用于高效将siRNA输送穿过肺屏障的脂质-聚合物混合纳米颗粒：关于可电离脂质作用的机制洞察

《Journal of Colloid and Interface Science》：Lipid@polymer hybrid nanoparticles for efficient siRNA transport across the lung barriers: Mechanistic insights into the role of Ionizable lipids

　　苏西·布鲁斯科（Susy Brusco）、埃尔西莉亚·维拉诺（Ersilia Villano）、特蕾莎·西尔韦斯特里（Teresa Silvestri）、阿马尔·J·阿扎德（Amar J. Azad）、穆格·莫尔贝（Muge Molbay）、伊万娜·丹杰洛（Ivana d’Angelo）、阿格妮泽·米罗（Agnese Miro）、保拉·布罗卡（Paola Brocca）、奥利维亚·M·默克尔（Olivia M. Merkel）、莎拉·赫德特里希（Sarah Hedtrich）、加布里埃拉·科斯塔贝莱（Gabriella Costabile）、弗朗切斯卡·昂加罗（Francesca Ungaro）
那不勒斯费德里科二世大学（University of Napoli Federico II）药学系，意大利那不勒斯80131

**摘要**
基于越来越多的证据表明可电离脂质能够改善RNA的递送效果，本研究开发了一种由可电离脂质与聚（乳酸-羟基乙酸）（PLGA）共聚物制成的纳米颗粒（iLipid@PLGA hNPs）。这些纳米颗粒的PLGA核心表面经过了修饰，分别添加了1,2-二油酰氧基-3-二甲氨基丙烷（DODMA）、1,2-二油酰-3-三甲基氨基丙烷（DODAP）或专有的支链氨基脂质ALC-0315。iLipid@PLGA hNPs经过设计，以满足吸入给药的关键要求。通过全面的物理化学表征，研究了可电离脂质的选择如何影响其pH响应性、表面组成和颗粒结构。体外实验显示出有效的siRNA包封能力、可调节的释放动力学，以及与黏液成分之间的较低相互作用（通过紫外-可见光光谱、动态光散射和小角X射线散射分析验证）。共聚焦显微镜观察显示，转染了iLipid@PLGA hNPs的A549细胞中，AlexaFluor647标记的siRNA与溶酶体的共定位随时间减少，这表明DODMA@PLGA hNPs在逃逸到内体方面的效果更佳。使用针对GAPDH的siRNA（siGAPDH）进行的功能验证证实了这些纳米颗粒在正常人类支气管上皮细胞（NHBEs）中的摄取和基因沉默效果，进一步证明了DODMA@PLGA hNPs的优越性能。最后，荧光标记的DODMA@PLGA hNPs成功穿越了模拟人体支气管上皮屏障的3D气-液界面模型。这些发现凸显了可电离脂质在聚合物纳米颗粒中的广泛应用潜力，表明iLipid@PLGA hNPs是高效且多用途的siRNA治疗载体。这一突破为它们在呼吸系统纳米医学和肺部疾病局部治疗中的进一步发展奠定了基础。

**1. 引言**
目前有多种非病毒载体（包括脂质和聚合物基载体）正在被开发用于将RNA药物有效递送到肺部[1]。其中，特别是由可生物降解材料（如聚（乳酸-羟基乙酸，PLGA）制成的聚合物纳米颗粒，具有多种优势，包括对RNA的保护和可控释放，以及能够避开体内外的自然清除机制。然而，这些纳米颗粒在与生物环境的界面行为对于突破肺部屏障至关重要。因此，表面工程在设计用于吸入的PLGA纳米颗粒时起着关键作用。最近的研究进展通过用脂质对PLGA进行表面工程，开发出了具有黏液惰性和细胞穿透能力的核壳型纳米颗粒（hNPs），从而整合了聚合物和脂质纳米平台的优势[2][3][4]。在我们的研究中，重点关注了二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）（肺表面活性剂的主要成分）和2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂乙醇胺-聚（乙二醇）2000（DSPE-PEG）这两种脂质，前者可通过PEG化增强脂质@PLGA hNPs的黏液穿透能力[5][6]。然而，为了进一步提高脂质@PLGA hNPs的转染效率，系统性地研究不同脂质的潜力显得十分必要。
在各种脂质中，可电离脂质因其能够在体外和体内增强RNA递送效果（甚至在人体内也是如此[7]而备受关注。这类脂质会在环境pH变化下发生质子化与去质子化反应，从而显著提高纳米颗粒与细胞膜（特别是酸性内体环境）的相互作用能力[8]。可电离脂质在酸性条件下会破坏内体膜，促进RNA释放到细胞质中并防止其被内体-溶酶体降解[9]。这一独特特性使得可电离脂质成为突破细胞屏障的优秀候选材料。尽管关于可电离脂质在纳米颗粒中的作用已有大量研究，但它们在聚合物纳米颗粒（如iLipid@PLGA hNPs）中的潜在功能仍需进一步探索。最近的一项关于肌肉注射mRNA疫苗的研究表明，使用C12–200这种模型可电离脂质改造的mRNA/聚合物纳米颗粒比传统纳米颗粒更能激发强烈的抗原特异性IgG反应，并更有效地减少鼻腔内的病毒载量[10]。

在这项工作中，我们利用可电离脂质的潜力设计了能够穿透黏液和细胞的iLipid@PLGA hNPs，用于肺部的siRNA递送。根据其结构特性，选择了三种模型脂质进行实验。由于已知可电离脂质的饱和度会显著影响其流动性和递送效率，因此选择了不饱和脂质1,2-二油酰氧基-3-二甲氨基丙烷（DODMA）和1,2-二油酰-3-三甲基氨基丙烷（DODAP）。其中，DODAP的结构与首个获得FDA批准的siRNA疗法patisiran（Onpattro?，Alnylam Pharmaceuticals, Inc.）中使用的离子脂质Dlin-MC3-DMA的油酰尾部相似，具有出色的肝脏基因沉默效果。第三种脂质是6-((2-己基十四酰)氧)-N-(6-((2-己基十四酰)氧)己基)-N-(4-羟基丁基)己烷-1-胺（ALC-0315），这是一种多尾可电离脂质，其结构特点为具有三个或更多尾部，预计能够通过增加尾部截面增强对内体的破坏能力，并已在辉瑞-BioNTech的COVID-19疫苗中取得良好效果[11]。所有制备的iLipid@PLGA hNPs都经过了尺寸、表面电荷、siRNA包封效率和体外释放速率的全面表征。在生理相关pH值下进行的小角X射线散射（SAXS）分析提供了这些纳米颗粒的结构信息。通过A549腺癌细胞中的体外转运研究进一步探究了它们逃避内体-溶酶体系统的能力。结合多种体外实验（包括黏蛋白-颗粒相互作用、扩散研究和人工黏液模型中的SAXS分析），预测了iLipid@PLGA hNPs在生理条件下的行为。最后，使用针对GAPDH的报告基因siRNA在正常人类支气管上皮细胞（NHBEs）中的体外基因沉默实验验证了这些纳米颗粒的有效递送能力。

