热调制超表面传感器用于动态和实时分辨细胞外囊泡的隔离

《Advanced Materials》：Thermally Modulated Metasurface Sensor for Dynamic and Time-Resolved Isolation of Extracellular Vesicles

　　**摘要**

细胞外囊泡（EVs）是纳米级的脂质双层结构，通过在不同生物液中运输核酸、蛋白质和脂质来介导细胞间通信。它们的诊断潜力巨大，但其异质性给分离和表征带来了持续挑战，这通常导致产量低、污染物共分离以及囊泡损伤。在这里，我们展示了一种基于热响应聚合物的等离子体超表面传感器，可以实现时空可控的、无需标记的EV分离。该超表面是通过重新利用纳米光栅光盘制造的，并用聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNIPAM）和抗CD63抗体进行功能化处理，在生理温度下选择性捕获EV，并在接近聚合物最低临界溶解温度（约35°C）时通过微小温度变化实现温和释放。使用MCF-7和HEK-293细胞衍生的EVs作为概念验证，该平台展示了三个数量级的动态检测范围。释放效率达到了87.03 ± 23.5%，而纳米粒子追踪分析（NTA）和荧光NTA（fNTA）显示EV纯度相比超滤过程提高了约100倍。电子显微镜和Western blotting证实了囊泡形态和标志物的表达得以保持。通过将热响应化学与经济高效的超表面平台结合，该系统提供了一种非破坏性、便携且实时的EV操作方案，为未来的液体活检应用中的EV靶向生物传感和即时诊断策略奠定了基础。

**1 引言**

细胞外囊泡（EVs）是由细胞分泌的纳米级脂质双层结构，存在于包括血液、尿液、唾液、脑脊液和牛奶在内的多种生物液中[1-3]。它们携带核酸、蛋白质、脂质和代谢物，参与细胞间通信并维持细胞稳态[4]。EVs代表了一组异质且不断演变的分泌颗粒。虽然历史上根据生物发生机制将其分为外泌体（exosomes）和ectosomes，但国际细胞外囊泡学会（ISEV）现在建议使用操作性术语，如小EVs（sEVs）和中/大EVs（m/lEVs），除非提供特定的生物发生证据[5, 6]。除了经典的膜源性囊泡外，新兴的细胞外纳米颗粒群体，包括凋亡小体（apoptotic bodies）、migrasomes、大型肿瘤体（oncosomes）和supermeres，进一步凸显了EVs的复杂性。这种异质性不仅决定了它们多样的功能角色，也给它们的分离和表征带来了分析挑战[7]。已经开发了许多基于密度、大小或表面标志物差异的EV分离方法[7-12]。差速离心通常被认为是金标准，但它会导致污染物共沉淀、囊泡聚集和损伤、设备成本高以及纯度有限[13]。密度梯度色谱法和尺寸排阻色谱法可以提高纯度，但通常会产生高度稀释的EVs[14]。免疫亲和方法针对特定的tetraspanin蛋白质，可实现高选择性，但面临可扩展性挑战，并需要强烈的洗脱步骤来回收完整的囊泡[15]。基于微流控的技术提供了小体积处理和与亲和或过滤方法的集成[16, 17]，但许多方法仍然局限于基于大小的分离。总体而言，可控且非破坏性的EV分离仍然是一个未满足的需求，因为传统方法经常损害囊泡的完整性和后续的分子分析。另一方面，热响应聚合物已成为可逆捕获生物分子的有希望的工具。特别是聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNIPAM），在其最低临界溶解温度（LCST，约35°C）附近会发生从亲水到疏水的转变，从而实现对分子相互作用的精确热控制。尽管已有研究展示了使用热响应聚合物集成微流控芯片[18]和传感器[19]进行细胞或蛋白生物标志物分离，但同时具备高灵敏度和时空可控性的EV分离平台仍然缺乏。在这项研究中，我们展示了一种基于热响应聚合物的超表面传感器，用于EV的时空分离。传感器首先涂覆一层粘附分子，然后用PNIPAM和抗CD63抗体进行功能化处理，以实现特异性、无标记的EV捕获。随后，通过微小温度变化释放这些EVs，以便进行后续表征（图1）。为了实现对捕获和释放事件的精确时空控制，超表面传感器是通过重新利用具有固有纳米光栅结构的光盘设计的，显著降低了制造成本和时间。整个过程的实时变化通过便携式系统进行管理。作为概念验证，使用了MCF-7乳腺癌细胞分泌的EVs，该平台展示了三个数量级的动态检测范围。表面阻断后，释放效率达到了87.03 ± 23.5%，证实了钝化增强了EV的特异性释放。纳米粒子追踪分析（NTA）和荧光NTA（fNTA）显示EV纯度相比超滤方法（初始收集）提高了约100倍，而扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）和Western blot分析验证了囊泡形态和特定标志物的表达。总体而言，该平台通过结合低成本、便携性和实时监控以及高特异性，克服了现有方法的关键限制，代表了未来基于EV的生物医学诊断的一项有前景的工具。

**2 材料与方法**

**2.1 材料**

N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）、2-溴异丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS-BiB）、聚-L-赖氨酸（PLL）、溴化铜（CuBr）、甲醇（≥99.9%）、无水乙醇（≥99.5%）、丙酮（≥99.5%）和异丙醇均从Sigma–Aldrich（美国）购买。磷酸盐缓冲盐水（PBS）片剂从Biomatik（加拿大）获得，而tris(2-二甲基氨基乙基)胺（Me6TREN）则来自东京化学工业（TCI，日本）。用于超表面制造的商用光盘（DVD-R）来自HP（美国），作为衍射光栅基底。高纯度金（Au，99.99%）和银（Ag，99.90%）颗粒由伊斯坦布尔黄金精炼厂（土耳其）提供。高纯度钛（Ti，99.995%）颗粒由NANOVAK（土耳其）提供。用于人乳腺腺癌细胞（MCF-7）培养的Dulbecco改良Eagle培养基/Nutrient Mixture F-12（DMEM/F-12）添加了L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和HEPES，以及胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶-EDTA（0.25%）和青霉素（10 000 U/mL）-链霉素（10 000 μg/mL），购自Thermo Fisher Scientific, Gibco（美国）。用于微流控芯片制造的聚（甲基丙烯酸甲酯）（PMMA）片材来自Sumitomo Chemical（日本），双面粘合剂（DSA）薄膜从3MTM（美国）采购，并通过激光切割进行图案化。聚四氟乙烯（PTFE）毛细管管材从Adtech（英国）获得。

**2.2 细胞培养**

MCF-7细胞在添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基/Nutrient Mixture F-12（DMEM/F-12）中培养。细胞在37°C、含5%二氧化碳的潮湿培养箱中维持。培养基每两天更新一次，利用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液在80%–90%汇合度下进行传代培养。关于人胚胎肾（HEK-293）细胞系的培养细节见支持信息文件。

