《Journal of Biological Chemistry》：Iron-sulfur cofactors in nucleic acid metabolism and protein synthesis: assembly, delivery, and putative roles in cellular and viral systems
编辑推荐：
铁硫簇（Iron-sulfur clusters, ISCs）由铁（Fe）和无机硫（S）组成，是存在于所有生命领域及某些病毒中的古老辅因子。在过去的三十年中，胞质和核内的铁硫蛋白已成为DNA复制与修复机制、端粒维持途径、转录过程、细胞周期调控以及蛋白质合成不可
铁硫簇（Iron-sulfur clusters, ISCs）由铁（Fe）和无机硫（S）组成，是存在于所有生命领域及某些病毒中的古老辅因子。在过去的三十年中，胞质和核内的铁硫蛋白已成为DNA复制与修复机制、端粒维持途径、转录过程、细胞周期调控以及蛋白质合成不可或缺的组成部分。最近，铁硫簇在病毒蛋白中被发现，包括SARS-CoV-2复制与转录复合体（Replication and transcription complex, RTC）的多个组件，该复合体共含有七个经实验验证的铁硫辅因子。细胞和病毒复制机制中共存多种依赖铁硫簇的酶，这引发了一些基本问题，即这些金属辅因子如何协调基因组维持、复制以及宿主-病毒相互作用。本文提供了已知哺乳动物核质铁硫蛋白的清单，讨论了铁硫簇的获取机制，探索了铁硫簇在细胞和病毒复制复合体中的潜在作用，并强调了我们在理解大型多亚基组装体中铁硫蛋白的铁硫簇递送、配位和功能方面的关键知识缺口。
论文主体内容总结
引言与背景
铁硫簇是古老且进化保守的辅基，被认为在40多亿年前地球生命起源中发挥了关键作用。它们存在于所有三个生命领域，并在近年来被发现存在于病毒中。铁硫簇已知具有多种功能，包括促进电子转移、催化涉及有机自由基的反应、稳定蛋白质结构以及感知细胞内的氧和铁水平等。最常见的结构是菱形的[Fe2S2]和立方烷型的[Fe4S4]，通常通过半胱氨酸或半胱氨酸与组氨酸残基的组合与蛋白质的多肽链连接。历史上，由于铁硫簇易受氧化损伤，导致铁释放并通过芬顿化学产生有害活性氧，因此人们认为它们很少参与DNA复制/修复和RNA代谢过程。然而，多年来，大量研究揭示了大量参与DNA复制/修复和RNA转录/修饰的蛋白质结合铁硫簇。这种进展得益于人们认识到铁硫簇在暴露于环境氧水平（21%）或其他氧化剂时会迅速降解，从而促使实验室采用保护其完整性的操作规范，以促进先前未被识别的铁硫蛋白的鉴定。本综述聚焦于哺乳动物细胞中铁硫簇的生物发生和转运，这些过程并行发生，在线粒体基质和胞质/核区室中产生新生簇。本文总结了线粒体基质中的主要铁硫簇组装途径如何在胞质/核区室中存在对应的对应物，后者使用与线粒体铁硫簇合成基本相同的构件生成铁硫簇。由于关于线粒体基质中的铁硫簇组装过程和线粒体铁硫蛋白已有大量文献，本文重点讨论胞质和核铁硫蛋白参与的主要细胞过程，探索铁硫簇在细胞和病毒复制复合体中的潜在作用，并强调可能推动我们理解铁硫簇在大型线粒体外多亚基机器中的递送、配位和功能的关键问题。
当前知识 - 在DNA/RNA代谢和蛋白质合成中重要的铁硫蛋白