**2. 实验部分**
**2.1. 材料**
Resomer RG 502H（未封端PLGA，50:50比例，固有粘度0.16–0.24 dL/g）购自Evonik Industries AG（德国）。1,2-二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂乙醇胺-聚（乙二醇）2000（DSPE-PEG）由Lipoid GmbH（瑞士）提供。1,2-二油酰氧基-3-二甲氨基丙烷（DODMA）、1,2-二油酰-3-三甲基氨基丙烷（DODAP）和((4-羟基丁基)氨基二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基十四酸酯)（ALC0315）购自Avanti? Polar Lipids（美国）。Silencer? GAPDH siRNA、Silencer?阴性对照siRNA（13,000?g/mol，21?bp）、Quant-IT? RiboGreen?试剂盒以及UltraPure?去DNase/RNase蒸馏水（UPWDNase/RNase free）购自Life Technologies（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）。柠檬酸、柠檬酸钠、氢氧化钠、蛋黄乳液、脱氧核糖核酸（DNA）、二乙烯三胺五乙酸（DTPA）、RPMI 1640氨基酸溶液、牛黏蛋白II型、二氯甲烷（DCM）和96%（v/v）乙醇购自Merck KGaA（德国达姆施塔特）。透膜Transwell?支架购自Corning（美国纽约）。荧光标记的聚（乳酸-羟基乙酸）-罗丹明B（PolySciTech? PLGA-Rhod，LG 50:50，Mn 10,000–30,000?Da）购自Microtech Srl（意大利）。所有化学品和试剂均为分析级，使用前无需进一步纯化。超纯水（UPW，Type I）使用Purelab? Option-Q系统（Elga Labwater，意大利）制备。

**2.2. 可电离脂质@PLGA杂化纳米颗粒的制备与表征**
可电离脂质修饰的PLGA纳米颗粒（iLipid@PLGA hNPs）采用双乳液法制备。具体步骤如下：首先将100?μL水相（W1）用超声处理（30?s）乳化到含有10.0?mg PLGA（1% w/v）和脂质混合物的有机相（O）中，脂质混合物中分别含有DPPC和DSPE-PEG（DPPC/PLGA比例分别为1:33 w/w和1:20 w/w），以及选定的可电离脂质（DODMA、DODAP或ALC0315，可电离脂质/PLGA比例为1:20 w/w）。超声处理后加入1?mL UPW（W2），再超声处理30?s。将得到的双乳液（W1/O/W2）倒入6.25?mL乙醇中，在通风橱中以500?rpm转速搅拌直至有机溶剂完全蒸发。去除溶剂后，将颗粒重新悬浮在UPW中至理论浓度11.3?mg/4?mL。随后在4?°C下以4660 rcf离心20?min（LC, D1524R冷藏微量离心机）。去除上清液后，将沉淀物重新悬浮在1?mL UPW中。
对于负载siRNA的颗粒，在整个生产过程中使用不含DNase/RNase的超纯水。siRNA以0.2或1?nmol/100?μL的浓度加入W1相中。荧光标记的hNPs（iLipid@PLGArhod）通过将PLGA-Rhod以10% w/w的比例加入O相中制备[12][13]。

制备完成后，使用Zetasizer Nano ZS（Malvern Instruments Ltd., 英国）对iLipid@PLGA hNPs的流体力学直径（DH）和多分散指数（PDI）进行表征。使用同样的仪器通过电泳光散射（ELS）测定了ζ电位。将iLipid@PLGA hNP制剂稀释在pH?3.8的水和柠檬酸缓冲液中，以模拟生理和内体条件进行进一步分析。结果以三个独立批次的平均值±标准差（SD）表示。

**2.3. siRNA的加载与释放**
**2.3.1. 包封效率**
iLipid@PLGA hNPs中的siRNA包封量通过测定未包封的siRNA量间接评估[6]。生产后，将hNPs在4?°C下以7000 rcf离心20?min，然后按照制造商说明用Quant-IT? RiboGreen?试剂处理上清液。使用分光荧光仪（λex: 480?nm/λem: 520?nm，ProMega? GloMax? Plate reader，美国）进行定量分析。包封效率定义为检测到的siRNA量与理论负载量的比值×100；实际负载量以每mg hNPs中封装的siRNA纳米摩尔数表示。所有结果以三个不同批次的平均值±标准差（SD）呈现。

**2.3.2. 肝素置换 assay**
为了评估siRNA负载的iLipid@PLGA hNPs对肝素的置换能力，测试了其对肝素的抗性。将100?μL hNP制剂与900?μL高分子量肝素水溶液（30?mg/mL）混合，hNP与肝素的重量比为1:200。混合物在37?°C下孵育30?min。孵育后，将hNP离心（7000 rcf，4?°C，20?min），然后按照上述方法用Quant-IT? RiboGreen?处理上清液。从用Quant-IT? RiboGreen?处理的肝素溶液的吸光度（ABS）中减去未处理hNP上清液的吸光度。通过分析siRNA在肝素溶液（1:200 w/w）中的系列稀释液得到校准曲线。

**2.3.3. 球状凝胶电泳**
通过球状凝胶电泳评估siRNA在iLipid@PLGA hNPs PLGA核心内的结合情况。在1× TAE缓冲液中制备了含有SYBR Safe染料（1:10,000）的1.5%（w/v）球状凝胶。纳米粒子样品、hNP生产后收集的上清液以及不同浓度的裸siRNA（作为对照）与6倍DNA染色剂混合，并加载到凝胶上。使用Quant-iT? RiboGreen?检测试剂对上清液进行了预分析，以确定包封效率。电泳在60伏特下进行45分钟，然后使用GelDoc成像系统（Bio-Rad，美国）观察凝胶结果。

2.3.4 体外siRNA释放动力学
在磷酸盐缓冲盐水溶液（PBS，120 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM磷酸盐，pH=7.4）中，于37°C条件下对hNP分散体进行了释放研究。简言之，将10 μL含有siRNA的iLipid@PLGA hNPs稀释至最终浓度为0.02 nmol/mL，并在37°C的恒温摇动水浴（ShakeTemp SW 22，Julabo Italia，意大利）中孵育。在预定时间点，离心样品并取出800 μL上清液，将沉淀物重新悬浮在新鲜培养基中至最终体积为1 mL。使用上述Quant-IT RiboGreen试剂盒检测上清液中的siRNA浓度。实验重复三次，结果以随时间变化的siRNA释放百分比±标准差（SD）的形式报告。

2.4 可电离脂质@PLGA纳米粒子的表面分析
2.4.1 固定水层厚度（FALT）
固定水层厚度（FALT）是通过评估离子强度对iLipid@PLGA hNPs表面电荷的影响来确定的，具体方法如[4]所述。简而言之，逐渐增加NaCl浓度到hNPs的水分散液中（0.5 mg/mL），并监测ζ电位的变化。利用ln(ζ)与k（其中k=3.3·C^0.5，k^-1表示Debye长度，C为NaCl的摩尔浓度）的线性回归来估算壳层厚度（单位为纳米）[15], [16], [17]。结果基于三个独立实验的平均值±标准差（SD）报告。

2.4.2 使用ELISA测定PEG含量
根据制造商的程序（Cloud Clone Corporation，美国），采用酶联免疫吸附测定（ELISA）方法对iLipid@PLGA hNPs表面的PEG进行定量，具体方法如先前发表的[4]。测试了浓度为1.5 mg/mL的DODMA@PLGA、DODAP@PLGA和ALC0315@PLGA在450 nm波长下的PEG含量（GloMax? Plate reader，Promega Italia Srl，意大利）。通过在5-10°C下用UPW溶解PEG 2000（0.5 μg/mL）并磁力搅拌2小时（测量透射率以确保PEG溶解度>95%）来建立校准曲线。对于定量测量，将样品的OD值与相应的校准曲线进行比较。结果以三次实验平均值的PEG释放百分比±SD的形式报告。