**2.3 EV收集与表征**

在概念验证实验中使用了MCF-7细胞，而HEK-293细胞用于评估该平台和策略的通用性。因此，MCF-7细胞的EV收集详细协议在手稿中描述，而HEK-293的EV分离协议则在支持信息中提供。简要来说，MCF-7细胞接种到T75培养皿中，如前所述无需更换培养基培养四天[16]。第4天，收集含有分泌EVs的条件培养基并转移到2 mL离心管中。样品在室温（约27°C）下以20 000 × g离心15分钟以去除细胞碎片和凋亡小体，然后通过0.22 μm注射器过滤器过滤以获得含EV的澄清培养基。纯化的培养基随后使用定制设计的微流控超滤芯片（20 × 40 mm）处理，该芯片由五层PMMA和五层DSA、两层聚碳酸酯膜（200和50 nm孔径）以及PTFE毛细管管材组成（图S1）。第1和第2层包含 inlet和出口结构，而第3-6层形成含EV培养基的中间储液层。在第6和第7层之间嵌入了聚碳酸酯膜以实现基于大小的顺序分离。EV首先被截留在200 nm膜上，然后在50 nm膜上富集。第8和第9层定义了从入口到出口的微通道网络，第10层作为结构基础。管材连接使用环氧树脂固定，流速通过注射泵控制在40 μL/min。收集的EVs通过NTA分析其大小分布和浓度，并通过Western blotting确认典型EV表面标志物的存在（支持信息）。收集的EV悬浮液分装到500 μL管中并在-20°C下储存以减少冻融降解。

**2.4 超表面传感器的制造**

如前所述[20]，使用商用低成本光盘作为超表面制造的模板。光盘的保护顶层被小心剥离以暴露下面的光栅结构，然后在室温下用乙醇:甲醇（1:1, v/v）溶液清洗。随后在丙酮:异丙醇（1:4, v/v）中短时间蚀刻60秒，再用蒸馏水彻底冲洗并用空气干燥器干燥。处理后的基底依次涂覆钛（5 nm）作为粘附层，银（30 nm）以赋予等离子体活性，以及金覆盖层（15 nm）以增强等离子体响应，防止银氧化并提高长期稳定性。金属沉积通过在10^-6 Torr压力下使用MiDAS PVD 3T系统（VAKSIS，土耳其）进行热蒸发来完成（图S2）。制造的超表面随后被切割成15 × 15 mm的芯片，以便与微流控平台集成。

**2.5 用于传感器的微流控平台的制造**

微流控芯片使用PMMA（2 mm厚度）和DSA（50 μm厚度）层制造。设备设计使用RDWorks软件生成，并通过激光切割（LazerFix，土耳其）进行图案化。PMMA层被加工形成入口和出口端口（功率40%，速度40 mm/s），而DSA层（功率15%，速度100 mm/s）定义了微通道几何形状，并作为与等离子体超表面的粘合接口。组装前，PMMA基底用70%乙醇清洗并彻底干燥。然后按以下顺序依次对齐和层压：超表面、DSA和PMMA。PTFE毛细管管材（长度15–20 cm）插入入口和出口端口，并用环氧树脂固定。微通道中的流体流动通过注射泵（New Era Pump Systems Inc., 美国）精确控制（图S3）。

**2.6 热响应聚合物的合成**

在原子转移自由基聚合（ATRP）之前，NIPAM单体在正己烷中重新结晶并彻底干燥。ATRP使用NIPAM、CuBr、Me6TREN和NHS-BiB以100:1:1:1的摩尔比进行。简要来说，NIPAM（600 mg）溶解在去离子水（10 mL）中的圆底Schlenk烧瓶中，并在4°C下以250 rpm搅拌10分钟。在另一个Schlenk烧瓶中，Me6TREN（12 mg）溶解在去离子水（4 mL）中。两种溶液在温和搅拌下用氮气冲洗10分钟以去除溶解的氧气。随后，CuBr（7.63 mg）、NHS-BiB（14 mg）和Me6TREN溶液依次引入NIPAM溶液中，然后在4°C下继续用氮气冲洗30分钟。聚合反应在室温下进行2小时。完成后，PNIPAM聚合物聚集物通过热风枪轻轻加热收集，转移到Petri dish中，并在室温下干燥24小时。干燥的PNIPAM储存在干燥和避光环境中以备后续使用。

**2.7 传感器的表面修饰与表征**

首先在70%乙醇中灭菌金属涂层的聚碳酸酯超表面（15 × 15 mm），然后空气干燥，并依次用PLL（0.1 mg/mL在PBS中，4°C过夜）、NHS-terminated PNIPAM（2.5–10 mg/mL在蒸馏水中，4°C过夜）、抗CD63抗体（50 μg/mL，4°C下3小时）和牛血清白蛋白（BSA）（5 mg/mL在PBS中，4°C下20分钟）进行表面钝化。每个修饰步骤后，基底用PBS轻轻冲洗并在氮气流下干燥。修饰后，传感器被集成到微流控平台上，用于实时测量EV捕获和热诱导释放。表面表征使用接触角测量法、X射线光电子能谱（XPS）、SEM和激光扫描显微镜进行。详细的表征协议和分析参数见支持信息。

**2.8 在超表面传感器上实时监测和检测EV捕获与释放**

使用便携式光学传感系统实时监测EV捕获和热诱导释放（图S4A,B）。该实验装置包括一个紧凑型光谱仪（Thorlabs, CCS175/M）和一个宽频光源（Thorlabs, OSL2），它们都工作在可见光范围内，并被封装在一个定制的3D打印外壳中，以保证光学和环境的稳定性。入射光通过一系列透镜、线偏振器和分光器被引导到等离子体超表面，而反射光谱则由光谱仪收集，并使用Thorlabs的OSA软件进行分析。光谱变化通过基于MATLAB的图形用户界面（GUI）进行处理。最终数据以波长（nm）对时间（s）的形式绘制出来。样本流速通过注射泵保持在10 μL/min。标准的测量周期包括：PBS缓冲液处理（5分钟）以稳定基线，EV样本注入（45分钟，结合阶段），以及PBS缓冲液清洗（5分钟，解离阶段）。蛋白质结合相互作用是通过相对于初始基线的波长变化来量化的。

2.9 传感器的实时温度调节

开发了一个定制的加热系统，使用Arduino UNO微控制器上的比例-积分-微分（PID）控制算法来调节传感器的温度。该系统采用了一个重新利用的3D打印机加热垫作为热源，温度反馈由放置在加热垫表面的热敏电阻传感器提供。Arduino持续监测温度，并通过脉冲宽度调制（PWM）对加热垫供电，电源由直流电源提供。这种设置使得实验过程中的温度控制稳定且精确。对于温度调节，印刷电路板（PCB）加热单元（图S4A,B）被放置在传感器下方，温度由通过基于Python的界面编程的Arduino辅助控制系统来调节。EV捕获在27°C下进行，之后用PBS缓冲液清洗以去除未结合的颗粒。对于受控释放，温度升高到35°C，并保持10 μL/min的恒定流速持续45分钟。在加热前后记录波长变化，以确定EV的释放效率。

