用于从葡萄副产物中提取茚状物的天然深共晶溶剂：溶解性与提取效率研究

《Journal of Chromatography A》：Natural deep eutectic solvents for stilbenoid extraction from vine by-products: solubilization and extraction efficiency study

　　维多利亚·塞拉菲娜|玛尔塔·莫西略·科拉尔|约瑟普·瓦尔斯-福纳耶特|亚历山德拉·高贝尔|特里斯坦·理查德|斯蒂芬妮·克吕泽|凯伦·高丹
波尔多大学，波尔多INP，波尔多农业科学学院，INRAE，UMR 1366 OENO，ISVV，F-33140 Villenave d’Ornon，法国

**摘要**
天然深共晶溶剂（NADES）已成为替代传统溶剂提取多酚的可持续选择；然而，由于可能的组分组合众多以及缺乏快速筛选方法，其合理选择仍是一个重大挑战。本研究旨在开发一种基于紫外-可见光（UV-Vis）的快速且成本效益高的筛选方法，以评估NADES中对类黄酮的溶解性，而无需使用纯标准品，并利用这种方法指导NADES辅助提取过程的选择和优化。
通过将一种快速UV-Vis方法应用于富含类黄酮的植物提取物，筛选出了20种NADES。结果显示，这些方法与高效液相色谱-二极管阵列检测分析（r = 0.49–0.61）具有中等相关性，从而高效地预选出了12种有前景的溶剂。其中，甜菜碱/左旋丙氨酸（1:2摩尔比）表现出最高的提取效率。使用Box-Behnken设计进行的过程优化表明，固液比是最重要的参数，最佳条件为20分钟提取时间和39%的水分含量，在超声波辅助下进行提取。
将优化后的方法应用于不同收获年份和颗粒大小的赤霞珠葡萄藤粉末中，从最新样本中获得了高达2.6克/千克干重的(E)-白藜芦醇和2.5克/千克干重的(E)-ε-香豆素。其提取性能与先前报道的NADES和传统的乙醇/水系统相当。
总体而言，这项研究表明，基于溶解度的UV-Vis筛选提供了一种快速、可扩展且无需标准品的NADES选择策略，为传统的试错方法提供了实用替代方案，并支持了高效和可持续提取过程的发展。