2.5 差示扫描量热法
使用Q20量热仪（TA Instruments，美国）进行差示扫描量热（DSC）分析，该仪器事先用高纯度铟标准品进行了校准。hNPs在-80°C和0.1 mbar下使用Lyovapor L-200冻干机（BUCHI Italia s.r.l., Italy）冻干24小时。精确称量约4 mg的每个冻干样品，并密封在密封良好的Tzero铝盘中。样品以5°C/min的恒定速率从10°C加热到250°C。所有测量都在氮气氛围下进行，纯化气流速为50 mL/min。空密封铝盘作为参考。使用TA Universal Analysis软件获取热参数数据。对纯组分和得到的杂交纳米粒子配方都进行了DSC测试。

2.6 小角X射线散射（SAXS）分析
SAXS测量在法国格勒诺布尔的ESRF同步辐射设施的Id02光束线上进行。样品在含有siRNA的iLipid@PLGA hNPs的储备分散液中制备（10 mg/mL，水或柠檬酸钠缓冲液）。使用Eiger2 4 M探测器，在10米和1米的两种不同样品-探测器距离下进行测量，以覆盖约1 μm-1 nm的直接空间区间，并确保有效重叠。在整个分析过程中使用玻璃毛细管。同时测量空毛细管以及装有水或柠檬酸钠缓冲液的毛细管以进行背景扣除。siRNA iLipid@PLGA hNPs的SAXS数据在室温下收集。散射轮廓使用SAXS utilities软件包[18]处理，并通过SasView拟合软件[19]（http://www.sasview.org/）进行分析，该软件采用core–multishell sphere_sld形状因子模型，并结合了Percus–Yevick闭合方法[20], [21]来分析。

2.7 体外气溶胶性能
2.7.1 空气动力学粒子尺寸分布的测量
如上所述制备的荧光标记的iLipid@PLGA hNPs的气溶胶化特性在体外通过振动网（VMT）雾化器（InnoSpire Go，Philips Healthcare）后进行了评估。使用配备NGI Cooler? Shelf（Copley Scientific，英国）的下一代撞击器（NGI）根据欧洲标准化委员会（CEN）标准方法研究配方的沉积模式，采样速率为15 L/min，并在微孔收集器（MOC）中插入过滤器。每次测试将1.5 mL的iLipid@PLGA hNPs悬浮液（0.9% NaCl）转移至雾化器的储液池，该储液池通过口件适配器连接到NGI的进气口。雾化器以15 L/min的速率运行，气溶胶通过撞击器直至干燥。沉积在NGI收集杯和进气口中的hNPs量使用适量的0.5 M氢氧化钠（2-5 mL）进行定量回收。根据欧洲药典计算实验的质心空气动力学直径（MMAD）和几何标准差（GSD），并绘制每个收集杯中保留的粒子累积质量（以回收总质量的百分比表示）与相应阶段的截断直径的关系图。粒子的MMAD从线穿过50%标记的点确定，GSD定义为：
GSD = SizeX * SizeY，
其中Size X是线穿过84%标记的点尺寸，Size Y是线穿过16%标记的点尺寸。细颗粒分数（FPF）根据实际沉积在第三至第七阶段的hNPs量（MMAD < 5.39 μm）与初始装载到雾化器腔室的hNPs量计算，公式如下：
FPF = (iLipid@PLGA hNPs在cup 3至7中的量) / (加载到设备中的iLipid@PLGA hNPs总量) × 100

可吸入分数（RF）是空气动力学直径≤5 μm的粒子百分比，相对于根据以下公式计算的总发射剂量：
RF = (iLipid@PLGA hNPs在cup 3至7中的量) / (沉积在NGI中的iLipid@PLGA hNPs总量) × 100
为了确认iLipid@PLGA hNPs的气溶胶化后的胶体稳定性，使用动态光散射（DLS）测量沉积在杯4中的hNPs的尺寸和表面电荷。通过电泳光散射（ELS）确定表面电荷时，首先将hNPs稀释在水和柠檬酸缓冲液（pH 3.8）中。所有测量在室温下进行，结果以三次实验的平均值±标准差（SD）表示。以分散在盐水溶液中的iLipid@PLGA hNPs作为参考。

2.7.2 气溶胶化后siRNA稳定性和释放动力学的评估
为了评估iLipid@PLGA hNP气溶胶化后的siRNA完整性，进行了琼脂糖凝胶电泳。为了确保最大程度地回收输送的剂量，使用Respimat? Soft Mist吸入器（SMI）将iLipid@PLGA hPs分散液（150 μL）气溶胶化，并收集到放置在Actuator出口的1.5 mL微量离心管中。电泳按照上述方法进行。作为对照，也在相同条件下处理了未气溶胶化的iLipid@PLGA hPs和裸siRNA。气溶胶化后，收集的iLipid@PLGA hPs还在37°C下的磷酸盐缓冲盐水溶液（PBS，120 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM磷酸盐，pH=7.4）中进行了体外释放研究。简言之，将10 μL含有siRNA的iLipid@PLGA hPs稀释至最终浓度为0.02 nmol/mL并在37°C下孵育以进行释放研究。实验重复三次，结果以随时间变化的siRNA释放百分比±标准差（SD）的形式报告。

2.8 iLipid@PLGA hNPs在黏液环境中的体外行为
2.8.1 与黏蛋白的体外相互作用
如先前所述[22]，通过结合UV–vis和DLS分析评估iLipid@PLGA hPs与黏蛋白的相互作用。实验使用在UPW（pH 7.0）或柠檬酸缓冲液（pH 3.8）中制备的II型牛黏蛋白（0.08% w/v）的水分散液进行。搅拌过夜后，将分散液在4°C下以6000 rcf离心20分钟，收集含有黏蛋白的上清液以进一步分析。通过在室温下孵育0、30和60分钟时监测10 μL hNP水分散液在0.08%黏蛋白中的吸光度来评估hNP在黏蛋白存在下的光散射。还记录了单独的黏蛋白和在UPW中分散的hNP（浓度为1 mg/mL）的参考吸光度值。所有实验重复三次，结果以650 nm处的吸光度±标准差（SD）随时间的变化表示。

2.8.2 在模拟黏液中的渗透研究
使用荧光iLipid@PLGA hNPs（含有罗丹明标记的PLGA，iLipid@PLGARhod hNPs）进行了体外渗透研究，如先前报道[6]。简要而言，将75 μL AM加入到带有可渗透聚碳酸酯膜（直径6.5 mm，孔径8 μm；Corning Incorporated，美国）的Transwell?插件中。随后，在含有300 μL模拟间质液（SILF）的24孔板中的插件上加入25 μL hNP分散液（2 mg/150 μL）。在预定时间点，抽取SILF并用相同体积的新鲜培养基替换。样品用700 μL 0.5 M NaOH稀释并搅拌1小时以降解PLGA基质。使用GloMax Explorer微孔读数器（Promega，意大利）在λex 520 nm和λem 580–640 nm的范围内通过光谱荧光分析测量hNP含量。通过降解iLipid@PLGARhod hNPs标准溶液的系列稀释液生成校准曲线。在2–200 μg/mL范围内确认线性（r2 ≥ 0.999）。实验重复三次，结果以随时间变化的渗透总hNP百分比±标准差（SD）表示。