3 结果与讨论

3.1 细胞研究

在这项研究中，MCF-7乳腺癌细胞在前面章节描述的条件下进行培养。在培养的第四天——之前报道为EV收集的最佳时间点[16]——收集了培养基，并使用倒置荧光显微镜对细胞进行了成像。为了评估细胞活力，使用了钙黄绿素AM（一种产生绿色荧光的活细胞指示剂）和乙啶二聚体（一种发出红色荧光的死细胞指示剂）。此外，还获取了明场和Hoechst 33342核染色图像，以评估细胞形态和汇合度。明场图像（图S5A）显示MCF-7细胞均匀地粘附在培养表面上，形成了对健康增殖至关重要的单层。观察到的类上皮形态与先前的报告一致，证实了这些培养条件适合分泌生理相关的EVs [21, 22]。使用钙黄绿素AM进行活细胞染色显示了广泛的绿色荧光（图S5B），而使用乙啶二聚体标记后只观察到少数红色染色的细胞（图S5C）。合并的活细胞/死细胞图像（图S5D）表明，在第四天没有更换培养基的情况下，绝大多数细胞仍然存活——这是未受干扰的EV分泌的重要标准。Hoechst 33342核染色（图S5E）清晰地显示了细胞核，并证实了培养物的汇合度，补充了明场观察的结果。为了进一步验证培养细胞的癌特异性表型，进行了免疫组织化学（IHC）染色，以检测关键的上皮和肿瘤相关标志物：细胞角蛋白-19（CK-19），这是一种主要的细胞骨架中间丝蛋白，其表达失调通常与癌变有关[23]；以及上皮细胞粘附分子（EpCAM，CD326），这是一种在上皮来源的癌细胞中高表达的跨膜糖蛋白[24]。使用Hoechst 33342染色（图S5F）在DAPI通道（发射/接收：350/461 nm）下观察细胞核。使用Alexa Fluor 647标记的抗EpCAM抗体（图S5G）在RFP通道（发射/接收：650/671 nm）下成像，显示了沿细胞膜的强烈红色荧光，这与高表达的EpCAM一致。FITC标记的抗CK-19抗体（图S5H）在GFP通道（发射/接收：495/519 nm）下成像，突出了分布在细胞质中的细胞骨架丝。CK-19和EpCAM的强且空间分离的表达证实了MCF-7细胞系的上皮和癌性表型（图S5I），为后续的EV分离实验验证了细胞模型。

3.2 通过超滤芯片分离EV及其特性研究

根据2018年《细胞外囊泡研究最小信息（MISEV）》指南[25]，使用四种互补的分析方法对收集和释放的EVs进行了严格表征：Western blotting用于蛋白质标记验证，NTA用于尺寸分布，fNTA用于特定标记的确认，以及电子显微镜用于形态评估。使用超滤芯片分离的EVs通过SEM和NTA进行了表征，作为与随后通过热响应聚合物修饰传感器实时捕获和释放的EVs进行比较的参考。SEM用于评估微米和纳米级结构的形态和组织。正如预期的那样，作为脂质双层包裹的囊泡，EVs主要呈现球形形态[26]。在图S6A中，观察到均匀分布的球形EVs，尽管在固定过程中发生了一些聚集。这些聚集导致了局部粗糙度和不均匀的金/Pd涂层，从而导致某些区域由于电子积累而更亮。更高倍数的图像（图S6B）清楚地显示了具有均匀圆形形态的EVs，没有污染物（例如较大的生物颗粒），也没有破裂或变形的迹象。使用NTA进一步分析了超滤芯片分离的EVs的尺寸分布和浓度。平均颗粒大小确定为137.7 ± 3.6 nm，模态大小为94.4 ± 4.7 nm，与滤膜的孔径尺寸（200 nm和50 nm）一致。颗粒浓度测量为1.01 × 10^10 ± 5.23 × 10^8颗粒/mL（图S6C）。为了评估分离EVs的纯度，进行了一种针对四跨膜蛋白CD63的免疫染色方案，CD63是EVs表面的一个典型标记。使用Alexa Fluor 488标记的抗CD63抗体（发射/接收：490/525 nm），并在仪器上使用488 nm激光进行fNTA。在测量之前，EVs在PBS中稀释1:50，与荧光抗体混合，并在室温下黑暗环境中孵育30分钟。免疫染色后，平均和模态颗粒大小分别降至75.2 ± 13.6 nm和54.1 ± 20.2 nm，相应的颗粒浓度为1.98 × 10^6 ± 1.71 × 10^5颗粒/mL——比未标记的样本低约104倍，证实了CD63+ EVs的选择性识别（图S6D）。

3.3 热响应聚合物的合成、化学和热特性

为了实现对EV分离的时空控制，在超表面传感器上整合了一层热响应聚合物。设计的原理是利用聚合物的LCST（最低临界温度）行为，允许在温度升高超过LCST时EVs从传感器表面可逆地分离。热响应聚合物（PNIPAM）是通过液相ATRP反应合成的。为了确保去除CuBr催化剂的残留物，合成的PNIPAM溶液被温和加热以诱导形成疏水的PNIPAM聚集体。这些聚集体随后被转移到干净的培养皿上，风干成固体形式，然后在所需的浓度下重新溶解在蒸馏水中以供进一步研究。如文献所述，PNIPAM在其LCST附近会发生从亲水到疏水的可逆相变，通常报道的温度范围在32°C到35°C之间[27]。为了实验验证这一转变，准备了10 mg/mL的PNIPAM溶液在蒸馏水中，并在加热板上逐渐加热，同时使用浸入样本中的探针连续监测温度（图2A）。在30°C时，低于LCST，溶液保持透明，表明聚合物在水中完全溶解且没有可见的聚集。当温度升高到35°C时，溶液开始变得浑浊，表明疏水相互作用和聚合物聚集的开始——尤其是在靠近热源的瓶底处最为明显。在40°C时，转变完成，溶液变为不透明的白色，证实了疏水PNIPAM聚集体的形成。这些观察结果验证了合成聚合物的热响应特性，并确定35°C为精确的转变温度。这个温度随后被选为下一个等离子体实验的操作释放条件，因为它足够温和，可以保护像EVs这样的生物样本的结构完整性。

3.4 细胞外囊泡（EVs）的合成、化学和热特性

根据2018年《细胞外囊泡研究最小信息（MISEV）》指南[25]，收集和释放的EVs通过四种互补的分析方法进行了严格表征：Western blotting用于蛋白质标记的验证，NTA用于尺寸分布，fNTA用于特定标记的确认，以及电子显微镜用于形态评估。使用超滤芯片分离的EVs通过SEM和NTA进行了表征，作为与随后通过热响应聚合物修饰传感器实时捕获和释放的EVs进行比较的参考。SEM用于评估微米和纳米级结构的形态和组织。正如预期，作为脂质双层封装的囊泡，EVs主要呈现球形[26]。在图S6A中，观察到均匀分布的球形EVs，尽管在固定过程中有些聚集。这些聚集导致了局部的粗糙度和不均匀的金/Pd涂层，从而在某些区域由于电子积累而变得更亮。更高倍数的图像（图S6B）清楚地显示了具有均匀圆形形态的EVs，没有污染物（例如较大的生物颗粒），也没有破裂或变形的迹象。通过NTA进一步分析了超滤芯片分离的EVs的尺寸分布和浓度。平均颗粒大小确定为137.7 ± 3.6 nm，模态大小为94.4 ± 4.7 nm，与滤膜的孔径尺寸（200纳米和50纳米）一致。颗粒浓度测量为1.01 × 10^10 ± 5.23 × 10^8颗粒/mL（图S6C）。为了评估分离的EVs的纯度，进行了针对四跨膜蛋白CD63的免疫染色。使用Alexa Fluor 488标记的抗CD63抗体（发射/接收：490/525 nm），并在仪器上使用488 nm激光进行fNTA。在测量之前，EVs在PBS中稀释1:50，与荧光抗体混合，并在室温下的黑暗环境中孵育30分钟。免疫染色后，平均和模态颗粒大小分别降至75.2 ± 13.6 nm和54.1 ± 20.2 nm，相应的颗粒浓度为1.98 × 10^6 ± 1.71 × 10^5颗粒/mL——比未标记的样本低大约104倍，证实了CD63+ EVs的选择性识别（图S6D）。

