Heme-NO通过动员血管平滑肌细胞内亚硝基扩张剂激活的细胞内一氧化氮储存库（NANOS）中的一氧化氮（NO）基团来扩张动脉

《Advanced Science》：Heme-NO Dilates Arteries via Mobilization of NO Moieties From an Intracellular NO Store Within Vascular Smooth Muscle Cells

　　

亚硝基血红素（Heme-NO）最近已成为一氧化氮（NO）的替代信号实体。然而，关于Heme-NO如何跨细胞膜传递信号的问题仍然存在。本文中，研究人员验证了以下假设：细胞外Heme-NO作为一种亚硝基扩张剂（Nitrodilator）发挥信号作用，它通过动员血管系统中亚硝基扩张剂激活的细胞内NO储存库（Nitrodilator-Activated intracellular NO Store, NANOS）中的NO基团来诱导血管舒张。研究人员鉴定了一种谷胱甘肽（Glutathione, GSH）催化的模型化合物（alb-heme-NO）形成的新机制，并确定谷胱甘肽（GSH）是其结构中的一个配体。Heme-NO复合物可与血液中的血浆蛋白结合，因此，它无法渗透红细胞或血管壁。无论是离体还是在体实验，Alb-heme-NO介导的血管舒张在预先耗竭NANOS后会减弱，而在补充NANOS后会增强。与Alb-heme-NO共孵育可诱导NO基团从动脉中流出。此外，亚硝基血红蛋白（Nitrosyl hemoglobin, HbNO）在介导红细胞一氧化氮生物活性输出的作用受到挑战。总之，Heme-NO通过激活细胞内的NANOS，作为一种细胞外亚硝基扩张剂发挥功能。

一、 研究背景、问题与目的

一氧化氮（NO）是关键的血管舒张信号分子，经典观点认为其从内皮NO合酶（eNOS）自由扩散至血管平滑肌细胞（Vascular Smooth Muscle Cells, VSMCs）中的可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）并激活之。然而，NO作为一种高活性自由基，半衰期极短，其如何避免各种清除反应而选择性激活sGC，是信号传导领域长期存在的疑问。为解释这一现象，S-亚硝基硫醇（S-nitrosothiols, SNO）、二亚硝基铁复合物（Dinitrosyl iron complexes, DNIC）等多种NO加合物被提出作为中间体，但它们激活sGC的具体机制尚不明确。近年来，亚硝基血红素（Heme-NO）作为一种可稳定NO、并能与sGC不可逆结合并有效激活sGC（效力与NO相当）的内源性NO加合物，被认为是NO的替代信号实体，甚至被推测为红细胞（RBCs）输出NO生物活性的中间体。然而，Heme-NO作为一个大分子复合物，其如何像NO一样高效地跨细胞膜传递信号，是这一假说的核心未解难题。

针对此问题，研究人员及其团队此前提出了“亚硝基扩张剂激活的细胞内NO储存库”（Nitrodilator-Activated intracellular NO Store, NANOS）模型。该模型认为，SNO、DNIC、硝酸甘油（Nitroglycerin, NTG）等膜不渗透、缓慢释放NO的化合物（被归类为“亚硝基扩张剂”，而非释放自由NO的“亚硝基血管扩张剂”），并非通过释放其自身的NO基团，而是通过动员血管平滑肌细胞内一个预先形成的NO储存库（即NANOS）中的NO基团来诱导血管舒张。NANOS可被耗竭也可被补充。近期有研究指出，谷胱甘肽（GSH）可催化形成与白蛋白（Albumin）结合的Heme-NO（即alb-heme-NO）。在此背景下，本研究旨在重新审视GSH在alb-heme-NO合成中的作用，探究Heme-NO的膜渗透性，并检验其是否作为一种亚硝基扩张剂，通过激活NANOS来跨膜传递信号、诱导血管舒张。该研究发表在《Advanced Science》期刊，对深入理解NO信号传导的非经典通路具有重要意义。

二、 主要技术方法

本研究综合运用了生物化学、离体血管功能学、在体动物实验和多种分析技术。研究人员制备了经N-乙基马来酰亚胺（NEM）预处理和凝胶过滤（G-25柱）纯化的模型化合物alb-heme-NO。通过电子顺磁共振（Electron Paramagnetic Resonance, EPR）、液相色谱-质谱联用（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS）分析了其合成机制与结构。利用EPR和化学发光法（Chemiluminescence）评估了alb-heme-NO在血浆、全血、无血浆血液（PFB）及离体动脉中的膜渗透性和稳定性。采用离体血管环肌动描记术（Wire Myography）在去除内皮的绵羊肠系膜动脉上检测了alb-heme-NO的血管舒张效应，并通过给予sGC氧化剂ODQ、NO清除剂CPTIO、超氧化物歧化酶1（SOD1）、硝酸盐（Nitrite）及预处理（GSNO、紫外线）等手段研究了NANOS的参与。体内实验则在大鼠模型中进行，通过4天预处理（包括给予NANOS耗竭剂L-NMMA、NTG或补充剂Nitrite、L-NAME、D-NAME）后，静脉输注或单次推注（Bolus）alb-heme-NO，监测平均动脉压（MAP）和肠系膜动脉导管的动态变化。此外，利用¹⁵N-硝酸盐同位素标记技术和密封血管灌注模型，结合化学发光与气相色谱-质谱联用（Gas Chromatography-Mass Spectrometry, GC-MS），直接检测了alb-heme-NO刺激下动脉壁内NO基团的流出。最后，在绵羊羔羊模型上，通过静脉注射含HbNO的全血，评估了HbNO在体循环中的血管活性。动物实验均遵循相关机构动物伦理委员会（IACUC）批准。