2.8.3 在人工黏液中的SAXS分析
也在人工黏液（AM）中对含有siRNA的iLipid@PLGA hNPs进行了SAXS分析。简要而言，将hNP（名义浓度10 mg/mL）在不同AM:hNPs体积比（即1:1、1:2和1:3 v/v）下稀释在AM中。分析方法如第2.5节所述，使用内径为2 mm的聚碳酸酯毛细管（ENKI-MICROTUBES，Enki Srl，意大利）。空毛细管和装有水的毛细管用于背景扣除。

2.9 iLipid@PLGA hNPs在肺上皮细胞中的溶酶体隔离的体外评估
通过在A549腺癌细胞中评估AlexaFluor647标记的siRNA和Lysotracker?绿色荧光染料的共定位，来评估siRNA负载的iLipid@PLGA hNPs逃离内体的能力。细胞以每孔10,000个细胞的密度接种在带腔室的盖玻片（μ-Slide 8 Well，ibidi，Grafelfing，德国）上，然后在转染前24小时进行培养。之后，用含有siRNA负载的iLipid@PLGA hNPs（每个孔10 pmol AF647-siRNA）转染细胞3小时和24小时。孵育后，向每个孔中加入75 nM Lysotracker? Green溶液（Thermo Fisher Scientific，Darmstadt，德国）稀释在EMEM中1小时，并用PBS洗涤两次。细胞用4% paraformaldehyde溶液在4°C下固定15分钟，然后用PBS洗涤三次。最后，用1 μg/mL的4′,6-二胺基-2-苯基吲哚（DAPI，Thermo Fisher Scientific，Darmstadt，德国）染色细胞核15分钟，再用PBS洗涤两次。使用配备63×物镜的SP8倒置共聚焦显微镜（Leica Camera，Wetzlar，德国）进行细胞成像，并使用JACoP插件在ImageJ中计算皮尔逊相关系数（PCC）。使用ImageJ软件和Coloc2插件（n = 6）获得结果，并以平均值±标准差（SD）表示[23]。

2.10 体外GAPDH基因沉默
从Epithelix（Geneva，瑞士；供体AB0839）获得的正常人支气管上皮细胞（NHBEs）按照制造商的说明在PneumaCult?-Ex Plus培养基（STEMCELL Technologies，Vancouver，加拿大）中培养。在12孔板中达到约80%的细胞融合度（估计每个孔有4×10^5个细胞）后，细胞被用负载有针对GAPDH的siRNA（siGAPDH_iLipid@PLGA hNPs）的iLipid@PLGA hNPs处理，浓度分别为0.5 mg/mL和1 mg/mL。作为阴性对照，使用了负载相同量非靶向siRNA（siNC_iLipid@PLGA hNPs）的iLipid@PLGA hNPs。此外，还进行了基于Lipofectamine的siGAPDH转染作为基因沉默的阳性对照，并使用siGAPDHNC作为阴性对照。处理时间为24小时、48小时和72小时，之后提取RNA。总RNA使用Qiagen RNeasy spin-column纯化试剂盒进行分离，并通过DNase处理步骤去除残留的DNA。RNA的数量和纯度使用NanoDrop One分光光度计（Thermo Fisher Scientific，德国达姆施塔特）进行测定。反转录使用RT2 First Strand Kit（Qiagen）进行，定量PCR使用Custom RT2 Profiler PCR Array（Qiagen）和SYBR Green Master Mix在qTOWER3实时PCR系统（Analytik Jena）上进行。GAPDH（目标基因）的表达量被量化并归一化到TBP（TATA-box结合蛋白，作为内参基因）（表1）。相对表达水平使用2^-ΔΔCT方法计算。

表1. RT-PCR的引物序列。

**2.11 体外在3D人支气管上皮模型中的传输**
2.11.1 3D支气管上皮模型的构建
原代正常人支气管上皮（NHBE）细胞和正常人肺纤维母细胞（NHLFb）（Epithelix，瑞士日内瓦）根据制造商的指示在特定的培养基中培养。NHLFb被嵌入牛胶原I基质（Cellsystems，德国特罗伊兹多夫）中，并接种到12孔转孔插件中以模拟支气管的细胞外环境。在加入纤维母细胞之前，用2 M NaOH将胶原基质中和到生理pH值。在室温下聚合并在无CO2的37°C培养箱中稳定后，向顶侧和基底室中加入PneumaCult-Ex Plus培养基（STEMCELL Technologies，加拿大温哥华）。随后，将9×10^5个NHBE细胞接种到基质上，24小时后，将构建物转移到气-液界面。培养物在PneumaCult-ALI培养基中维持21天，每两天更换一次培养基。第18天，用PBS冲洗模型的顶侧以去除多余的黏液。完全分化的支气管上皮模型在第21天可用于实验。

**2.11.2 体外传输研究**
在第21天，将100 μL负载有荧光标记的siRNA的DODMA@PLGARhod hNPs（浓度为0.5 mg/mL和1 mg/mL）应用于顶侧表面，并培养5小时或24小时。培养完成后，去除培养基，将模型嵌入组织冷冻介质（Leica Microsystems），在液氮中快速冷冻，并储存在-80°C。使用冷冻切片机（Leica Microsystems）制备12 μm厚的冷冻切片，将其安装在玻璃载玻片上，并在室温下风干。对于分析，根据标准协议对切片进行染色。对于免疫荧光染色，切片先用4%甲醛固定，然后用含0.0025% BSA和0.025% Tween-20的PBS冲洗（Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄），再用正常山羊血清（PBS中的1:20比例）封闭。随后，切片在4°C下与一级抗体孵育过夜。经过一系列PBS冲洗后，切片在室温下与二级抗体IgG Alexa Fluor?488（1:400；Abcam，英国剑桥）孵育1小时。之后，将切片嵌入4′,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）抗褪色 mounting medium（Sigma-Aldrich，德国达姆施塔特）中，并通过荧光显微镜（BZ-8000；Keyence，德国纽因斯堡）进行分析。

**2.12 统计分析**
对于体外实验数据的统计分析，使用GraphPad Prism 8进行了双尾学生t检验（GraphPad Software, Inc.，美国加利福尼亚州圣地亚哥）。数据以平均值±标准差（SD）表示，统计显著性在p < 0.05时视为显著。使用以下阈值表示显著性水平：*p< 0.05；**p< 0.005；***p< 0.0005；****p< 0.0001。

**3. 结果与讨论**
3.1 iLipid@PLGA hNPs的设计与开发
通过用包含DPPC、DSPE-PEG和三种可离子化脂质（DODMA、DODAP或ALC-0315，它们在头基团、连接基团或碳氢链尾部有所不同，即具有不同的分子形状）的脂质混合物工程化PLGA纳米粒子的表面，成功开发了一组可离子化的iLipid@PLGA hNPs。DODMA和DODAP含有甘油骨架、两个油酰链（C18:1）以及三级胺或一级胺头基团，这导致它们的pKa值不同（分别在TNS结合测定中为6.59和5.59）。ALC-0315是COVID-19 mRNA疫苗的关键成分，其特征是分支的尾部，形成了独特的圆锥形几何结构（pKa为6.09）[24] [25] [26]。通过深入的配方研究，优化了iLipid@PLGA hNPs在吸入方面的质量属性（即大小、多分散性、形态和结构），采用双乳化技术生产（表S1，图1）。