3.3 热响应聚合物的合成、化学和热特性

为了实现对EV分离的时空控制，在超表面传感器上整合了一层热响应聚合物。设计的理念是利用聚合物的LCST（最低临界温度）行为，在温度升高超过LCST时允许EVs从传感器表面可逆地分离。热响应聚合物（PNIPAM）是通过ATRP在液相系统中合成的。为了确保去除CuBr催化剂的残留物，合成的PNIPAM溶液被温和加热以诱导形成疏水的PNIPAM聚集体。这些聚集体随后被转移到干净的培养皿上，风干成固态，然后在所需的浓度下重新溶解在蒸馏水中以供进一步研究。如文献所述，PNIPAM已知在其LCST附近会发生从亲水到疏水的可逆相变，通常报告的温度范围在32°C到35°C之间[27]。为了实验验证这一转变，准备了一个10 mg/mL的PNIPAM溶液在蒸馏水中，并在加热板上逐渐加热，同时使用浸入样本中的探针连续监测温度（图2A）。在30°C时，低于LCST，溶液保持透明，表明聚合物在水中完全溶解且没有可见的聚集。当温度升高到35°C时，溶液开始变得浑浊，表明疏水相互作用和聚合物聚集的开始——特别是在靠近热源的瓶底处最为明显。在40°C时，转变完成，溶液变得不透明且变白，证实了疏水PNIPAM聚集体的形成。这些观察结果验证了合成聚合物的热响应特性，并确定了35°C作为精确的转变温度。这个温度随后被选为下一个等离子体实验的操作释放条件，因为它足够温和，可以保护生物样本（如EVs）的结构完整性。

3.4 表面润湿性、形貌和功能化超表面传感器的化学特性

我们用PLL作为粘合层和热响应聚合物层来装饰超表面传感器，以实现EV分离过程中的捕获和释放事件的时空控制。在这种情况下，通过润湿性、形貌和化学分析的组合，评估了传感器的顺序表面修饰。通过接触角分析评估了超表面传感器的表面润湿性，以评估其在表面修饰过程中的亲水-疏水转变——这一性质直接受到表面能量的影响。在这里，依次检验了四种表面配置：（i）裸露的超表面，（ii）0.1 mg/mL的PLL修饰超表面，（iii）0.1 mg/mL的PLL和5 mg/mL的PNIPAM共修饰超表面，以及（iv）0.1 mg/mL的PLL、5 mg/mL的PNIPAM和50 μg/mL的抗CD63抗体修饰超表面（图3A）。裸露的超表面显示的接触角为110.13° ± 1.76°，这是具有低表面能量的疏水表面的特征。经过PLL修饰后，接触角显著降低到59.9° ± 3.18°，表明由于引入了胺和羟基，亲水性得到了增强。进一步用PNIPAM修饰后，接触角降低到47.37° ± 6.13°，这与存在的富含胺的聚合物层一致。在固定抗CD63抗体后，接触角进一步降低到18.35° ± 0.45°，证实了每次修饰后表面的亲水性逐渐增强。总体而言，这些结果证明了超表面成功进行了顺序功能化。

3.4 超表面传感器的表征

（A）PNIPAM溶液在30°C（低于LCST）、35°C（接近LCST）和40°C（高于LCST）时从亲水到疏水状态的视觉演示。（B）合成的PNIPAM的1H NMR光谱，确认了成功的聚合和化学组成。由于我们计划随后将与热响应聚合物进行生物共轭，因此用NHS酯基团对PNIPAM链进行了功能化，这些基团容易与生物分子（如蛋白质和抗体）中丰富的仲胺反应[28]。为此，在聚合过程中使用了NHS终止的ATRP启动剂（NHS–BiB），从而在PNIPAM链的末端引入了NHS功能团。通过核磁共振（NMR）光谱确认了NHS基团的成功引入和PNIPAM主链的结构完整性。光谱是在氘代二甲砜（DMSO-d6）中记录的，化学位移以百万分之一（ppm）表示，相对于残留的DMSO信号（图2B，表S1）。特征共振峰证实了NHS终止的PNIPAM的形成，并验证了ATRP合成途径的有效性。1H-NMR光谱显示了PNIPAM的特征共振峰：酰胺（─NH）质子在约7.46 ppm，聚合物主链的甲氧基质子在3.95–3.44 ppm，异丙基甲基质子在1.82–1.06 ppm，以及亚甲基质子在约0.9–1.2 ppm。此外，在2.8–3.0 ppm处观察到一个次要共振峰，对应于琥珀酰亚胺部分，证实了NHS基团的成功引入。这些光谱特征共同验证了适合后续抗体共轭和热响应生物传感应用的NHS终止PNIPAM的有效合成。

3.4 功能化超表面传感器的表面润湿性、形貌和化学特性

我们用PLL作为粘合层和热响应聚合物层装饰了超表面传感器，以实现EV分离过程中捕获和释放事件的时空控制。在这种情况下，通过结合润湿性、形貌和化学分析来评估传感器的顺序表面修饰。通过接触角分析评估了超表面传感器的表面润湿性，以评估其在表面修饰过程中的亲水-疏水转变——这一性质直接受到表面能量的影响。依次检验了四种表面配置：（i）裸露的超表面，（ii）0.1 mg/mL的PLL修饰超表面，（iii）0.1 mg/mL的PLL和5 mg/mL的PNIPAM共修饰超表面，以及（iv）0.1 mg/mL的PLL、5 mg/mL的PNIPAM和50 μg/mL的抗CD63抗体修饰超表面（图3A）。裸露的超表面显示出110.13° ± 1.76°的接触角，这是具有低表面能量的疏水表面的特征。经过PLL修饰后，接触角显著降低到59.9° ± 3.18°，表明由于引入了胺和羟基，亲水性得到了增强。进一步用PNIPAM修饰后，接触角降低到47.37° ± 6.13°，这与存在的富含胺的聚合物层一致。在固定抗CD63抗体后，接触角进一步降低到18.35° ± 0.45°，证实了每次修饰后表面亲水性的增加。总体而言，这些结果证明了超表面亲水性的逐步增强，支持了等离子体超表面的成功顺序功能化。

