《Journal of Biological Chemistry》：Impact of salt concentration and free magnesium on human beta-cardiac myosin reveal important details about the conserved mechanochemical mechanism
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心肌球蛋白ATP酶循环因肌动蛋白的存在而被显著加速，但其结构细节仍不清楚。研究人员发现，位于人心肌β型肌球蛋白亚片段1（S1）中的一个扩张型心肌病突变E525K，使肌动蛋白激活的磷酸盐释放和杠杆臂旋转增强了约3倍。假设破坏保守的484-525盐桥使得525位的
心肌球蛋白ATP酶循环因肌动蛋白的存在而被显著加速，但其结构细节仍不清楚。研究人员发现，位于人心肌β型肌球蛋白亚片段1（S1）中的一个扩张型心肌病突变E525K，使肌动蛋白激活的磷酸盐释放和杠杆臂旋转增强了约3倍。假设破坏保守的484-525盐桥使得525位的赖氨酸能够更容易地与肌动蛋白相互作用。事实上，研究人员发现E525K的肌动蛋白激活ATP酶活性对盐浓度变化（20 mM至100 mM KCl）表现出极强的抗性，而野生型（WT）马达则不然，且在体外肌动蛋白滑动速度上也观察到了类似的改变。对芘标记肌动蛋白结合的直接测量显示，E525K突变加速了与肌动蛋白的附着。研究发现E525K的肌动蛋白激活ATP酶活性对镁（Mg）的敏感性低于WT，表明该突变通过变构作用改变了活性位点中Mg的配位。此外，在低Mg条件下，突变体的ADP释放Mg依赖性显著降低。分子动力学模拟表明，E525K增加了ADP结合状态下活性位点的构象变异。研究结果表明，E525K突变通过加速从弱到强肌动蛋白结合的过渡增强了肌动蛋白亲和力，这凸显了肌动蛋白激活的Pi释放过程中激活环/中继螺旋（relay helix）通讯通路的重要性。此外，E525K改变了活性位点中的Mg配位，进一步证明了484-525盐桥在变构偶联活性位点和肌动蛋白结合区域方面的重要性。
研究人员针对肌球蛋白机械化学周期中肌动蛋白激活的结构机制尚不明确，以及P-loop家族ATP酶中镁离子（Mg）如何协调调控ATP酶循环的问题，开展了此项研究。该研究聚焦于人类β型心肌肌球蛋白（human beta-cardiac myosin）及其相关的扩张型心肌病突变体E525K，通过结合酶学、运动学及分子动力学模拟等多种手段，深入探究了盐浓度与游离镁对肌球蛋白功能的影响。研究成果发表于《Journal of Biological Chemistry》。
为实现上述目标，研究人员采用了几项关键技术方法：首先，构建了野生型（WT）和E525K突变型的人心肌β型肌球蛋白亚片段1（M2β S1）重组蛋白，并利用FLAG亲和层析进行纯化。其次，通过稳态ATP酶测定法（NADH偶联法）评估肌动蛋白激活的ATP水解活性。第三，利用体外运动实验（in vitro motility assay）检测肌动蛋白丝在肌球蛋白作用下的滑动速度。第四，应用停流光谱技术（stopped-flow）监测荧光标记的核苷酸（mant-ADP）释放动力学及芘标记肌动蛋白（pyrene actin）的结合速率。最后，采用高斯加速分子动力学（Gaussian accelerated molecular dynamics, GaMD）模拟，在原子水平上解析蛋白构象变化。
研究结果具体如下：
盐浓度对肌动蛋白激活ATP酶的影响
研究人员通过测定不同KCl浓度下的稳态肌动蛋白激活ATP酶活性发现，E525K突变体对盐浓度变化的敏感性远低于野生型。在20 mM至100 mM KCl范围内，野生型ATP酶活性下降了约90%，而E525K仅下降了约60%。这表明E525K增强了肌动蛋白在“弱结合”状态下的附着，使其不易受盐浓度影响。
盐浓度对体外运动性的影响
在体外肌动蛋白滑动实验中，虽然E525K在50 mM KCl下表现出更快的绝对滑动速度，但当数据归一化后，野生型和突变体对盐浓度的依赖性曲线并无显著差异。这说明增强的弱结合状态并未显著影响肌动蛋白的滑行速度。
E525K突变对芘肌动蛋白结合的影响
通过停流技术直接测量肌球蛋白与芘肌动蛋白的结合，结果显示E525K突变使二级结合速率常数提高了两倍以上（从29.7±1.1增至74.9±2.1 μM-1?s-1）。这证实激活环中的单个点突变显著加速了肌动蛋白附着并过渡到强结合状态的过程。
镁敏感性对肌动蛋白激活ATP酶的影响
在保持离子强度恒定的前提下改变游离Mg浓度，研究发现随着游离Mg的增加，野生型和E525K的ATP酶活性均下降，但野生型的降幅（4倍）大于突变体（2倍）。这表明E525K可能改变了活性位点中Mg的配位，从而影响了ATP酶限速步骤的速率。
镁敏感性对体外运动性的影响
与ATP酶结果类似，游离Mg对野生型和E525K驱动的肌动蛋白滑行速度均有剂量依赖性抑制作用，且两者的归一化曲线相似，说明两者对Mg引起的运动性减慢具有相似的敏感性。
镁对ADP释放动力学的影响
通过监测mant标记的ADP释放，研究人员发现在低游离Mg（196 μM）条件下，E525K的ADP释放速率常数快于野生型，而在其他Mg浓度下两者相近。这提示E525K可能通过改变活性位点构象，使得在低Mg条件下ADP更易解离。
镁对基础稳态ATP酶的影响
在无肌动蛋白的基础ATP酶反应中，高浓度的游离Mg（8.7 mM）导致野生型和E525K的活性均降低约30-40%。这说明游离Mg也能影响Pi释放步骤，且该效应不依赖于肌动蛋白的结合。
分子动力学模拟
GaMD模拟结果显示，E525K突变在活性位点中显示出Mg-ADP解离状态的微小概率，而野生型中未观察到此状态。此外，突变体增强了关键基序（如开关I和开关II区域）的构象波动（RMSF），并促进了N238与E466之间距离的缩短，表明突变影响了Mg-ADP在活性口袋中的稳定性。
综上所述，讨论部分指出，激活环（activation loop）在肌动蛋白的“弱结合”状态及向“强结合”状态过渡中起着关键作用。E525K突变引入的额外正电荷增强了与肌动蛋白N端的静电相互作用，从而加速了强肌动蛋白结合复合物的形成。同时，研究证实了激活环与活性位点之间存在变构通讯通路，E525K突变通过改变Mg的配位环境，影响了ADP和磷酸盐的释放。在生理意义上，虽然心脏细胞内游离Mg浓度通常稳定在1-2 mM，但在缺血再灌注或线粒体功能障碍等病理条件下，游离Mg的变化可能通过上述机制影响心肌收缩力。
论文结论部分总结道：本研究确立了激活环与肌动蛋白的相互作用可介导初始附着及向强结合构象的转变，并进一步证实了激活环与活性位点之间的变构连接，揭示了游离Mg可通过尚未被充分探索的机制改变心肌肌球蛋白的磷酸盐释放。激活环作为直接与肌动蛋白相互作用并影响中继螺旋构象的关键因子，是介导肌动蛋白附着及激活杠杆臂旋转和磷酸盐释放的重要因素。