**3.2 实现siRNA的捕获和从iLipid@PLGA hNPs中的释放**
开发的iLipid@PLGA hNPs旨在有效地将siRNA递送到肺部。为此，关键的设计考虑因素包括：i) siRNA装载能力的灵活性，以允许调节剂量；ii) 高封装效率，以容纳治疗相关的siRNA剂量；iii) 可调的siRNA释放曲线，以支持长效性和减少给药频率。基于这一理念，将一种模型siRNA以两种不同的比例添加到iLipid@PLGA hNPs中，即每10 mg PLGA分别添加0.2或1.0 nmol。所得的siRNA_DODMA@PLGA、siRNA_DODAP@PLGA和siRNA_ALC0135@PLGA的相应胶体属性得到了充分表征（表1）。在4°C和25°C下进行了稳定性研究，确认了胶体属性的稳定性长达12天（图S1）。此外，还评估了siRNA的捕获效率和体外释放曲线（图2）。无论siRNA在配方中的存在与否及其数量，iLipid@PLGA hNPs均满足吸入设计标准，即直径（DH）低于200 nm且多分散指数（PDI）约为0.1（表2）。

结果通过NTA测量得到了证实，提供与计算出的DH一致的平均值，SPAN范围为0.4至0.7。值得注意的是，添加到配方中的siRNA量越多，SPAN越低（表1），这可能表明siRNA骨架与iLipid@PLGA基质之间的相互作用在hNP形成过程中起到了作用。这一假设通过使用模型siRNA进行的封装研究结果得到了支持。实际上，当向配方中添加更多的核酸时，所有负载siRNA的iLipid@PLGA hNPs的siRNA捕获效率都提高了（对于0.2 nmol/10 mg和1 nmol/10 mg的PLGA理论装载量，分别约为60%和80%）（图2B）。为了进一步确认siRNA的封装，进行了琼脂糖凝胶电泳（图2C）。泳道1-2显示了预期的裸siRNA对照。相比之下，泳道3-4（0.1和0.05 nmol/mL的裸siRNA）没有可见的条带，表明达到了检测限。对于所有iLipid@PLGA纳米粒子（泳道5、7和9），siRNA信号保持在装载孔中，显示出在hNP内的强结合。在相应的上清液（泳道6、8和10）中只观察到微弱的条带。这些结果与图2B中报告的高封装效率（约80%）一致。

为了研究siRNA在载体内的分布，使用肝素（一种高度阴离子的多糖，可与纳米粒子表面的结合位点竞争）从iLipid@PLGA hNPs中置换表面结合的siRNA。肝素置换试验还评估了表面吸附的siRNA量如何随选定的可离子化脂质而变化。虽然siRNA_ALC0135@PLGA hNPs在表面吸附了更多的siRNA，但代价是总封装的siRNA量减少，而siRNA_DODMA@PLGA和siRNA_DODAP@PLGA hNPs的表面相关siRNA量较少。这种行为可能是由于ALC0315的独特结构，它含有双分支的碳氢链，导致其具有圆锥形几何结构，从而影响其整体分子组织和与siRNA的相互作用[11]。hNP表面吸收的siRNA量不可避免地影响了三种不同iLipid@PLGA hNPs的体外释放曲线（图2B）。所有配方都表现出特征性的双相释放曲线，包括最初的快速释放阶段，随后在接下来的15天内持续释放，这可能是由siRNA通过逐渐被侵蚀的PLGA基质扩散控制的。在所有配方中，0.2 nmol装载量的siRNA释放百分比高于1 nmol装载量。在测试的系统中，siRNA_ALC0315@PLGA在15天时的累积释放量最高（~85%；对于1 nmol装载量分别为~50%），其次是siRNA_DODMA@PLGA（~65%；对于1 nmol装载量分别为~45%）和siRNA_DODAP@PLGA（~45%；对于1 nmol装载量分别为~40%）。在0.2 nmol条件下，尤其是在最初的24小时内，观察到更明显的初始快速释放。这种行为得到了数据的支持，表明较低的siRNA装载量对应于更多的siRNA吸附在hNP表面。表面吸附的siRNA与hNP的结合较为松散，因此在与水性介质接触时迅速释放，导致0.2 nmol条件下的早期释放曲线较为急剧。相反，在1 nmol装载量下，更多的siRNA似乎被封装在PLGA核心中，导致释放较为温和且持续。总体而言，这些结果表明，表面相关siRNA与封装siRNA之间的装载依赖性分配在调节释放动力学中起关键作用。与Villano等人[13]的观点一致，这样的混合系统通常表现出由扩散过程和载体结构组织相互作用控制的释放行为。

**3.3 评估气雾化后hNPs的体外空气动力学行为和结构稳定性**
由于纳米粒子在肺部的沉积关键决定因素是体外空气动力学行为，因此在使用VMT便携式雾化器（即Philips Healthcare的InnoSpire Go）和预冷的NGI（操作流速为15 L/min）递送后，评估了开发的iLipid@PLGA hNPs的气雾化性能，并分离了MOC，符合CEN标准方法[28]。在整个NGI（纳米粒悬浮液注射）阶段，hNPs的沉积特性通过荧光光谱分析进行了研究，这些分析使用了罗丹明标记的siRNA负载的iLipid@PLGA hNPs，结果显示其具有与未标记的iLipid@PLGA hNPs相同的胶体性质（数据未显示）。图3A和B分别报告了根据不同NGI阶段的截断直径回收到的iLipid@PLGA hNPs的累积质量以及NGI沉积模式。不同配方之间的空气动力学行为没有显著差异，表明它们的分散性和肺部沉积特性基本相当。对细颗粒的空气动力学评估显示，其平均移动直径（MMADexp）低于3微米（见表S2），这一数值与iLipid@PLGA hNPs有效输送到肺部远端区域的能力一致。正如预期的那样，FPF（肺泡穿透分数）值受到NGI阶段回收到的hNP总量的影响，高的RF（呼吸频率）值支持了这样一个假设：部分气溶胶化的iLipid@PLGA hNPs具有低于5微米的MMAD，这有利于它们到达下呼吸道。

图3. 通过便携式VMT雾化器InnoSpire Go（飞利浦医疗）递送的iLipid@PLGA hNPs的体外气溶胶性能。（A）根据截断直径回收的累积质量；（B）NGI沉积模式；（C）在生理和酸性pH值下（实心条）以及雾化后（虚线条）的颗粒大小、多分散指数（PDI）和ζ电位。进行了三次实验，结果以平均值±标准差（n = 3）表示。

