四种开花型藻类菌株在亚磷酸盐（P3?）胁迫下的生理化学及微观形态响应，以及恢复到磷酸盐（P?）条件下的变化

《Journal of Biotechnology》：Physiochemical and Micro-morphological Response for Four Bloom-forming Algal Strains Under Phosphite (P+III) Stress and Phosphate (P??) Recovery

　　

张荣飞|王玉飞|王坤|韩超

生态环境部湖泊污染防治重点实验室、国家湖泊污染防治与生态修复工程实验室、环境标准与风险评估国家重点实验室、中国环境科学研究院

摘要

亚磷酸盐（P????）是一种新兴的还原态磷（P）形式，在环境中具有重要作用，但对藻类群落的影响复杂且尚未得到充分研究。在这项研究中，我们通过将四种典型的形成水华的藻类分别暴露在不同浓度的亚磷酸盐（0.07–14 mg·L?1）环境中，然后观察它们对磷酸盐（P??）的恢复能力，系统地评估了这些藻类对亚磷酸盐的耐受性和恢复潜力的种间差异。结果表明，不同藻类对亚磷酸盐的反应存在显著差异。在15–27天的亚磷酸盐胁迫期间（具体时间取决于菌株，详见方法部分），Chlamydomonas reinhardtii表现出极高的耐受性：即使在最高浓度下，其细胞密度仅降低了21.3%（最终A???相对增长率为798%，而在14 mg·L?1亚磷酸盐浓度下为628%），并且细胞超微结构保持完整。相比之下，Chlorella pyrenoidosa的两个菌株生长受到严重抑制——C. pyrenoidosa-9的细胞密度降低了83.3%（最终A???相对增长率为448%，而C. pyrenoidosa-10的细胞密度降低了84.6%（最终A???相对增长率为344%），同时伴随着广泛的膜破裂。Chlorella vulgaris在低浓度亚磷酸盐（0.07–0.7 mg·L?1）下能够短暂适应，但在浓度超过0.7 mg·L?1时受到严重的氧化损伤，细胞密度在14 mg·L?1浓度下降低了69.9%（最终A???相对增长率为851%，而在磷酸盐条件下为256%）。值得注意的是，亚磷酸盐作为一种可利用的磷源效果不佳，因为其细胞内磷的积累量仅为磷酸盐条件下的10%以下。在随后的磷酸盐恢复阶段，Chlorella vulgaris的细胞密度迅速恢复，增长了167%。相反，Chlamydomonas reinhardtii的恢复过程较为缓慢，这是因为其代谢磷酸盐的效率较低。扫描电子显微镜（SEM）观察发现，亚磷酸盐引起的细胞损伤部分是可逆的。然而，14 mg·L?1浓度的亚磷酸盐会对敏感藻类造成可逆的生长抑制。这些结果强调了P?III既可作为环境压力源，也可能调节富营养化水体中的藻类水华形成，从而改变藻类群落结构。这些发现有助于我们理解还原态磷的生物利用机制，并为生态风险评估和富营养化管理提供重要依据。

引言

亚磷酸盐（P????）作为低氧化态的无机还原态磷（IRP）形式，在环境中广泛存在，尤其是在受到富营养化威胁的湖泊和溪流中（Figueroa和Coates, 2017; Hanrahan等, 2005; Qiu等, 2016）。地球化学证据表明，亚磷酸盐在太古代缺氧海洋中是主要的磷形式，并可能参与了早期磷代谢的演化（Herschy等, 2018）。现代环境中亚磷酸盐的积累既有自然地质化学过程的原因，也有人为因素（Glindemann等, 1999）。近期研究显示，在各种水生环境中（包括厌氧沉积物、富营养化湖泊以及受人类活动影响的水域），亚磷酸盐的浓度很高，可占总溶解磷的33%（Fu和Zhang, 2020; McDowell等, 2004; Yu等, 2015）。由于亚磷酸盐具有较高的溶解度和移动性（Hashizume等, 2020），它参与了全球多个环境中的磷氧化还原循环，并被提议作为富营养化湖泊中控制藻类的潜在方法（W. Liu等, 2023）。尽管如此，关于其在环境中的命运和生物可利用性仍存在许多不确定之处。

最新研究表明，某些藻类可以直接利用亚磷酸盐。例如，Chlorella vulgaris和Coccomyxa subellipsoidea能够高效吸收亚磷酸盐（Hashizume等, 2020），而Trichodesmium将亚磷酸盐的还原与磷酸酯代谢结合，以支持固氮和光合作用（Van Mooy等, 2015）。基因组分析发现，Prochlorococcus通过ptx编码的亚磷酸盐脱氢酶将亚磷酸盐氧化为磷酸盐（Martínez等, 2012）。此外，一些藻类可以通过从细菌Pseudomonas stutzeri WM88中引入亚磷酸盐脱氢酶（也称为亚磷酸盐氧化还原酶ptxD）基因，获得直接利用亚磷酸盐的能力，即使它们原本无法利用亚磷酸盐。例如，当ptxD被引入Cyanidioschyzon merolae（Kobayashi等, 2023）、Picochlorum属（Dahlin和Guarnieri, 2022）、Synechococcus elongatus PCC 7942（Gonzalez-Morales等, 2020）和Synechococcus sp. PCC 7002（Selao等, 2019）后，这些工程藻类能够直接以亚磷酸盐为唯一磷源进行生长，其生长速率与利用磷酸盐时相当。同样，将ptxD基因转入野生型C. reinhardtii后，该藻类也获得了利用亚磷酸盐的能力（Loera-Quezada等, 2015）。将ptx稳定整合到C. reinhardtii的叶绿体基因组中后，工程菌株在培养基中亚磷酸盐替代磷酸盐的情况下仍能保持野生型的生长水平（Changko等, 2020; Sandoval-Vargas等, 2019; Sandoval-Vargas等, 2018）。这一策略有效扩展了藻类的磷利用途径，为提高生物量和磷利用效率提供了新方法。然而，不同藻类之间的差异仍然存在。例如：Microcystis aeruginosa无法单独依靠亚磷酸盐生长，但当亚磷酸盐与磷酸盐同时存在时，其叶绿素a（Chl-a）的合成量可达到最大值的30%（Zhang等, 2011）。