**引言**
类黄酮是一组源自植物的多酚化合物，其特征是由两个苯环通过乙烯桥连接而成。这些分子具有广泛的生物活性，包括抗氧化、抗癌、抗菌、抗衰老、抗炎、神经保护和抗糖尿病等特性[1]。典型的类黄酮及其衍生物包括白藜芦醇（单体）、ε-香豆素（二聚体）以及寡聚体形式，如hopeaphenol和vitisin B（两种四聚体）。
葡萄藤是类黄酮最丰富的天然来源之一[2][3][4]。葡萄藤需要每年修剪以保持适当生长和良好的果实品质[5,6]，这会产生大量作为废物的藤蔓生物质。通常，修剪后的葡萄藤会被堆肥或焚烧[7]。然而，这些副产品可以作为一种丰富且可再生的天然多酚化合物来源加以利用。从葡萄藤生物质中回收生物活性类黄酮有助于实现可持续发展、减少废物和循环生物经济的理念。转变这些农业工业废弃物可以为葡萄产业带来显著的经济和环境价值，具有在农业、化妆品、制药、食品和营养补充剂等领域的潜在应用[8][9][10][11]。
尽管类黄酮具有很高的价值，但其提取仍面临许多困难。迄今为止开发的提取方法产量低或选择性差，需要高温或大量非生态溶剂[12][13][14]。符合更广泛的社会期望，科学研究现在转向可持续和绿色化学方法。因此，葡萄副产品的转化策略应包括使用环保溶剂。
在绿色溶剂中，天然深共晶溶剂（NADES）因其可生物降解性和可调性而受到越来越多的关注[15][16][17]。NADES由各种摩尔比的氢键受体（HBA）（如氯化胆碱、甜菜碱、氨基酸）和氢键供体（HBD）（如羧酸、多元醇或尿素）组成。这些组分之间的氢键网络形成共晶混合物，其熔点低于单独成分[18][19][20][21][22][23][24][25]。为了降低粘度和改善传质效果，通常会添加水作为第三组分，这也会影响氢键结构和溶剂性质[26][27][28][29][30][31][32][33]。
迄今为止，关于基于NADES的类黄酮提取的研究较少。已在多种植物材料中证明了NADES的提取潜力，包括花生皮和根[32,34]、虎爪豆根[35,36]、白桑愈伤组织培养物[37]、核桃仁种子[38]、卡杠豆叶[30]以及葡萄藤茎和根[29,40,41]。基于氯化胆碱-酸的系统（通常是氯化胆碱与柠檬酸、乳酸或苹果酸的组合）应用最为广泛，特别适用于提取白藜芦醇及其糖基前体polydatin，并且还能促进酸催化水解反应[35,36]。这些系统通常在水含量为10%至50%的范围内运行，有助于降低粘度和改善传质效果。基于氯化胆碱-糖的NADES（如氯化胆碱与葡萄糖或果糖的组合）较为温和且更具生物相容性，主要用于在温和条件下提取酚类化合物和类黄酮，例如在卡杠豆叶的研究中[30]，尽管由于其较高的固有粘度，所需的水比例通常在30%至60%之间。基于氯化胆碱-多元醇的系统，特别是那些含有甘醇的系统，特别适合用于木质化基质（如葡萄藤茎和根），能够高效提取白藜芦醇和寡聚类黄酮（如ε-香豆素），如NADES系统中所证明的[29,40,41]，其水含量一般介于10%至40%之间。基于甜菜碱的NADES，通常与乳酸或甘醇结合使用，也显示出从农业副产品（如花生皮和核桃仁种子）中高效提取白藜芦醇的能力，通常含有20%至50%的水分，并经常借助超声波辅助[32,34,38]。其他应用也证实了它们在富含类黄酮的基质（如白桑愈伤组织和其他植物系统[37]）中的有效性。
文献中涌现出一些共同趋势：超声波辅助提取（UAE）是最常用的技术，因为它显著增强了传质和提取效率[38,40]。为了降低粘度和改善扩散效果，系统性地需要添加水，最佳含量通常在10%至60%之间，具体取决于溶剂系统。温度是另一个关键参数，大多数提取在30至80°C的中等温度下进行，以增强溶解度同时避免敏感类黄酮（如白藜芦醇）的热降解[29,32]。然而，似乎没有一种普遍适用于所有类黄酮或提取场合的NADES系统。相反，NADES的选择高度依赖于具体情况，反映了植物基质的复杂性和类黄酮的多样化学性质。在这些研究中，提取参数通常使用Box-Behnken设计或单因素实验方法进行优化。然而，单个研究中调查的NADES系统多样性有限，通常一次不超过几种溶剂。这种试错式的溶剂选择方法耗时且资源密集，限制了对大量NADES配方的系统探索。
选择用于多酚提取的NADES可以采用多种方法，包括文献研究（表1）、建模（如Conductor-like Screening Model for Real Solvents (COSMO-RS)）、基于性质的选择（例如极性、粘度等）或绿色化学标准[41,42]。然而，由于可能的组分组合众多，特别是HBD、HBA及其摩尔比的选择，系统评估具有挑战性，因为每种配方实际上都代表了一个独立的可行性研究。在大多数基于NADES的类黄酮提取研究中，NADES的组成并非根据明确定义的标准选择，而是基于先前报道的各种多酚的提取效率[29,30,32][34][35][36][37][38][39]。只有少数研究使用了COSMO-RS建模[40,41]，或根据生物安全性考虑选择了NADES[37]。COSMO-RS无需实验工作即可快速筛选多种溶剂系统，减少了时间和成本以及实验室试验次数，同时对某些化合物具有良好的预测能力。该方法还通过限制化学物质的使用和废物产生来支持绿色化学。它允许评估关键参数（HBA、HBD、摩尔比和水含量），并提供关于溶解度、极性和氢键等分子相互作用的见解，从而有助于合理的溶剂设计。然而，对于复杂或高度寡聚化的分子，其准确性较低，且无法可靠预测关键物理性质（如粘度、传质或实际提取限制）。此外，其结果仍需实验验证。这种方法在提取步骤之前无法避免通过实验考虑（如HBA/HBD摩尔比和水含量）来精细选择溶剂，这些因素影响NADES的形成和粘度。这些因素对实施提取过程至关重要，无法通过计算完全预测。此外，监管方面也限制了以这种方式确定的解决方案的适用性。因此，寻找快速和高通量的溶剂选择策略仍然是一个挑战。