总体而言，结果表明，雾化iLipid@PLGA hNPs是一种可行的方法，可以直接将高浓度的siRNA递送到肺上皮细胞。然而，雾化过程可能会使纳米载体受到较大的剪切应力，这可能会影响其结构稳定性，促进siRNA的丢失，并最终降低治疗效果[29]、[30]、[31]。因此，我们研究了雾化对不同iLipid@PLGA hNPs配方完整性的影响。为此，收集了沉积在NGI中央杯中的iLipid@PLGA hNPs（第4阶段，截断直径<3.3微米），并评估了它们的关键胶体性质，包括流体动力学直径、PDI和pH响应行为。如图3C所示，所有iLipid@PLGA hNPs在雾化过程中表现出很强的稳定性。值得注意的是，雾化后iLipid@PLGA hNPs的大小和PDI没有显著变化。此外，在pH 7和3.8下雾化前后的ζ电位测量证实了hNPs的pH响应性，这归因于与hNP表面结合的可电离脂质。为了进一步验证雾化后iLipid@PLGA hNPs的稳定性，我们通过Respimat? SMI评估了封装siRNA的结构完整性以及体外siRNA释放动力学。使用琼脂糖凝胶电泳（图4A）评估了封装siRNA的结构完整性。 lanes 3–4、5–6和7–8清楚地显示，在雾化前后，所有三种不同配方（siRNA_DODMA@PLGA、siRNA_DODAP@PLGA和siRNA_ALC0315@PLGA）中的siRNA都保持了其定量结合。控制组（裸露的siRNA，lane 1）中可见的自由siRNA条带缺失，表明SMI雾化过程没有导致货物泄漏。为了确认这些发现，还评估了雾化后siRNA的释放特性。如图4B所示，雾化过程并未影响任何测试配方的siRNA释放曲线。在14天的观察期内，所有雾化后的iLipid@PLGA hNPs的释放趋势与其未雾化的情况相当，无论在pH 7还是37°C条件下。这一观察结果强烈证明了所生产的iLipid@PLGA hNPs的结构稳定性，表明它们能够抵抗SMI雾化过程中遇到的机械和剪切应力。

为了进一步阐明特定可电离脂质和siRNA的添加对iLipid@PLGA hNPs的表面、结构和热性质的影响，采用了一种多模态表征方法，包括FALT测量、定量PEG分析、小角X射线散射（SAXS）和差示扫描量热法（DSC）。

如图5A所示，无论可电离脂质的类型如何，FALT测量都表明表面存在来自DSPE-PEG的PEG，PEG可以通过氢键和空间相互作用保留水分子。然而，与DODAP@PLGA和ALC0315@PLGA hNPs（约2.6纳米）相比，DODMA@PLGA hNPs的壳层更厚（3.6纳米）。通过特定的竞争性抑制酶免疫测定法[4]确认了iLipid@PLGA hNPs上的PEG存在。在hNP表面的PEG基团与PEG参考标准物之间建立了竞争性结合，两者都竞争有限的抗体结合位点。定量分析显示，PEG表面密度随着hNPs的脂质组成而有所不同（图5B）。具体来说，DODAP@PLGA hNPs的PEG含量最高（约10纳克/毫克），其次是DODMA@PLGA hNPs（约8纳克/毫克），而ALC0315@PLGA hNPs的EGP含量明显较低（约3纳克/毫克）。这种差异可能源于ALC0315脂质的更大体积结构，这可能会在空间上阻碍或部分掩盖iLipid@PLGA hNP表面的PEG链[24]、[25]、[26]。鉴于PEG在促进hNP渗透进入气道粘液中的作用，观察到的PEG化差异预计会影响这些配方的体内行为[32]。

为了进一步了解特定可电离脂质和siRNA添加对iLipid@PLGA hNPs表面、结构和热性质的影响，采用了多模态表征方法，包括FALT测量、定量PEG分析、小角X射线散射（SAXS）和差示扫描量热法（DSC）。

如图5A所示，无论可电离脂质的类型如何，FALT测量都表明表面存在来自DSPE-PEG的PEG，后者可以通过氢键和空间相互作用保留水分子。尽管如此，与DODAP@PLGA和ALC0315@PLGA hNPs相比，DODMA@PLGA hNPs的壳层更厚（3.6纳米）。使用特定的竞争性抑制酶免疫测定法[4]确认了iLipid@PLGA hNPs上的PEG存在。竞争性结合表明hNP表面的PEG基团与PEG参考标准物之间争夺有限的抗体结合位点。定量分析显示，PEG表面密度随hNPs的脂质组成而有所不同（图5B）。具体来说，DODAP@PLGA hNPs的PEG含量最高（约10纳克/毫克），其次是DODMA@PLGA hNPs（约8纳克/毫克），而ALC0315@PLGA hNPs的EGP含量明显较低（约3纳克/毫克）。这种差异可能源于ALC0315脂质的更大体积结构，这可能会在空间上阻碍或部分掩盖iLipid@PLGA hNP表面的PEG链[24]、[25]、[26]。鉴于PEG在增强hNP渗透进入气道粘液中的作用，观察到的PEG化差异预计会影响这些配方的体内行为[32]。

DSC测量用于评估iLipid@PLGA hNPs的脂质/聚合物组分的热行为，无论是单独存在还是作为纳米粒子组装时（图6）。干燥脂质组分的熱分析显示了与其相应相行为相关的特征性吸热转变（图S2）。PLGA在38–45°C的温度范围内显示出其独特的不规则转变。DPPC和DSPE-PEG在约50–60°C附近显示出熔化转变（图S2A），这与文献值一致，并表明了从凝胶相到液晶相的转变，这可能受到干燥和热处理[33]、[34]以及PEG链[35]的影响。可电离脂质的熱图显示了明显的热转变差异（图S2B）。DODMA显示出两个不同的转变（T1：41.3 ± 1.52°C，63.9 ± 0.69 J/g；T2：89.1 ± 23.7°C，105 ± 4.46 J/g），表明存在多态性，而DODAP和ALC-0315显示出更宽的转变（T1：60.7 ± 1.05°C，239 ± 15.3 J/g）或更高温度的转变（T2：81.3 ± 1.24°C，307 ± 8.34 J/g），表明链有序和排列稳定性不同。这些脂质与DPPC和DSPE-PEG的物理混合物导致热图发生变化，表现出部分相分离和协同作用降低（图S2C）。值得注意的是，即使在物理混合物中，ALC-0315也保留了明显的转变，表明相分离仍然存在。

为了更深入地了解细胞内pH动态对开发的iLipid@PLGA主要结构特征的影响，进行了X射线散射分析。图7 BD中的SAXS光谱显示，hNPs的整体特性在pH从7变为3.8时保持不变。在酸性pH 5.5和3.8下，hNP分散体的散射谱完全重叠（图S3）。从pH 7变为pH 3.8时发生电荷变化的脂质并不会显著影响hNPs的整体表面结构。然而，在低q值处观察到散射谱斜率的轻微变化，尤其是在siRNA_ALC0315@PLGA hNPs中。分析采用了相互作用的核-多层粒子模型[20]、[40]来拟合散射强度（参见表S4中的拟合细节）。拟合结果表明，所有iLipid@PLGA hNPs都具有约2.5纳米的脂质涂层，由大约2.3纳米的疏水层和1纳米厚度的可检测亲水层组成，有效半径在74到87纳米之间。尽管模型函数在参数数量上较为复杂，但分析表明存在单层脂质涂层。然而，由于颗粒壳层上的PEG密度较低，无法检测到PEG化的程度。在测量的浓度下，颗粒间的相互作用导致结构因子的贡献，这与TEM图像中观察到的空间分布一致（图1B）。