然而，多项研究指出亚磷酸盐对形成水华的藻类具有显著的毒性（Inguagiato等, 2017）。例如，亚磷酸盐能有效抑制M. aeruginosa、C. pyrenoidosa和Cyclotella等蓝藻的生长，从而加速细胞衰老和死亡（Han等, 2022）。同样，Scenedesmus obliquus和Botryococcus braunii在含有亚磷酸盐的培养基中无法生长（Hashizume等, 2020），Cephaleuros virescens也受到抑制（Browne等, 2019）。相反，某些藻类（包括C. reinhardtii、Ettlia oleoabundans和Botryococcus braunii

关于亚磷酸盐对藻类的影响，有两种主要假说：（1）代谢替代假说认为亚磷酸盐可作为藻类的替代磷源；（2）毒性抑制假说认为亚磷酸盐会干扰磷代谢并产生毒性效应。然而，目前还没有研究在微观结构层面探讨藻类在亚磷酸盐胁迫后能否在磷酸盐存在的情况下恢复。为填补这一知识空白，我们选择了四种典型的形成水华的藻类——C. reinhardtii、C. pyrenoidosa（两个菌株）和Chlorella vulgaris，并在单因素和多因素条件下同时供应磷酸盐和亚磷酸盐，观察它们的反应。通过扫描电子显微镜观察了亚磷酸盐胁迫下的细胞损伤情况及磷酸盐补充后的恢复过程，量化了色素动态、细胞密度变化、特定生长速率、细胞内磷含量和超微结构特征，以评估：（i）不同藻类对亚磷酸盐的生物可利用性和耐受性；（ii）种间的生长响应；（iii）亚磷酸盐处理后从磷酸盐饥饿状态下的恢复能力。我们的发现将有助于更深入地理解还原态磷的生物利用机制，并为生态风险评估和富营养化管理提供重要启示。

章节摘录

藻类菌株及其培养条件

C. reinhardtii是一种单细胞绿藻，既生活在土壤中也能在水环境中生存（Yang等, 2015），经常从淡水环境中分离得到（Sendra等, 2017; Wang等, 2018），一些研究者认为它是淡水生态系统中的优势物种（Mussgnug等, 2010）。因此，我们选择了四种在中国淡水系统中占主导地位的绿藻作为模型生物：C. pyrenoidosa（FACHB-9）等。

藻类在亚磷酸盐胁迫下的生理生化反应

总体而言，藻液中的颜色变化反映了四种藻类的生长动态（图1）。在负对照（5.6 mg·L?1磷酸盐）和正对照（5.6 mg·L?1磷酸盐 + 0.07 mg·L?1亚磷酸盐）条件下，绿色色素的增加与藻类种群的增长一致。而不含磷酸盐的空白对照组则显示出较低的细胞密度（图2），证实了所有藻类都依赖磷酸盐作为必需的磷源。

讨论

磷是细胞功能的重要营养物质，对信息的存储和能量交换至关重要。微藻的一个显著优势是能够有效吸收和储存磷，以应对未来的资源短缺。目前，水生生态系统中亚磷酸盐浓度的增加已成为环境问题。数十年来，关于亚磷酸盐的生物可利用性一直存在争议。

结论

本研究得出结论：亚磷酸盐无法支持所研究的四种主要淡水绿藻的生长，反而会以浓度依赖的方式抑制其生长。在各种菌株中，C. reinhardtii在高浓度亚磷酸盐存在下仍能存活较长时间。所有菌株在单培养条件下都能通过补充磷酸盐来维持稳定的生长。亚磷酸盐的胁迫越强，其特定生长速率越低。

资助声明

本研究得到了生态环境部湖泊污染防治重点实验室开放研究基金（2024HPYKFYB10）、中央公共利益科学机构基础研究基金（2024HPYKFYB10）以及国家自然科学基金（编号42277463和42077360）的支持。

未引用的参考文献

（Liu等, 2023）

CRediT作者贡献声明

张荣飞：撰写原文初稿、数据可视化、结果验证、软件使用、资源准备、方法设计。王玉飞：撰写原文初稿、数据可视化、实验设计、数据整理、概念构建。王坤：撰写并编辑稿件、项目管理、资金筹措。韩超：撰写并编辑稿件、指导工作、项目管理、方法设计、资金筹措、数据分析、概念构建。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或其他个人关系可能影响本文的研究结果。