每个生物体，从最简单的细菌到最复杂的人类，其基因组中都编码了独特的蓝图。为了发挥最佳功能，细胞必须保护其遗传指令的完整性，免受各种形式的损伤。此外，基因组复制和细胞分裂带来了进一步的挑战。为了确保保真度，多种蛋白质协同工作以忠实复制DNA，并检测、传递信号和修复任何损伤。当这些机制失效时，会发生基因组不稳定性——这是癌症的一个标志。随着对维持基因组完整性所需分子机制的生化学表征研究的开展，一个意想不到的主题出现了：许多对DNA复制和修复至关重要的酶是铁硫蛋白，其中连接的铁硫辅因子对其功能至关重要。这一认识推翻了早期的假设，即这些蛋白质的主要金属配体是锌。迄今为止，许多真核DNA复制和修复蛋白，如B家族DNA聚合酶α、δ、ε和ζ，DNA引物酶大调节亚基PRIM2，RNA聚合酶III，以及DNA解旋酶如XPD（亦称ERCC2）、RTEL1、FANCJ（亦称BRIP1或BACH1）、DDX11和DNA2，已知都结合铁硫簇。虽然这些蛋白质中铁硫辅因子的确切功能尚未完全了解，但它们的缺失会导致蛋白质稳定性下降和功能受损。碱基切除修复途径中至关重要的糖基化酶家族的DNA修复酶也被发现连接铁硫簇，并且铁硫簇配位半胱氨酸或簇结合域的氨基酸取代会导致蛋白质不稳定并损害酶功能。与其功能重要性一致，DNA解旋酶和糖基化酶（如XPD、FANCJ、RTEL1、DDX11、NTHL1和MUTYH）铁硫结构域中的致病性变异与多种癌症和DNA修复活性受损有关。
除了基因组维持，铁硫簇也在参与其他基本胞质/核细胞过程的蛋白质中被发现。例如，铁硫簇存在于蛋白质合成机制的组件中，以及参与有丝分裂期间染色体分离的马达蛋白中。两个铁硫蛋白DPH1和DPH2参与diphthamide生物合成，产生真核延伸因子2独特的翻译后修饰，而铁硫蛋白ABCE1在核糖体组装和再循环中发挥作用。驱动蛋白-4家族微管马达蛋白成员，如KIF4A以及通过序列相似性推断的KIF4B，也被报道连接铁硫簇，尽管需要更多证据来定义铁硫簇的类型和连接残基。一个特别大的铁硫蛋白类别是自由基S-腺苷-L-甲硫氨酸酶。在这些酶中，[Fe4S4]辅因子与三个半胱氨酸残基和S-腺苷甲硫氨酸连接，在氧化态之间循环以生成高反应性的5'-脱氧腺苷自由基，从而驱动能量上具有挑战性的化学反应。绝大多数自由基S-腺苷-L-甲硫氨酸酶存在于细菌和古菌中，而迄今为止在人类中只发现了八种。人类自由基S-腺苷-L-甲硫氨酸酶的功能丧失变异与多种疾病状态相关。鉴于铁的固有反应性，铁硫簇存在于许多这些酶中可能看似矛盾。由于铁硫簇的生物发生和递送依赖于大型多蛋白复合物耗能的活动，铁硫簇很可能履行着尚未被完全理解且不能被氧化惰性金属辅因子（如锌，通常主要提供结构支持）替代的功能。
病毒蛋白中的铁硫簇