在配方中，ALC0315@PLGA hNPs表现出更陡的低q值斜率，在pH 7时斜率最为明显，此时ζ电位达到最大值。这一分析表明，中性pH下的siRNA_ALC0315@PLGA hNPs表现出最强的颗粒间相互作用，而在酸性pH下相互作用强度降低。ALC0315@PLGA hNPs的PEG化程度差异（图5A和B）可能解释了这种独特行为，对其体外/体内命运有影响。为了实现可视化，siRNA被标记为AF647（红色），细胞核被DAPI（蓝色）染色（图8）。下载：下载高分辨率图像（554KB）下载：下载全尺寸图像

图8. A549细胞在转染DODMA@PLGA（A）、DODAP@PLGA（B）和ALC0315@PLGA（C）hNPs（分别负载AlexaFluor647标记的siRNA，红色）后3小时和24小时的共聚焦显微镜图像。细胞核用DAPI（蓝色）染色，酸性区室用Lysotracker?（绿色）染色。这些图像代表样品。（关于图例中颜色的解释，请参阅本文的网页版本。）

如图8A和S4所示，siRNAAF647_DODMA@PLGA hNPs在3小时和24小时均显示出强烈的细胞内红色信号，表明其被细胞有效吸收。在3小时时观察到与绿色溶酶体信号（黄色区域）的显著共定位，而到24小时时，红色荧光区域独立出现（图7A）。这些未共定位的红色信号可能表明部分siRNA成功逃逸出了溶酶体并分散在细胞质中。相比之下，用siRNAAF647_DODAP@PLGA和siRNAAF647_ALC0315@PLGA处理的细胞显示出较弱的红色荧光（图8B和C），表明整体细胞吸收较低。此外，在ALC0315@PLGA处理的细胞中，内化的siRNA与溶酶体在24小时内仍有强烈的共定位，这意味着大部分siRNA仍被隔离在内膜-溶酶体区室中。

皮尔逊相关系数（PCC）用于量化标记siRNA的荧光信号与溶酶体之间的线性关系程度[41]。较高的PCC值表示共定位更强烈，表明siRNA被溶酶体捕获得更牢固[41]。如图9所示，siRNAAF647_DODAP@PLGA配方在3小时和24小时时的PCC值最低。然而，值得注意的是siRNAAF647_DODMA@PLGA和siRNAAF647_ALC0315@PLGA之间的差异。在3小时时间点，这两种配方的PCC值非常相似。然而到24小时时，siRNAAF647_DODMA@PLGA的PCC值显著下降，这可能表明siRNA从内膜-溶酶体区室中释放得更强烈。相反，siRNAAF647_ALC0315@PLGA的PCC值相对保持不变，这可能归因于ALC0315的可电离脂质（如SAXS测量所示的独特结构），ALC0315的结构特征显著影响了iLipid@PLGA在酸性pH下的行为，这可能与ALC0315@PLGA hNPs上的PEG链暴露减少有关。

下载：下载高分辨率图像（204KB）下载：下载全尺寸图像

图9. 计算了siRNAAF647与A549细胞中溶酶体的共定位的皮尔逊相关系数（PCC）。使用ImageJ软件和Coloc2插件获得数据（n = 6），以平均值±标准差表示。（数据使用ImageJ软件和JACoP插件获得，n = 6，以平均值±标准误差表示，未配对t检验，* p < 0.05）。

3.6. 理解iLipid@PLGA hNPs在气道黏液中的行为

合理设计和开发吸入型纳米颗粒需要对其在气道黏液中的行为有深入的了解。为了确保RNA有效传递到呼吸道，iLipid@PLGA hNPs必须表现出黏液惰性，即与黏液的相互作用最小。已知黏蛋白会介导强烈的静电和疏水相互作用，这些相互作用通常由氢键促进，这会显著阻碍吸入治疗剂的生物利用度[42]。在中性pH下进行的黏蛋白与iLipid@PLGA hNP配方之间的相互作用研究表明，它们与黏蛋白的相互作用可以忽略不计，表明其具有黏液惰性行为（数据未显示）。还使用Transwell系统进行了体外渗透试验（图10）。siRNA_DODMA@PLGA hNPs在48小时内的渗透率最高（约90%），其次是siRNA_DODAP@PLGA（约75%）和siRNA_ALC0315@PLGA（约60%）。值得注意的是，所有配方的渗透率在大约8小时后趋于稳定，表明大部分纳米颗粒的运输发生在孵育的初期阶段。

下载：下载高分辨率图像（49KB）下载：下载全尺寸图像

图10. 通过Transwell?多孔板试验测量siRNA负载的荧光iLipid@PLGA hNPs在人工黏液（AM）中的体外运输情况。结果以荧光hNP穿越AM的百分比随时间变化的形式呈现。数据表示为三个不同批次的平均值±标准偏差（SD）（n = 6）。

siRNA_DODMA@PLGA观察到增强的渗透率可以通过对其与人工黏液（AM）孵育后的SAXS分析来部分解释（图11）。图11展示了siRNA负载的iLipid@PLGA hNPs在AM模型中孵育后的结构结果。每个面板顶部的光谱显示了hNP在水溶液中的不同比例在AM中的结果。每个面板底部显示的散射谱（红线）是通过从每个hNP/AM混合物中减去相应的AM光谱得到的颗粒重建谱。为了直接比较，在pH 7下相同siRNA负载的iLipid@PLGA hNPs的光谱以蓝色方块显示（重新缩放以匹配强度）。重建谱与原始hNP谱的重叠表明，即使长时间接触黏液模型，hNP的特性也能得到保留。siRNA ALC0135@PLGA和siRNA DODAP@PLGA hNPs在低q值处观察到的强度缺失可能是由于模型黏液内的颗粒-颗粒相互作用被屏蔽的结果，其中黏液的成分部分带电。确实，电荷屏蔽会显著影响排斥/吸引力的平衡，从而影响颗粒穿透黏液层的难易程度[42]，[43]。

下载：下载高分辨率图像（432KB）下载：下载全尺寸图像

图11. 在人工黏液（AM）中孵育的siRNA负载的iLipid@PLGA hNPs的SAXS光谱。棕色线条的亮度逐渐减弱，表示AM和水溶液混合比例不同（1:1、1:2和1:3 v/v）的混合物光谱。红线是通过从相应的AM/hNP混合物光谱中减去AM/水光谱得到的。为了比较，在pH 7下siRNA负载的iLipid@PLGA hNPs的光谱以蓝色方块显示。（关于图例中颜色的解释，请参阅本文的网页版本。）

3.7. siRNA在人类支气管上皮细胞中的递送效率

使用siRNA进行基因沉默是一种确定基因功能的方法，在肺部疾病治疗中具有潜在价值[44]。然而，其效果严重依赖于siRNA的细胞内递送和稳定性。GAPDH通常被用作评估体外siRNA介导的基因沉默效率的模型基因[45]。基于此，我们通过在处理后的24小时（图12A）和48小时（图12B）使用定量PCR评估了负载有针对GAPDH的siRNA（siGAPDH）的iLipid@PLGA hNPs在原代人类肺上皮细胞（NHBE）中的沉默活性。表达水平归一化为TBP参考基因，并与未处理的对照细胞进行比较。所有配方在24小时内均显著降低了NHBE细胞中的GAPDH表达，即使在最低测试浓度（0.5 mg/mL）下也是如此。值得注意的是，在1 mg/mL剂量下，DODMA@PLGA配方在24小时时的GAPDH沉默效果超过了阳性对照组（即通过Lipofectamine递送的siGAPDH）。