3.4 超表面传感器的表征

（A）（i）裸露超表面，（ii）PLL修饰表面，（iii）PLL和PNIPAM修饰表面，以及（iv）PLL、PNIPAM和抗CD63抗体修饰表面的接触角测量，显示了亲水性的累积增加。（B）PLL和PNIPAM修饰传感器的激光扫描共聚焦显微镜图像，显示了表面化学处理后保持的光栅拓扑结构。（C）裸露超表面传感器（顶部）、PLL涂层传感器（中部）和PLL和PNIPAM修饰传感器（底部）的SEM图像，证实了表面覆盖的均匀性，激光显微术确认了光栅的周期性得以保持（图3B），而扫描电子显微镜（SEM）成像显示了未经修饰（图3C）、经过PLL修饰以及PLL–PNIPAM修饰的超表面纳米形貌保存完好。这些发现证实了金属涂层和随后的表面化学处理没有破坏纳米级光栅的结构，确保了用于实时捕获和释放事件的光等离子体信号传输的可靠性。通过XPS分析进一步检测了修饰表面的化学成分。获取了未经修饰、PLL修饰、PLL–PNIPAM修饰以及PLL–PNIPAM–抗CD63抗体修饰表面的Au4f、C1s和N1s区域的光谱（图3D）。在所有样本中，Au4f峰分别出现在87.88和84.2 eV，确认了金层的存在。尽管每次修饰后峰强度有所下降，但由于表面覆盖层的缘故，没有检测到显著的峰位移动，表明底层金膜在化学上保持稳定。C1s光谱的分析显示了表面化学成分的明显变化。未经修饰的金表面仅在284.3 eV处显示出一个微弱的污染峰，这与杂散碳的存在一致（图3D-ii）。经过PLL修饰后（图3D-v），在284.32 eV处观察到主导峰（C─C、C─H、C═C），以及在285.81和287.48 eV处观察到中等强度的峰，这些峰对应于PLL骨架中的C─O和C═O键。在PNIPAM涂层后（图3D-viii），284.25 eV处的峰强度增强，反映了PNIPAM骨架的引入，而约281.0和287.43 eV处的峰也有所增加，证实了酰胺基团的引入。在抗CD63抗体固定后（图3D-xi），287.7 eV处的峰强度略有下降，表明形成了酰胺键。N1s光谱提供了表面成功功能化的额外证据。未经修饰的表面几乎没有N1s信号（图3D-iii）。PLL沉积后（图3D-vi），在399.26 eV和401.08 eV处出现了明显的峰，这些峰分别对应于胺基（─NH2）和酰胺基（HN─C═O─），证实了含氮官能团的存在。经过PNIPAM修饰后（图3D-ix），在398.9 eV处出现了新的峰，这些峰来自异丙基基团的仲胺；在400.53 eV处出现了额外峰，这些峰对应于酰胺或亚胺键（N─(C═O)─）。最后，在抗体结合后（图3D-xii），在399.5 e处观察到了强度的增加，反映了NHS酯转化为稳定的酰胺键的过程。

3.5 控制超表面传感器的热活性

为了在捕获和释放事件期间实现精确的热控制，一个定制设计的PCB加热器被集成在光等离子体超表面传感器下方。测量了PCB加热器的厚度，并相应地调整了光学设置，以保持入射光在芯片表面上的最佳焦距。为了确保在不同环境条件下的实验一致性，加热器最初被设定在27°C——低于PNIPAM的液晶转变温度（LCST）。使用热成像相机验证了传感器上的温度分布（图4A）。正如之前的PNIPAM特性分析所证实的（图4A（左）那样，27°C处于PNIPAM的亲水范围内，有利于在功能化表面上捕获电子囊泡（EVs）。随后，温度升高到35°C，这对应于PNIPAM从亲水到疏水的转变范围（图4A（中）。通过热相机验证了这一转变温度的均匀性和稳定性（图4A）。进一步加热到45°C时，在传感器上观察到PNIPAM的可见聚集，形成了类似固体的疏水区域（图4A（右））。这一现象进一步证实了聚合物修饰的成功；然而，这样的聚集会破坏层流，引起湍流，并可能干扰光等离子体信号的稳定性。为了防止这些效应并保持可重复的实时传感性能，释放温度被优化并固定在接近相变阈值（35°C–37°C）。

3.6 优化热响应聚合物（PNIPAM）的浓度和温度响应以实现实时光等离子体传感

为了建立最佳的聚合物涂层条件以进行实时分析，系统地优化了应用于传感器的PNIPAM浓度。评估了一系列PNIPAM浓度——10、5和2.5 mg/mL——溶解在蒸馏水中，以研究它们对光等离子体响应的影响（图4B）。文献报告指出，PNIPAM浓度显著影响聚合物的构象和表面均匀性[30, 31]。通过对我们的数据进行三次重复测量分析，在PNIPAM浓度为10 mg/mL时，超表面传感器的共振峰出现在529 nm附近；然而，信号显示出相当大的噪声，标准差为1.3 nm（图4B（左））。这种高波动掩盖了固定的抗CD63抗体与目标EVs之间的微妙结合事件，降低了信噪比并限制了灵敏度。当浓度降低到5 mg/mL时，共振峰略微移动到525 nm，而标准差显著降低到0.3 nm——这是一个可接受的噪声水平，适用于可靠的检测（图4B（右）。相反，在2.5 mg/mL时，聚合物无法形成稳定的涂层，在高温下没有观察到明显的PNIPAM响应，表明表面覆盖不足。基于这些发现，选择5 mg/mL的PNIPAM浓度作为后续捕获-释放事件的最佳浓度，以平衡涂层稳定性和信号保真度。考虑到PNIPAM的热响应性质，使用PLL–PNIPAM–抗CD63功能化传感器进一步研究了温度对光等离子体信号的影响（图4C–F）。在此过程中，PBS以10 μL/分钟的流速连续流过传感器的微通道，同时温度逐步从30°C升高到40°C，以1°C的增量进行。对于每个温度点，记录了10分钟的实时光谱，并分析了600个数据点（图4C）。随着温度的升高，共振波长逐渐红移，这与之前关于PNIPAM系统中温度依赖性折射率变化的报道一致[32]。为了定量评估这种效应，分析了每个温度下最后500个数据点的平均波长和标准差（图4D）。温度引起的光谱移动在10°C的升高范围内达到了大约0.58 nm，证实了系统对微小折射率变化的敏感性（图4E）。重要的是，在三个关键温度——30°C（LCST）下记录的反射光谱没有显示出不可逆的扭曲或信号质量的下降，验证了超表面的热稳定性（图4F）。为了最小化温度驱动的波长漂移对EV释放事件的干扰，增加了一个额外的温度稳定步骤。在高温释放阶段（35°C–37°C）之后，系统被冷却回捕获温度（27°C）。比较了这种热循环前后的共振波长，以准确量化EV捕获和释放的效率。在实施PLL–PNIPAM–抗体系统进行EV捕获之前，研究了其他的表面修饰化学方法，以确定最有效的功能化途径。测试了两种常见的连接策略（图S7）：（i）3-巯基丙基-N-羟基琥珀酰亚胺酯（3-MNHS）和（ii）3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）。3-MNHS是一种杂双功能交联剂，含有一个可以透过Au–S相互作用与金表面结合的巯基（─SH）和一个可以与伯胺反应的NHS酯基团，因此可以作为PNIPAM固定的潜在中间体。相比之下，APTES含有一个可以与羟基化表面反应形成硅氧烷键的硅烷部分，并提供了适合NHS–PNIPAM和抗体结合的末端胺基团。这两种化学方法分别应用于不同的传感器上，并与PLL–PNIPAM进行了EV捕获效率的比较。每个条件下的实验都使用了109粒子/mL的EV悬浮液。每个实验包括三个连续步骤：（I）用PBS进行5分钟的基线测量（流速为10 μL/分钟），（II）引入EVs 45分钟（流速同样为10 μL/分钟），以及（III）用PBS洗涤5分钟（流速相同）。洗涤后的净共振波长变化用于评估EV结合情况。如图S7A,B所示，3-MNHS修饰的表面显示出0.18和0.20 nm的波长移动，平均响应为0.19 ± 0.10 nm。同样，APTES处理的表面（图S7C,D）产生了0.01和0.32 nm的轻微移动（平均0.165 ± 0.155 nm）。尽管EV浓度相对较高，但两种修饰方法产生的光谱响应都可以忽略不计——与传感器的基线噪声相当。因此， Neither APTES nor 3-MNHS化学方法被认为适合敏感的EV捕获和释放测定，选择了PLL–PNIPAM表面修饰作为后续实验的最佳平台。