在过去的二十年中，越来越多的证据表明，几种病毒编码的蛋白质整合了铁硫簇，这突出了病毒复制策略与宿主铁硫簇生物发生途径之间意想不到的接口。在病毒系统中，铁硫辅因子似乎支持涉及核酸代谢的酶功能，包括病毒基因组复制、解旋酶活性和RNA合成。由于病毒缺乏专用的铁硫簇生物合成机制，病毒蛋白必须从宿主的铁硫簇组装和运输系统中获取其辅因子，这表明成功的感染可能部分取决于病毒蛋白获取或竞争宿主铁硫簇递送途径的能力。近年来出现的一个引人注目且具有概念重要性的观察是，在SARS-CoV-2复制和转录复合体的多个基本酶组分中分布着七个经实验验证的铁硫辅因子。RTC是一个负责病毒RNA合成和处理的多蛋白机器。关键组件包括RNA依赖性RNA聚合酶nsp12、解旋酶nsp13、校对和RNA帽修饰酶nsp14、核酸内切酶nsp15以及nsp10/nsp16复合体。RNA依赖性RNA聚合酶协调两个铁硫簇，解旋酶nsp13在其锌结合域中含有一个铁硫簇，校对外切核糖核酸酶/甲基转移酶nsp14及其相互作用伙伴nsp10各协调两个铁硫簇。总的来说，这些发现揭示了病毒RTC并非由单个孤立的金属蛋白支持，而是由一个协调的铁硫依赖性酶网络支持。RTC中七个铁硫簇的存在是显著的，并与细胞DNA复制体的结构相似，在复制体中，多种依赖铁硫的酶（包括聚合酶、解旋酶和引物酶亚基）协同工作以确保基因组复制和完整性。这种趋同表明，将铁硫辅因子整合到病毒RNA复制酶中可能不是偶然的，而是反映了支持高保真核酸合成并协调大型多蛋白复合体内单个酶活性的保守生化原理。在功能上，RTC内的铁硫簇似乎调节RNA结合、酶促持续性和结构稳定性。氧化还原扰动或对这些簇的化学靶向会损害病毒复制，支持铁硫簇完整性对于最佳RTC功能至关重要的观点。多个铁硫簇共存于同一个多亚基病毒复合体中，提出了协调氧化还原调节的可能性，将构象变化与RTC内各个组分的激活耦合，或类似于为细胞复制机制提出的簇依赖性组装检查点。此外，由于冠状病毒缺乏内在的铁硫簇生物合成能力，RTC必须利用宿主的铁硫簇递送途径，这建立了病毒基因组复制对宿主铁硫簇生物发生的直接依赖性。总的来说，SARS-CoV-2 RTC中铁硫辅因子的富集扩展了铁硫利用的范式，超越了细胞核酸代谢，并将宿主铁硫簇组装定位为病毒复制的一个关键且潜在脆弱的决定因素。
宿主防御病毒感染中的铁硫簇
虽然上述例子强调了病毒如何利用宿主铁硫簇生物发生来支持其自身复制，但铁硫依赖性酶也直接参与宿主抗病毒防御机制。一个特别能说明胞质途径如何将铁硫簇生物发生与先天免疫联系起来例子是干扰素诱导的自由基SAM酶RSAD2，也称为viperin。Viperin含有一个中央的铁硫结合自由基SAM结构域，并通过催化产生作为链终止剂的核苷酸类似物或通过破坏病毒复制复合体和病毒出芽的蛋白质-蛋白质相互作用来限制多种RNA和DNA病毒的复制。Viperin的自由基SAM化学可以将胞苷三磷酸转化为链终止抗病毒核苷酸3'-脱氧-3',4'-二脱氢-胞苷三磷酸，并更广泛地重编程细胞核苷酸代谢，这为铁硫自由基SAM酶如何发挥广谱抗病毒效应提供了机制解释。将viperin整合到不断增长的核质铁硫蛋白列表中，突显了一个新兴主题，即铁硫簇生物发生不仅支持基因组维持和翻译，而且直接有助于宿主防御病毒感染。
铁硫蛋白在基因组维护、基因表达和病毒感染中新兴的生物医学相关性