下载：下载高分辨率图像（313KB）下载：下载全尺寸图像

图12. 在正常人类支气管上皮细胞（NHBE）中体外下调GAPDH。转染使用40 nM的siGAPDH负载或siNC负载（非编码阴性对照siRNA）的iLipid@PLGA hNPs进行24小时（A）或48小时（B）。GAPDH表达相对于TBP管家基因显示。用Lipofectamine复合的siGAPDH处理的细胞作为阳性对照。统计显著性通过双尾学生t检验衡量（*p< 0.05；**p< 0.005；***p< 0.0005；****p< 0.0001）。

鉴于令人鼓舞的体外GAPDH沉默结果以及在气道黏液中的改进行为，我们评估了DODMA@PLGA hNPs介导siRNA穿过覆盖有黏液的人类支气管上皮的能力。在体外模拟复杂的人类肺上皮屏障仍然是一个重大挑战。尽管在塑料基底上培养的原代细胞的传统2D培养是一种简单快速的评估封装siRNA功能的工具，但它们缺乏天然气道屏障的结构、细胞和功能特性，例如黏液分泌、紧密连接完整性和上皮极化。相比之下，更先进的方法——如3D黏液分泌系统或在气液界面（ALI）维持的共培养——提供了更生理相关的模型[46]，[47]。基于这一理念，我们生成了一个3D人类支气管上皮模型，该模型在纤维母细胞嵌入的胶原基质上在ALI中培养原代人类支气管上皮细胞。因此，我们将分析扩展到更先进的体外模型，即在ALI上在胶原基质上生长的3D人类支气管上皮组织。这种高级组织更准确地再现了天然肺上皮的结构和功能特性，为评估纳米颗粒的穿透、保留和潜在毒性提供了可靠的平台，这些条件密切模拟了体内的气道暴露情况。

在顶部位给予罗丹明标记的DODMA@PLGA hNPs（DODMA@PLGARhod hNPs）后5小时和24小时获取了荧光图像（图13A和图13B），浓度分别为0.5 mg/mL和1 mg/mL（图13B）。细胞核用DAPI（蓝色）复染，而细胞纤毛用α-微管蛋白抗体（绿色）可视化，清楚地勾勒出伪复层上皮和下方的基质区室，同时描绘了上皮结构和完整性。在两种浓度下，5小时后hNP的红色荧光最初仅限于顶端上皮层，表明吸收有限且没有显著转移。24小时后，红色信号明显扩展到基底上皮层和下面的胶原中，表明纳米颗粒逐渐穿透了上皮屏障。这一效应在1 mg/mL浓度下更为明显，荧光强度更高，分布更广，这与剂量依赖的吸收和运输一致。在整个过程中，α-微管蛋白染色保持连续，细胞核显示完整，表明上皮完整性得到保持。

下载：下载高分辨率图像（203KB）下载：下载全尺寸图像

图13. iLipid@PLGA hNPs通过3D覆盖有黏液的人类支气管上皮模型的传输。代表性z-stack投影显示了处理后5小时和24小时的3D模型中的细胞核（DAPI，蓝色）、微管（α-微管蛋白，绿色）和罗丹明负载的hNPs（Rhod，红色）。（A）0.5 mg/mL DODMA@PLGARhod hNPs；（B）1 mg/mL DODMA@PLGARhod hNPs。随时间和浓度增加的红色信号表明纳米颗粒的渗透增强。（关于图例中颜色的解释，请参阅本文的网页版本。）

这些结果表明，DODMA@PLGARhod hNPs在24小时内逐渐内化并穿过分层的支气管上皮进入基质区室，验证了这种3D共培养系统用于研究人类气道中纳米颗粒穿透动力学的适用性。

4. 结论

在这项研究中，我们报道了一种结合聚合物和脂质的混合纳米平台的成功开发，用于肺部递送siRNA，利用了可电离脂质增强RNA在细胞质中递送的独特能力，即iLipid@PLGA混合纳米颗粒（hNPs）。我们评估了使用三种结构不同的可电离脂质（DODMA、DODAP、ALCO315）来精确调整iLipid@PLGA hNPs结构的效果。我们进一步提供了首次 mechanistic 调查，探讨了可电离脂质结构如何控制纳米颗粒的物理化学性质，从而影响其生物性能。全面的结构表征确认了由PLGA核心和脂质壳组成的核壳结构，并通过共包含PEG化脂质成功实现了PEG化。系统阐明了配方中可电离脂质对大小、壳厚度、PEG化密度、表面电荷和siRNA释放动力学的影响。热分析一致显示了脂质-PLGA相互作用和基质整合，脂质堆积的破坏表明纳米结构是无定形的且热稳定的。为吸入给药设计的这些载体表现出良好的气溶胶性能，突出了它们在肺部递送方面的强大转化潜力。重要的是，所有iLipid@PLGA hNPs均表现出黏液惰性，能够有效穿透人工黏液，与黏液的相互作用最小，从而支持它们穿越黏膜屏障并到达上皮表面的能力。hNP在模拟生理环境的条件下评估了其对pH响应的行为，包括复杂的介质如黏蛋白和人工黏液。

在开发的颗粒系列中，DODMA@PLGA hNPs实现了最高的黏液穿透能力，这可能归因于其优化的表面化学性质和PEG化谱，以及通过共聚焦成像观察到的增强的溶酶体逃逸。功能研究进一步证实了它们在人类支气管上皮细胞中对GAPDH的有效基因沉默。在一个3D气道上皮模型中，负载siRNA的DODMA@PLGA纳米颗粒表现出对覆盖有黏液的假复层上皮的逐步、剂量依赖性的渗透能力，这证明了它们适用于非侵入性地将siRNA递送到肺部。总体而言，该纳米平台具有可调性和多功能性，具有强大的转化潜力，可用于针对呼吸系统疾病的吸入式siRNA治疗，为未来使用与疾病相关的siRNA序列来恢复肺部疾病中的关键分子通路的研究铺平了道路。

**CRediT作者贡献声明：**
- Susy Brusco：撰写初稿、实验设计、数据整理。
- Ersilia Villano：实验设计、数据整理。
- Teresa Silvestri：撰写初稿、实验设计、数据整理。
- Amar J. Azad：方法学研究、数据分析。
- Muge Molbay：方法学研究、数据分析。
- Ivana d'Angelo：撰写、审阅与编辑、方法学研究。
- Agnese Miro：撰写、审阅与编辑、方法学研究。
- Paola Brocca：撰写、审阅与编辑、方法学研究、数据整理、概念构思。
- Olivia M. Merkel：撰写、审阅与编辑、指导、方法学研究、概念构思。
- Sarah Hedtrich：撰写、审阅与编辑、指导、方法学研究、概念构思。
- Gabriella Costabile：撰写、审阅与编辑、方法学研究、数据分析、概念构思。
- Francesca Ungaro：撰写、审阅与编辑、项目管理、资金筹措、数据分析、概念构思。