3.7 在超表面传感器上控制EV的捕获和释放温度

在优化研究的基础上，超表面传感器依次用0.1 mg/mL的PLL、5 mg/mL的PNIPAM和50 μg/mL的抗CD63抗体进行了功能化。捕获温度保持在27°C，低于PNIPAM的LCST，以确保其亲水状态。使用超滤芯片获得的最高EV浓度为1010粒子/mL，随后评估了109、108和107粒子/mL的连续稀释样本的捕获效果。每个实验都进行了三次重复（n = 3），相应的光等离子体响应结果展示在图5中。与之前的捕获研究一样，应用了相同的顺序和三个连续步骤的持续时间。每个阶段的开始在光等离子体图中进行了标记。对于1010粒子/mL的样本（图5A–C），记录了1.79、2.82和1.96 nm的波长移动（平均2.20 ± 0.45 nm）。在109粒子/mL时（图5D–F），移动分别为1.23、1.58和1.39 nm（平均1.40 ± 0.14 nm）。当浓度降低到108粒子/mL时，观察到0.94、0.72和1.0 nm的红移（平均0.89 ± 0.12 nm）（图5G–I）。在最低测试浓度107粒子/mL时，波长变化分别为0.18、0.25和0.15 nm（平均0.20 ± 0.04 nm）（图5J–L）。这些响应明显高于之前从3-MNHS和APTES修饰的表面获得的响应，证实了热响应聚合物界面的增强结合效率。然后，使用皮尔逊相关系数（Pearson’s correlation）拟合了平均结果，显示EV浓度和波长移动之间的强线性关系（图5M）。分析线性校准曲线（图5M）揭示了在这个范围内波长移动（y）和EV浓度（x）之间的明确关系，由方程（y = 0.6518 log10 x–4.369）描述。然后使用这个相关模型计算了检测的数学限值（LOD）（公式1）。这里的S代表从回归线截距得出的波长移动响应的标准差，b是斜率。根据这些参数，计算出传感器的LOD为1.6 × 107粒子/mL。

图5 在图查看器中打开
实时光等离子体监测PLLL–PNIPAM–抗CD63抗体修饰传感器上EV的捕获和热触发释放。在不同浓度下进行的三次重复测量：（A–C）1010粒子/mL（n = 3），（D–F）109粒子/mL（n = 3），（G–I）108粒子/mL（n = 3），以及（J–L）107粒子/mL（n = 3）。（M）平均波长移动及其标准差（误差条）；每个浓度的n = 5，相关分析得出皮尔逊系数r = 0.94和R2 = 0.89。（N）五个重复实验的代表性波长移动，其中BSA表面被用来阻断。释放实验使用109粒子/mL的EV样本进行，对应于实验中测试的中间浓度范围。图S8显示了五个独立捕获-释放循环中的实时光等离子体响应。捕获和洗涤后，温度从27°C升高到35°C——PNIPAM的转变点——然后在10 μL/分钟的流速下诱导45分钟的释放。释放后，温度再次降低到27°C，并用PBS冲洗10分钟以稳定信号。相应的步骤如下：（I）PBS基线（5分钟），（II）EV捕获（45分钟），（III）PBS洗涤（5分钟），（IV）温度升高和释放事件（45分钟），以及（V）温度降低（10分钟）。波长移动和计算出的释放效率总结在表S2中，回收率范围为18%–49%（平均：36.35 ± 16.06%）。没有明显的模式影响释放效率，表明释放过程中主要是局部表面-聚合物相互作用在起作用。另一方面，表面阻隔是一种成熟的策略，用于减少非特异性吸附并提高选择性，尤其是在富含蛋白质和大分子的生物流体中[33-36]。在我们的系统中，PNIPAM通过在低于其液晶临界温度（LCST）的温度下暴露其亲水基团来提供初始的表面钝化，形成一层水合层，有助于抗污染性能[37, 38]。为了在EV释放过程中进一步增强钝化效果并提高系统在生物环境中的稳定性，我们应用了BSA作为抗污染剂。除了BSA之外，还可以实施基于聚乙二醇（PEG）的涂层、两性聚合物或表面活性剂辅助的阻隔方法等替代策略，以进一步减少非特异性吸附和表面污染，特别是在复杂的生物流体中[39-41]。为了评估表面阻隔对释放性能的影响，在PLL–PNIPAM–抗CD63抗体修饰之后，用5 mg/mL的BSA处理了超表面传感器。传感器在4°C下与BSA孵育20分钟，然后用PBS冲洗三次，并进行相同的捕获和释放实验。与非阻隔表面相比，BSA钝化的传感器表现出显著提高的释放效率（图5N）。在五次重复实验中，释放效率范围为50.18%至118.8%（平均值：87.03 ± 23.5%）（表S3），表明非特异性结合事件大幅减少。捕获阶段的整体波长偏移小于未阻隔表面，进一步证明了成功的阻隔效果。一次实验中释放效率超过100%可能是由于抗体部分从表面脱落——这是基于免疫亲和力的分离技术的一个已知限制[5]。总体而言，这些结果表明，PLL–PNIPAM–抗CD63抗体–BSA修饰的超表面能够在最小的样品体积（约5 μL）内高效且特异性地捕获EVs。捕获的EVs可以通过温和的温度变化（27°C–35°C）释放，利用PNIPAM的可逆亲水-疏水转变，而不会破坏囊泡的完整性和表面蛋白质结构。除了MCF-7模型，我们还通过针对EVs上的保守四膜蛋白标记物（CD63）展示了我们平台的广泛适用性。基于PNIPAM的超表面是模块化的，可以很容易地适应从不同来源的细胞中捕获EV亚群。使用为MCF-7衍生的CD63阳性EVs建立的相同工作流程，我们成功捕获并释放了来自HEK-293细胞的CD63阳性EVs（图S9），证实了该平台在不同细胞系中的通用性。