人们日益认识到许多参与DNA复制和修复、RNA代谢和蛋白质合成的酶依赖于铁硫辅因子，这突显了金属稳态、基因组维护和基因表达之间新兴的交叉点。这些通路具有特殊的生物医学意义，因为核酸代谢的破坏是人类疾病的关键驱动因素。在癌症中，快速增殖的细胞经历慢性复制压力，并严重依赖DNA修复和损伤耐受机制来维持基因组复制。多种聚合酶、解旋酶和修复酶对铁硫辅因子的依赖性提出了这样一种可能性，即铁硫簇组装或递送的扰动可能选择性地损害肿瘤细胞赖以生存的通路。相反，在长寿命的有丝分裂后细胞（如神经元）中，DNA修复、RNA加工或翻译保真度的逐渐受损可能导致神经退行性疾病特征的细胞损伤逐渐积累。参与tRNA修饰、RNA聚合酶功能、核糖体再循环和翻译质量控制的铁硫酶进一步将铁硫簇生物发生与蛋白质组完整性的维持联系起来。尽管直接针对铁硫依赖性途径的治疗策略在很大程度上仍未被探索，但对这些辅因子如何调节核酸代谢的机制认识的增加，可能揭示以前未被认识到的依赖性或在癌症、神经退行性疾病和病毒感染中可利用的合成脆弱性。
平行的胞质铁硫簇组装为胞质铁硫组装平台提供新生辅因子，供核、胞质和病毒铁硫蛋白获取铁硫簇
铁硫簇生物发生是一个从细菌到人类都进化保守的古老过程。多细胞真核生物进化出了区室化的途径：一个与细菌机制非常相似的线粒体系统，以及一个为核质铁硫蛋白提供簇的线粒体外途径。在哺乳动物细胞中，功能性的新生铁硫簇生物发生机制定位于胞质和线粒体。核心铁硫簇生物发生蛋白向线粒体基质和胞质的双重定位依赖于多种机制。这些观察结果支持这样的观点，即线粒体外铁硫簇生物发生机制在哺乳动物细胞的生理条件下可能自主运作。相比之下，对单细胞酵母的研究提出，胞质途径不能自行产生新生铁硫簇，而是依赖于从线粒体输出的含硫前体。然而，这种代谢物的身份几十年来仍未确定，并且仍然缺乏描述胞质机制如何将这种输出的底物转化为类似NFS1-ISCU反应的支架结合硫化物的详细结构或机制模型。
在哺乳动物细胞中，铁硫簇由专用的多蛋白复合体从头组装。一旦在主支架蛋白ISCU上组装，该簇要么在伴侣蛋白/共伴侣蛋白系统的帮助下直接转移给受体蛋白，要么通过次级载体转移。在哺乳动物细胞中，伴侣蛋白/共伴侣蛋白系统由HSPA9和HSC20组成。在铁硫簇获取的最后步骤中，很大一部分核质铁硫蛋白依赖于由CIAO1、FAM96B和MMS19组成的CIA靶向复合体的专门活性。与进化上保守的核心铁硫簇机制（由NFS1、ISCU、LYRM4、HSPA9和HSC20组成）相比，CTC是仅定位于胞质的真核生物特异性模块。CTC于2012年首次被表征，当时两项独立的研究将MMS19与参与DNA代谢的核质铁硫蛋白联系起来。MMS19是一种HEAT重复蛋白，与WD重复蛋白CIAO1和FAM96B相互作用。CTC促进ISC向一组明确的核质铁硫脱辅基蛋白的转移，这些蛋白参与DNA复制和修复、RNA代谢、核糖体生物发生和蛋白质合成。通过这种活性，CTC将铁硫簇生物发生与对核基因组维护和细胞功能至关重要的核心生物过程联系起来。在机制上，CTC可能通过HSC20连接到核心铁硫簇机制，HSC20可以通过结合CIAO1的LYR基序桥接这些系统。结合CIAO1的HSC20二聚化，通过其独特的N端锌结合结构域，与另一个携带新生铁硫簇的HSC20复合体结合，可以招募一些客户铁硫脱辅基蛋白以获取簇。
