磷酸甘油酸；第三步，β-葡萄糖苷激酶（BglK）消耗ATP将4-甲基伞形酮β-D-葡萄糖苷（MU-Glc）磷酸化为4-甲基伞形酮6-磷酸-β-D-葡萄糖苷（MU-6P-Glc），并释放ADP；最后，6-磷酸-β-葡萄糖苷酶（BglA-2）识别并水解MU-6P-Glc，释放出葡萄糖-6-磷酸和荧光产物4-甲基伞形酮。级联中使用的酶分别来源于大肠杆菌K-12（GAPDH和PGK）、肺炎克雷伯菌（BglK）和肺炎链球菌TIGR4（BglA-2），均在大肠杆菌BL21(DE3)中重组表达。

在关键技术方法方面，研究人员采用了基于荧光信号的连续偶联酶级联测定法，并将其与传统基于吸光度的测定法进行比较。通过计算Z'因子（Z′）和信噪比（S/N）来评估测定法的统计效能和灵敏度。研究对象包括纯化的乳酸脱氢酶（LDH）和旧黄酶II（OYE2），以及用于检测NADP⁺的GAPDH双突变体（G188T+P189K）。此外，还探索了通过果糖-1,6-二磷酸（FBP）原位生成G3P以降低成本，以及使用Jericho Blue（JB-Glc）替代4-甲基伞形酮以适应液滴微流控系统的策略。

研究结果首先验证了下游偶联酶级联对释放的NAD⁺的检测能力。实验表明，当NAD⁺与其他辅底物和偶联酶共同存在时，组合反应确实能产生可检测的荧光输出，而在缺少NAD⁺、ADP、G3P或混合偶联酶的对照组中未观察到明显的荧光。这表明级联反应按设计运行，并且依赖于NAD⁺通过一系列消耗G3P和P_i的反应触发荧光释放。

随后，研究人员比较了基于吸光度的测定法和基于荧光的偶联测定法对NADH依赖性氧化还原酶（乳酸脱氢酶；LDH）的检测效果。以丙酮酸为底物对LDH进行系列稀释测试，结果显示荧光测定法表现出更高的灵敏度。通过计算Z'值发现，使用偶联酶级联达到优秀测定标准（Z′ ≥ 0.5）所需的LDH浓度（0.156 μg/mL或0.66 mU/mL）远低于传统吸光度测定法（5 μg/mL或21 mU/mL），差异达32倍。在可接受测定标准（Z′ > 0）下，差异更是达到了64倍。此外，由于NADH在级联中被GAPDH循环利用，该荧光测定法在低浓度NADH条件下依然有效，显示出比传统方法更广泛的辅因子浓度适应性。

针对NADPH依赖性氧化还原酶的检测，研究人员利用了突变的大肠杆菌GAPDH酶（GapA G188T+P189K），该酶具有NAD⁺/NADP⁺双重特异性。实验证实，与野生型相比，该突变体在使用NADP⁺触发下游级联反应时释放的荧光显著增加，虽然仍偏好NAD⁺，但其宽松的特异性允许其利用NADP⁺进行级联反应，从而实现了对NADPH依赖性氧化还原酶的灵敏检测。

进一步，研究人员比较了基于吸光度的测定法和基于荧光的偶联测定法对NADPH依赖性氧化还原酶（旧黄酶II；OYE2）的检测效果。初始测试中，由于GapA G188T+P189K对NADP⁺的活性低于对NAD⁺的活性，导致GAPDH催化的反应成为限速步骤。通过将GapA G188T+P189K的浓度提高十倍至200 μg/mL，解决了这一瓶颈，显著提高了荧光信号和灵敏度。优化后的荧光测定法在检测OYE2活性时，达到优秀测定标准的酶浓度阈值比传统吸光度法低64倍，信噪比也高出数个数量级。此外，利用表达OYE2的大肠杆菌粗裂解液进行的实验也证实了该策略能够从细胞提取物中检测出酶活性。

为了经济化测定策略，研究人员进行了适应性调整。一方面，通过在级联反应中引入果糖二磷酸醛缩酶（FBA）和丙糖磷酸异构酶（TPI），实现了从廉价的果糖-1,6-二磷酸（FBP）原位生成昂贵的G3P，将单次测定成本从0.55加元显著降低至0.17加元。另一方面，考虑到微型化和液滴微流控的需求，研究人员用Jericho Blue葡萄糖苷（JB-Glc）替代了易泄漏的4-甲基伞形酮底物，证实了其可以在级联反应中正常运作并产生良好的测定特性，为未来在乳液液滴系统中进行筛选奠定了基础。

综上所述，该研究开发了一种基于荧光的偶联酶测定法，用于检测NAD(P)H/NAD(P)⁺依赖性氧化还原酶的活性。通过构建一个最终生成强荧光信号的酶级联平台，取代了传统的NAD(P)H吸光度检测，该策略在低酶浓度下表现出了卓越的性能和灵敏度。该研究最初对LDH等NADH依赖性氧化还原酶有效，并通过引入能够识别NAD⁺和NADP⁺的双重特异性工程化GAPDH，成功将该系统扩展至OYE2等NADPH依赖性酶的检测。为了进一步提高高通量筛选的经济性和可扩展性，研究人员通过原位生成G3P降低了试剂成本，并引入了适用于液滴系统的亲水性荧光团Jericho Blue。这些增强措施使得该荧光偶联酶级联成为一种多功能、经济高效且可扩展的平台，适用于氧化还原酶的定向进化。尽管该测定法无法区分耦合与解耦的NAD(P)H氧化（例如通过分子氧还原产生的背景信号），但其高灵敏度仍然为检测即使是低水平的活性改善提供了有力工具。这项工作为酶发现和优化的高通量筛选提供了一个强有力的新选择。