3.8 释放的EVs的特征分析

本研究的主要目标是在避免使用强烈的酶或化学处理的同时，分离出高纯度和异质性较低的EVs。为了确认从超表面传感器成功捕获和释放了完整的EVs，我们使用SEM、TEM、NTA、fNTA和Western blotting对收集的样本进行了特征分析，如前所述。EVs最初使用超滤芯片通过双滤过过程根据其大小进行分离[16]。因为我们的超表面传感器通过它们的表面四膜蛋白标记物（CD63）来分离EVs，除了传统的NTA外，我们还使用fNTA进一步量化了CD63阳性EVs。这使得能够像文献中展示的那样[42]对EVs进行抗原特异性计数。在此步骤中同样严格遵循了上述的MISEV标准[25]。与超滤结果类似，SEM成像显示了释放的EVs具有典型的球形形态（图6A,B）。为了提供更高分辨率的超微结构特征分析，还对超滤分离的和传感器释放的（分离的）EV组分进行了TEM成像（图6C,D）。TEM分析确认了两个样本中都存在具有典型球形形态的完整、膜结合的囊泡。超滤分离的EVs显示出保存良好的、轮廓分明的圆形囊泡。同样，传感器释放的EVs也保持了其特征形态，没有证据表明由于热释放过程导致膜破裂。在释放组分中观察到的颗粒密度降低与基于亲和力的微流控分离后的固有较低洗脱浓度一致。虽然负染色可以进一步增强膜对比度并有助于更详细地观察囊泡的超微结构，但其缺失并不限制当前发现的有效性。未经染色的TEM观察结果与NTA尺寸分布和生化标记物分析一致，共同支持了分离囊泡的结构完整性和身份。将来加入负染色将进一步加强超微结构特征分析。与通过超滤分离的EVs（图S6A,B）相比，释放的EVs数量较少；然而，它们的大小和形态保持一致，表明热响应性分离过程保留了囊泡的完整性。随后通过温和的温度变化（27°C–35°C）释放了捕获的EVs，利用了PNIPAM的可逆亲水-疏水转变，而不影响囊泡的完整性或表面蛋白质结构。除了MCF-7模型外，我们通过针对EVs上的保守四膜蛋白标记物（CD63）进一步展示了我们平台的广泛应用性。基于PNIPAM的超表面是模块化的，可以轻松适应捕获来自多种细胞来源的EV亚群。使用为MCF-7衍生的CD63阳性EVs建立的工作流程，我们成功捕获并释放了来自HEK-293细胞的CD63阳性EVs（图S9），证实了该平台在不同细胞系中的通用性。

3.8 释放EVs的特征分析

本研究的主要目标是在不使用强烈的酶或化学处理的情况下，分离出高纯度和异质性较低的EVs。为了确认从超表面传感器成功捕获和释放了完整的EVs，我们使用了SEM、TEM、NTA、fNTA和Western blotting对收集的样本进行了特征分析。EVs最初使用超滤芯片根据其大小进行分离[16]。由于我们的超表面传感器通过其表面的四膜蛋白标记物（CD63）来分离EVs，除了传统的NTA外，我们还使用fNTA进一步量化了CD63阳性EVs。这实现了文献中所述的抗原特异性计数[42]。同样，在这一步骤中也严格遵循了上述的MISEV标准[25]。与超滤结果类似，SEM成像显示了释放的EVs具有典型的球形形态（图6A,B）。为了提供更高分辨率的超微结构特征分析，还对超滤分离的和传感器释放的（分离的）EV组分进行了TEM成像（图6C,D）。TEM分析确认了两个样本中都存在具有典型球形形态的完整、膜结合的囊泡。超滤分离的EVs显示出保存良好的、边界清晰的圆形囊泡。同样，传感器释放的EVs也保持了其特征形态，没有证据表明由于热释放过程导致膜破裂。在释放组分中观察到的颗粒密度降低与基于亲和力的微流控分离后的固有较低洗脱浓度一致。虽然负染色可以进一步增强膜对比度并有助于更详细地观察囊泡的超微结构，但其缺失并不限制当前发现的有效性。未经染色的TEM观察结果与NTA尺寸分布和生化标记物分析一致，共同支持了分离囊泡的结构完整性和身份。将来加入负染色将进一步加强超微结构特征分析。与通过超滤分离的EVs（图S6A,B）相比，释放的EVs数量较少；然而，它们的大小和形态保持一致，表明热响应性分离过程保留了囊泡的完整性。随后进行了NTA测量，以确定释放EVs的尺寸分布和浓度，每组进行了五次独立测量（n = 5），每次测量持续60秒。从传感器释放的EVs的平均直径为97.3 ± 2.2 nm，模态值为120.4 ± 0.7 nm，与典型的EV尺寸范围一致（图6E）。在较高直径（299, 507, 和 579 nm）处检测到了一些小峰，这可能对应于聚集物。

3.8 从PLL–PNIPAM–抗CD63抗体修饰和BSA阻隔的传感器释放的EVs的特征分析。SEM图像显示了（A）低放大倍数下的释放EVs和（B）高放大倍数下的EVs，显示出球形形态和完整性。同样，TEM图像显示了（C）超滤分离的EVs在传感器检测之前的形态，以及（D）传感器释放（分离的）EVs在热诱导脱附后的形态，两者都显示出与脂质双层包裹的颗粒一致的完整、膜结合的囊泡形态。（E）通过NTA确定的分离囊泡的尺寸分布和浓度。（F）fNTA结果显示Alexa Fluor 488缀合的抗CD63抗体免疫标记的EVs，确认了四膜蛋白阳性囊泡。（G）Western blot分析验证了释放的EV样本中存在EV相关标记物CD63、CD9、CD81和TSG101，以及内质网标记物calnexin的缺乏，证实了囊泡的身份和纯度。比较两种方法时，NTA测量的颗粒浓度分别为超滤的1.01 × 10^10 ± 5.23 × 10^8 particles/mL和传感器的6.94 × 10^7 ± 6.31 × 10^6 particles/mL（图S6C,D）。为了进一步验证EV的特异性捕获，释放的囊泡用Alexa Fluor 488标记的抗CD63抗体进行免疫染色，并在蓝光激光激发源下使用fNTA进行分析。平均和模态尺寸分别为108.5 ± 7.6 nm和108.1 ± 7.6 nm（图6F）。在fNTA测量中，较高尺寸峰（约500 nm）的消失表明传感器去除了非囊泡污染物，如盐晶体或尘埃颗粒。尺寸分布向200–300 nm的轻微移动可能是由于热响应性释放过程中表面结合的抗体的部分脱落[5]。相比之下，通过fNTA测定的荧光标记EVs的浓度分别为超滤的1.98 × 10^6 ± 1.71 × 10^5 particles/mL和超表面传感器的7.09 × 10^5 ± 3.82 × 10^5 particles/mL（图6F）。此外，定义了一个富集因子（公式（2）来量化超表面传感器选择性分离真实EVs的程度，从而反映了与传统基于尺寸的超滤方法相比样品纯度的提高：