虽然以CIAO1、FAM96B和MMS19为中心的CTC代表了负责向核质蛋白递送铁硫簇的特征最明确的模块，但已出现其他组分，表明该途径的进一步多样化。其中一个因子是FAM96A，它是FAM96B的旁系同源物。HEK293细胞中的共免疫沉淀实验表明，FAM96A与CIAO1相互作用，但不与MMS19相互作用。CIAO1/FAM96A复合体与铁调节蛋白2相关。有趣的是，发现FAM96A的过表达稳定了IRP2蛋白水平。有人提出FAM96A/CIAO1复合体向IRP1递送[Fe4S4]簇。然而，尚无直接实验证据支持所提出的FAM96A/CIAO1向IRP1转移铁硫簇的途径。一致地，敲除CIAO1的细胞和CIAO1缺陷的患者来源细胞系显示出正常的细胞铁稳态，这留下了IRP1的胞质乌头酸酶形式如何获取其立方烷簇的开放问题。
铁硫簇向细胞和病毒蛋白的靶向和转移机制
可能有一个以上的系统参与将铁硫簇转移给胞质中的受体脱辅基蛋白，底物特异性由不同的靶向因子赋予，包括HSC20（它与含有LYR基序的铁硫蛋白相互作用）和CTC（它识别一个LIM-DES-FW C末端肽特征或最近描述的五肽基序）。LYR基序最初被定义为短的线性靶向元件，在细胞器区室中介导受体铁硫脱辅基蛋白被共伴侣蛋白HSC20识别，从而赋予铁硫簇递送的特异性。在哺乳动物细胞中，HSC20作为连接ISCU上新生的铁硫簇组装与含有LYR或类似LYR序列的选定受体脱辅基蛋白的衔接蛋白，确保高效和优先的簇转移。虽然LYR依赖性靶向最初在细胞器中被表征，但随后的研究表明，这种机制也在胞质中起作用。与LYR序列的更广泛作用一致，据报道，参与血红素生物合成的胞质酶δ-氨基乙酰丙酸脱水酶连接一个[Fe4S4]簇以发挥活性。ALAD获取铁硫簇依赖于新生胞质铁硫簇递送途径的组分，并涉及HSC20与其类似LYR基序的结合。在这种情况下，在SARS-CoV-2 RTC组分中发现保守的类似LYR基序表明，病毒蛋白利用内源性胞质靶向机制来获取宿主的铁硫簇递送途径。冠状病毒似乎没有编码专用的获取系统，而是进化出了模拟宿主铁硫簇客户基序的短识别元件，从而招募HSC20并整合到现有的胞质铁硫簇运输网络中。与这一模型一致，类似LYR基序在已知感染人类的七种冠状病毒中进化保守，并存在于SARS-CoV-2 RTC的核心组件中。这些基序作为HSC20的识别位点，允许病毒RTC以类似于宿主铁硫蛋白的方式获取铁硫簇。
除了HSC20依赖性靶向外，大约四分之一的细胞CIA客户中ISC整合的另一种机制是由C末端LIM-DES-FW基序介导，称为靶向复合体识别肽。酵母研究表明，该基序结合在Cia1和Cia2之间形成的界面处，其中Cia1和Cia2上保守的精氨酸残基介导与含有该基序的客户蛋白的相互作用。这种重叠意味着Nar1必须解离以允许客户结合，这引发了所提出的从Nar1到客户蛋白的ISC转移如何发生以及Cia1/Cia2复合体本身是否包含ISC结合位点的问题。最近的一项研究表明，从大肠杆菌纯化得到的人重组CIAO1和FAM96A在体外与含有C末端LIM-DES-FW基序的肽结合。基于这些发现，有人提出FAM96A作为一种辅助靶向因子，在铁硫簇需求增加或氧化应激条件下促进铁硫簇客户成熟。然而，这些实验是在缺少MMS19的情况下体外进行的，而MMS19在体内是招募CIA客户蛋白所必需的。此外，CIAO1-FAM96A复合体在共免疫沉淀研究中不与MMS19结合，并且FAM96A与铁硫簇CIA客户的相互作用在体内似乎可以忽略不计。这些观察结果表明，FAM96A和FAM96B之间的强序列同源性保留了用于结合真正的铁硫簇客户蛋白的结合界面，可能导致CIAO1-FAM96A复合体与体外测试的少数铁硫簇客户发生人为的相互作用。
