Enabling methodology for high-throughput media screening in the context of multi-cell type co-cultures 中文标题：多细胞类型共培养背景下高通量培养基筛选的赋能方法

《Journal of Biotechnology》：Enabling methodology for high-throughput media screening in the context of multi-cell type co-cultures

　　

论文摘要翻译 近年来，工程化的体外组织模型数量不断增加，这些模型融合了越来越多的细胞类型，以更准确地重现天然组织的结构和功能。然而，由于缺乏标准化的方案和可扩展的筛选方法，优化支持这些共培养物的培养基仍然具有挑战性。当前的共培养方法涉及直接细胞间接触或通过共享培养基的间接旁分泌信号传导，每种方法在表征方面都呈现出独特的挑战。相应的商业共培养系统通常成本高昂、缺乏模块化且不适合高通量筛选。 在此，研究人员提出了一种半自动化方法，结合了定制的3D打印装置（置于标准细胞培养孔板中）、自动图像采集和统计分析，以实现单培养、双培养和三培养体系培养基配方的高通量筛选。研究人员将该平台应用于由支气管上皮细胞、成纤维细胞和内皮细胞组成的呼吸道组织模型，筛选了40种培养条件并分析了348种生长模式。 研究结果表明，培养基成分和旁分泌相互作用对细胞增殖具有关键影响，其中内皮细胞对培养基变化的敏感性高于上皮细胞。该方法通过自动化减少了人工劳动，促进了培养条件的可重复、大规模评估，尽管仍需进行图像筛选以确保数据质量。 最后，本研究介绍了一种可扩展且稳健的筛选方法，用于优化多细胞共培养的培养条件，为组织工程应用提供了宝贵的见解，并推动了仿生体外模型的发展。

论文解读

研究背景与动机

工程化体外组织模型旨在通过整合多种细胞群体（如基质细胞、内皮细胞、免疫细胞及上皮细胞）来模拟天然组织的复杂性和功能。然而，开发此类多细胞模型面临一个核心瓶颈：如何为共培养体系选择和优化培养基。现有的商业培养基多为单一细胞类型设计，其具体成分往往不透明，导致在共培养中难以预测不同培养基组合对各类细胞的特异性影响。此外，传统的共培养研究多局限于直接共培养（细胞直接接触）或间接共培养（通过Transwell等物理分隔装置），但这些商业设备成本高、模块化不足且难以兼容自动化分析，限制了大规模筛选的可行性。因此，开发一种能够标准化、高通量评估共培养条件下培养基效应的工具成为迫切需求。

研究方法概述

研究人员开发了一种结合定制化3D打印硅胶装置与自动化成像分析的半自动化筛选平台。关键技术包括：利用医用级液态硅橡胶（LSR4301）通过液态沉积建模（LDM）技术打印适配标准孔板的隔室装置；采用Sartorius Incucyte? SX5系统进行活细胞自动成像与基于人工智能的细胞轮廓识别；定义并计算细胞表面覆盖度进展（SCP，%/天）作为量化细胞增殖的核心指标；以及针对呼吸道组织模型（包含人肺成纤维细胞NHLF、人脐静脉内皮细胞HUVEC和Calu-3支气管上皮细胞）进行的单培养、双培养（NHLF+HUVEC）和三培养（NHLF+HUVEC+Calu-3）实验，共筛选了5种培养基配方（FBM、EGM-2+、DMEM/F12、Mix2、Mix3）下的40种培养条件。

研究结果

1. 共培养装置的生产与鉴定

研究人员设计并3D打印了适配6孔、12孔和24孔板的双隔室及三隔室装置。所选用的LSR4301硅胶表现出优异的生物相容性和高粘附力（16.49 ± 0.53 N），能牢固附着于培养板底部，且经高压灭菌后尺寸稳定。装置可重复使用5-6次。通过对装置内细胞SCP的测定，发现成纤维细胞和Calu-3细胞的SCP在有装置时显著降低，而HUVEC不受影响，这表明引入新装置需预先评估其对特定细胞行为的影响。

2. 共培养装置对细胞SCP定量的影响

比较了有无装置情况下三种细胞的SCP。结果显示，NHLF和Calu-3在有装置时的SCP显著低于无装置的单培养对照，而HUVEC则无显著差异。这一发现强调了在后续共培养实验中，只有显著性水平大于0.05的效应才被视为有意义，从而确保对观察到的变化进行合理解释。

3. 细胞增殖筛选分析方法学的鉴定

该方法学在重复性、精密度和大数据集生成方面得到了验证。尽管由于装置隔室面积小、硅胶疏水性导致的细胞接种不均匀，使得装置内的数据离散度（CV%）高于标准单培养（NHLF增加2.5倍，HUVEC和Calu-3增加1.7倍），但总样本量（348个样本，1740张图像）足以支持稳健的统计分析。变异系数均在可接受范围内（<50%），证明该方法适用于高通量分析。

4. 支气管模型开发的共培养条件筛选

研究通过两步法验证了策略：首先在24孔板单培养中评估各细胞在不同培养基中的生长，其次在装置中进行共培养以考察旁分泌作用。统计分析了培养构型（单、双、三培养）和培养基成分对细胞生长的独立影响。

5. 肺成纤维细胞增殖在共培养条件下的降低

NHLF在单培养中对培养基成分相对不敏感，但在与HUVEC或Calu-3的共培养中，其SCP显著下降（例如在FBM中从27.5%降至17.0%）。这表明细胞间的旁分泌信号对成纤维细胞增殖的抑制作用强于培养基配方本身的变化。

6. 培养基对内皮细胞表型和生长的影响

HUVEC对培养基成分高度敏感。在DMEM/F12中，其SCP显著降低（~13%/天）并呈现衰老相关的“荷包蛋”样形态。而在共培养中，来自成纤维细胞的旁分泌信号（如FGF-2）能刺激HUVEC增殖，特别是在Mix3培养基中表现良好。EGM-2+始终支持最高的HUVEC增殖率（高达29.2%/天）。

7. Calu-3生长在不同培养基和共培养条件下的稳定性

作为永生化细胞系，Calu-3在所有测试培养基和共培养条件下均表现出稳定的多边形形态和SCP（约26.4%/天），表明其生长行为不受外界培养基变化或基质细胞旁分泌信号的显著影响。

结论与讨论

该研究成功建立了一种高通量、可重复的共培养培养基筛选协议。通过结合3D打印生物相容性装置和自动化成像，研究人员实现了对大量培养条件（40种条件，348个数据点）的高效评估。研究发现，培养基成分和旁分泌相互作用共同调控细胞增殖，其中HUVEC对培养基变化最为敏感，而Calu-3表现出极强的鲁棒性。Tri-culture的结果因细胞类型而异，强调了在复杂组织模型中定制培养基的重要性。尽管自动化成像减少了人工干预，但手动图像筛选仍是确保数据准确性的必要步骤。未来工作应聚焦于改进自动化图像分析算法、优化接种均匀性以及拓展至3D培养格式。总体而言，这项研究为共培养系统中的培养基标准化优化提供了强有力的工具，对推动仿生体外组织模型的发展具有重要意义。该论文发表于《Journal of Biotechnology》。