**NADES的特性**
NADES的特点是蒸气压非常低，使得从提取物中去除它们变得困难、耗时且耗能[15][16][17]。这是一个重大缺点，因为用NADES替代传统溶剂的主要目标是提高提取过程的环境可持续性。因此，NADES成分不仅必须有效，还必须安全且在预期应用领域得到法律批准。这一点进一步强调了选择NADES时不仅要考虑提取效率，还要考虑其在最终制剂中的直接适用性。重要的是，NADES还被成功研究作为活性化合物的制剂介质[16][43][44][45]。最近的研究显示，基于NADES的提取物在农业、化妆品、食品和制药应用中具有广阔的潜力[44][46][47][48][49][50][51][52][53][54]。
鉴于NADES配方的数量迅速增加以及影响其物理化学行为的因素（如HBA和HBD类型、摩尔比、水含量和制备方法）的复杂性，迫切需要快速、简单且可扩展的方法来在全面提取实验之前进行预筛选。溶解度测试就是这样的方法之一，已应用于NADES系统[55][56][57][58][59][60]。这种策略基于这样的假设：有效的提取剂也应表现出对目标化合物的高溶解能力[55,56]。通常，溶解度研究使用纯标准品进行，并针对每种化合物单独进行[55][56][57][58][61][62]。然而，这种方法由于所需时间和参考标准品的数量限制了通量和可扩展性。使用含有所有目标化合物的多组分提取物，而不是单独的纯分子，有助于在提取前进行初步的溶解度筛选，从而克服这些限制。为了克服这些限制，本研究提出了一种基于多组分植物提取物的替代方法，无需纯标准品即可同时评估多种目标化合物，从而显著提高筛选效率。
**研究目的**
本研究的目的是开发逐步策略，用于选择和优化NADES，以高效提取葡萄藤茎中的类黄酮。为此，设计了一种顺序方法。首先，根据文献数据和监管考虑对NADES进行预选，以确保其提取相关性和在不同领域的潜在适用性。其次，使用基于UV-Vis的快速筛选方法对20种选定的NADES在富含类黄酮的植物提取物中的溶解能力进行评估，从而在不使用纯标准品的情况下实现高通量评估。第三，进一步研究最有前景的溶剂从葡萄藤茎基质中提取类黄酮的效率，以在实际条件下验证筛选结果并选择最有效的提取剂。最后，使用Box-Behnken实验设计优化了基于超声波的提取过程，并将优化后的方法应用于不同收获年份和颗粒大小的葡萄藤茎样本，以评估其实际适用性。

**材料与试剂**
超纯水（最小电阻率为18.2 MΩ）由ELGA Millipore系统（法国）提供。左旋丙氨酸（Lev.a）（≥99%）和甘油（Glyc）（99%）由默克公司（德国达姆施塔特）提供。无水甜菜碱（Bet）（≥98%）、甲酸（FA）（99%）和丙腈（ACN，HPLC梯度级和MS级）由Thermo Fisher Scientific（法国Illkirch）提供。绝对乙醇（EtOH）（≥99.8%）和甲醇（MeOH）（≥99.8%，HPLC梯度级）由VWR公司购买。

**NADES的选择**
大多数基于NADES的多酚提取研究往往一次仅评估有限数量的溶剂，通常不考虑它们在不同领域的潜在适用性。在这项研究中，基于文献数据选择了20种NADES组合，包括特定的HBA/HBD比例，主要考虑了它们提取多酚（如芪类化合物）的效率，以及其组分的农业适用性。**结论**：本研究探讨了使用NADES提取葡萄酒多酚（尤其是芪类化合物）的方法，并介绍了一种基于分光光度的新方法来评估不同溶剂组合中芪类化合物的溶解度，从而解决了NADES选择缺乏快速和合理策略的问题。所开发的方法作为一种快速的初步筛选工具显示出了强大的潜力，能够评估20种NADES并挑选出12种有前景的溶剂用于进一步研究。**未引用文献**[[69], [70], [71], [72], [73], [74], [75], [79], [80], [81], [82], [98], [99]** **CRediT作者贡献声明**：Wiktoria Serafin负责撰写初稿、数据可视化、验证、方法学设计、研究实施、数据分析及概念构建；Marta Morcillo Corral负责撰写初稿、验证、研究实施及数据分析；Josep Valls-Fonayet负责审稿与编辑、方法学设计及研究实施；Alexandra Gaubert负责审稿与编辑、资源协调及资金争取；Tristan Richard负责审稿与编辑、资源协调及资金争取。**利益冲突声明**：作者声明没有已知的可能影响本文研究结果的财务利益或个人关系。**致谢**：感谢Emilie Poupin在粘度测量方面的培训，以及Bruno Aliès和Caroline West的富有成效的讨论。同时感谢Céline Franc和Gilles de Revel提供质谱设施的使用。本研究得到了波尔多代谢组设施（Bordeaux Metabolome）的支持，并获得了法国国家研究署（ANR）的资助，项目编号为ANR-11-INBS-0010、ANR-21-ESRE-0035和ANR-24-INBS-0012（MetaboHUB基础设施项目）。