最近，一个保守的五肽基序被识别出来。该基序存在于大多数参与基因组维护的人类核质铁硫蛋白中，也存在于负责降解铁调节蛋白1和2的泛素连接酶FBXL5中。结构分析显示，该基序结合在CIAO1-FAM96B界面形成的保守表面口袋内，其中基序的酸性残基与带正电荷的精氨酸残基结合，疏水侧链插入定义的腔中。破坏该基序会显著损害CTC结合、铁硫簇整合和客户蛋白的酶活性。值得注意的是，同一个口袋也容纳了先前描述的C末端含W/F的靶向信号，表明不同的序列特征汇聚在胞质靶向机制内的一个共享招募位点。总之，这些发现为序列指导的胞质铁硫簇递送提供了结构框架。除了其机制意义外，识别决定铁硫簇组装机制识别客户的离散序列特征，可能为扩展铁硫蛋白库提供概念和实践框架。铁硫蛋白通常难以识别，因为缺乏严格的连接基序共识、铁硫簇的氧敏感性以及重组脱辅基蛋白的不稳定性。定义招募基序，例如LYR三肽和CTC识别的五肽或C末端特征，提供了一种基于靶向逻辑而非仅仅基于金属结合半胱氨酸模式来预测候选铁硫蛋白的正交策略。因此，将基序搜索与生化验证和蛋白质组学方法相结合，可能发现以前未被识别的铁硫簇客户，特别是在参与基因组维护、RNA代谢和基因表达的蛋白质中，这些蛋白质在基因组注释中大多被预测为连接锌。从这个意义上说，CIA机制的序列导向招募不仅可以作为一种递送机制，也可以作为发现未被识别的铁硫蛋白的工具。可以想象，CIA客户蛋白中替代的识别基序和介导簇转移的新型衔接蛋白仍有待发现，可能涉及CIAO1、FAM96B和MMS19之间额外的相互作用界面，以及在MMS19 N端发现的保守结构域。
CIA通路组分功能丧失在人类和动物模型中的后果
来自动物模型的初步见解，现在得到人类研究发现的加强，表明胞质铁硫组装CIA平台功能受损会破坏必需的细胞过程和正常的人类发育。在培养细胞中使用siRNA或CRISPR敲低CIAO1、MMS19或FAM96B会损害许多对DNA/RNA代谢和蛋白质合成至关重要的铁硫蛋白的功能。Mms19的缺失会改变细胞对DNA损伤的反应，导致酵母中的复制应激，并在人类细胞中引起有丝分裂纺锤体异常。我们研究小组和其他人最近对人类患者中CIAO1和MMS19功能丧失变异的识别和表型表征，进一步强调了CIA通路在人类生理学中的关键重要性。在具有类似遗传缺陷的斑马鱼和小鼠模型中观察到的早期死亡率也突显了这一点。患有CIAO1和MMS19缺陷的患者的先天性脑畸形（如小头畸形和生长迟缓）与模型生物的发现一致。果蝇幼虫中功能性Mms19的缺失导致明显的生长缺陷和小头畸形，这是由于大脑神经母细胞谱系细胞周期进程受阻所致。有丝分裂后神经元由于其高能量需求、高转录活性和长寿命，特别容易受到DNA损伤积累的影响。虽然DNA断裂和修复有助于发育过程中的神经元多样性，但DNA损伤修复受损是许多神经系统疾病的关键因素。我们对一组具有CIAO1部分功能丧失的患者的研究揭示了一致的神经肌肉受累表型，其特征是非经典线粒体肌病、神经系统合并症，以及一些让人联想到神经元脑铁积累患者模式的大脑铁积聚病例。导致这种特定大脑铁沉积模式的潜在机制在NBIA患者和我们的队列中很大程度上仍未明确。