根据公式（2），热响应超表面传感器提供了高达100倍的EV样本纯度提升，这归因于通过CD63识别进行的选择性分离，显著减少了非囊泡污染物和碎片。鉴于EVs在大小、表面组成和蛋白质含量上的固有异质性，我们基于亲和力的热响应捕获和释放策略显著提高了样品的特异性和均匀性。最后，使用Western blot分析确认了释放EVs的分子身份及其表面存在的CD63四膜蛋白（图6G）。从BSA阻隔的等离子体超表面捕获和释放的EV样本（五次重复）被收集进行分析。已知CD63会经历翻译后的N-糖基化修饰[43, 44]，通常在35至80 kDa范围内产生一个扩散的条带图案。Western blot结果清楚地确认了收集的EV样本中存在CD63，验证了四膜蛋白标记物在捕获和释放事件后仍然保持完整。除了CD63，还进行了另一组Western blot分析，以确认CD9、CD81和TSG101的存在——这些是符合MISEV2018指南的典型EV相关标记物。值得注意的是，作为阴性对照的内质网驻留蛋白calnexin在所有释放的EV组分中都不存在，证实了没有细胞器污染，支持了分离囊泡的纯度。除了蛋白质验证外，RNA负载分析还将为EV内容提供补充见解。然而，根据MISEV2023的最低标准，这不是EV特征分析所必需的。由于我们在本研究中展示了一个概念验证策略，因此我们严格遵循并满足了MISEV2018和MISEV2023指南作为EV特征分析的最低要求[5]。这里提出的多标记蛋白验证完全符合这些标准，支持了分离囊泡的身份和完整性。基于RNA的分析也是未来研究的重要方向，因为平台将进一步发展。总体而言，SEM、NTA、fNTA、TEM和Western blot分析证实了PNIPAM修饰的超表面平台能够在最小样品体积（约5 μL）内温和而高效地分离EVs，同时保持它们的结构和生化完整性。没有使用强烈的化学物质或酶处理，加上高纯度性能，突显了这种热响应等离子体系统在无标记和最小化侵入性EV分离应用中的潜力。

4 结论

本研究介绍了一种热响应等离子体超表面传感器，作为一种多功能且无标记的平台，用于控制和按需释放EVs。通过将PNIPAM集成到功能化有抗CD63抗体的纳米级超表面上，该系统利用温度诱导的亲水-疏水转变来实现可逆的EV结合，而不会造成化学破坏。使用MCF-7衍生的EVs作为模型系统，该平台实现了10^7–10^10 particles/mL的动态检测范围内的实时监测，检测限为1.6 × 10^7 particles/mL，且在用BSA表面钝化后的释放效率为87.03 ± 23.5%。包括SEM、TEM、NTA、fNTA和Western blotting在内的补充分析证实了高纯度（与超滤过程相比纯度提高了约100倍），保持了释放囊泡的形态和生物标记物的完整性。此外，EVs在暴露于37°C后蛋白质水平可能会略有波动，但由于该温度在生理范围内，因此预计不会有剧烈变化[45, 46]。某些细胞类型可能对这种温度变化更敏感，在设计实验时应予以考虑，尽管我们的NTA、SEM、TEM和Western blot数据表明EV的完整性得到了保持。除了我们的方法（微流控超滤）外，我们还使用超速离心（UC）和免疫磁珠方法（MB）进行了比较EV分离。总体而言，所有方法产生的EV浓度相当，没有观察到统计学上的显著差异，但显示出不同的尺寸分布。UC产生的颗粒浓度为5.26 × 10^8 ± 2.18 × 10^7 particles/mL，分布较窄，单峰尺寸中心为110.6 ± 2.8 nm，与其在分离小EVs方面的既定效率一致。然而，UC需要专门的高速仪器，处理时间较长，并可能共分离出蛋白质聚集体和非囊泡污染物，这限制了其在资源有限或现场护理环境中的实用性。我们的方法产生了3.07 × 10^8 ± 2.34 × 10^7 particles/mL的浓度，模态尺寸为139.6 ± 11.9 nm，代表了更加易用和可重复的替代方案，且设备需求较低。MB分离产生的浓度为2.97 × 10^8 ± 1.46 × 10^7 particles/mL，但分布更广且更不均匀，包括一个大约280 nm的次级峰值。这可能反映了与磁珠相关的聚集体或非特异性结合，与已知的基于磁珠的方法的局限性一致。总体而言，这些结果突显了我们平台在无需依赖超速离心基础设施或复杂基于磁珠的工作流程的情况下实现可靠和特异性EV分离的优势，使其特别适合微型化和现场护理诊断应用（图S10）。这个概念验证平台相比传统的EV分离系统具有几个优势，包括便携性（传感器尺寸为1.5 cm × 1.5 cm，读出设备尺寸为9 cm × 12 cm）、低成本（每个传感器1.50美元）、可重复测量以及与低体积样品（300-450 μL）的兼容性。手持设置消除了对复杂光学配置或培训的需求，使其适合现场护理诊断。然而，在临床转化之前还需要一些改进。首先，表面阻隔仍然是实现更高选择性和可重复性的关键因素；使用PEG、两性聚合物或表面活性剂辅助的阻隔策略等试剂优化表面化学可以进一步减少非特异性吸附。尽管本研究专注于MCF-7和HEK-293细胞的CD63阳性EVs，但基于PNIPAM的超表面具有高度通用性，可以使用CD9、CD81、EpCAM和HER2等替代标记物轻松适应捕获其他EV亚群。这种灵活性得益于强大的琥珀酰亚胺–NH2表面化学性质，这使得该材料能够与多种抗体直接进行功能化处理，从而实现多种电动汽车（EV）标记物和亚群的目标分离。其次，金属表面传感器上的有限面积限制了捕获效率，导致释放后颗粒浓度降低。这一问题可以通过扩大通道几何尺寸或增加活性表面积来提高结合能力来解决。此外，局域化的等离子体场强度会随着距离表面的增加而迅速衰减，因此需要优化分子间距以实现高效的信号传输。总体而言，这种基于热响应金属表面的传感系统为电动汽车的选择性、时空分离及实时分析提供了一个强大的平台。随着表面工程和流体集成的不断改进，这项技术在作为下一代电动汽车诊断工具、精准肿瘤学及个性化医疗领域具有巨大潜力。

致谢：
Fatih Inci 感谢土耳其科学技术研究委员会（TüB?TAK）提供的2232国际杰出研究人员奖学金（项目编号：118C254）和TüB?TAK 1001科研项目资助计划（项目编号：120Z445）的支持。然而，该出版物的全部责任仍归其所有者所有。从TüB?TAK获得的财政支持并不意味着该出版物的内容在科学上得到了TüB?TAK的认可。Fatih Inci 还感谢TüB?TAK激励奖、土耳其科学院杰出青年科学家奖励计划（TüBA-GEBIP）、科学学院的青年科学家奖励计划（BAGEP）、TüSEB Aziz Sancar激励奖、Nejat Eczacibasi医学激励奖以及伊兹密尔生物医学与基因组中心（IBG）的科学奖的支持。作者特别感谢Burak Derkus博士在透射电子显微镜（TEM）实验中的帮助。

利益冲突声明：
作者声明不存在任何利益冲突。

数据可用性声明：
本研究的数据可在合理请求下向通讯作者获取。