三、 研究结果

3.1 GSH在alb-heme-NO合成中的作用

研究发现，GSH可显著催化alb-heme-NO的形成，但其产物是含有5-配位（5-C）亚铁血红素-NO和未被识别的6-配位（6-C）GS-血红素（Fe³⁺）化合物的混合物。在GSH与高铁血红素（Fe³⁺）的结合过程中检测到了巯基自由基（Thiyl radical）的生成，且NO可促进此过程。巯基自由基清除剂（DMPO, NaAsc）不影响最终Heme-NO的产率。LC-MS分析证实，在去除白蛋白后，水相中仍同时存在血红素和GSH，表明GSH是alb-heme-NO产物结构中的配体。研究提出了GSH催化alb-heme-NO形成的新机制。

3.2 Alb-heme-NO的膜渗透性和稳定性

EPR分析显示，alb-heme-NO加入全血后几乎全部滞留在血浆中，无法进入红细胞。在无血浆血液中，Heme-NO可与红细胞膜外侧结合，但加入血浆后大部分可被提取回血浆。体内实验也证实，静脉输注的alb-heme-NO主要滞留在血浆而非红细胞中。在血浆-动脉混合体系中，Heme-NO同样滞留在血浆，无法被检测进入动脉组织。这些结果表明Heme-NO是细胞膜不渗透的。此外，alb-heme-NO在血浆和血液中性质稳定，但原有的6-C GS-血红素（Fe³⁺）化合物信号在进入血液后消失，转化为5-C Heme（Fe²⁺)-NO。

3.3 离体功能证据支持NANOS参与alb-heme-NO介导的血管舒张

离体血管实验表明，alb-heme-NO引起的血管舒张是sGC依赖性的，其效力与NO相当，且不被NO清除剂CPTIO阻断。预先用GSNO（已知可耗竭NANOS）或紫外线处理血管，可减弱后续alb-heme-NO的舒张作用，而这种减弱可被硝酸盐（已知可补充NANOS）逆转。与其它亚硝基扩张剂类似，alb-heme-NO的舒张作用不被单独的CPTIO或SOD1影响，但被二者联用显著减弱。内皮的存在与否不改变其舒张反应。这些结果为alb-heme-NO作为一种亚硝基扩张剂，通过动员血管平滑肌细胞内的NANOS来诱导血管舒张提供了功能证据。

3.4 体内功能证据支持alb-heme-NO通过激活NANOS介导血管舒张

在大鼠体内，为期4天的NANOS耗竭剂（L-NMMA, NTG）预处理减弱了alb-heme-NO逐步输注引起的肠系膜动脉舒张，而NANOS补充剂（Nitrite, L-NAME, D-NAME）则增强了该舒张。单次推注alb-heme-NO引起的降压效应（幅度和持续时间）同样被NANOS耗竭剂阻断，并被NANOS补充剂增强。这些效应并非由alb-heme-NO药代动力学的改变引起。急性（10分钟）给予L-NAME缩短了降压持续时间，与L-NAME对NOS的快速抑制效应一致。这些结果在体证实了NANOS参与alb-heme-NO介导的血管舒张。

3.5 Alb-heme-NO促进NO基团从动脉平滑肌流出

通过¹⁵N-硝酸盐预标记动脉壁NANOS，并在密封血管腔内给予alb-heme-¹⁴NO，研究发现，alb-heme-NO处理减少了动脉壁中可被检测为¹⁵N-硝酸盐的化合物含量，同时增加了外膜缓冲液中的¹⁵N-NO_x水平。这提供了直接的化学证据，表明alb-heme-NO激活了动脉壁内NO基团（源自NANOS）的流出。

3.6 Heme-NO在红细胞输出NO生物活性中的作用

离体血管实验中，纯化的游离HbNO无血管舒张活性。在绵羊羔羊体内，短期内（5分钟内）制备的含HbNO全血静脉注射可引起低血压效应，但该效应并非来自溶解的NO或血浆中的成分，且源于红细胞内部。然而，在室温储存60分钟后，含HbNO全血的血管舒张活性显著降低，而此时EPR和光谱法检测到的Heme-NO和HbNO水平并未下降。此外，在RBCs内形成的HbNO难以被输出到血浆中。这些结果表明，HbNO可能并非介导红细胞输出NO生物活性的中间体，真正起作用的舒张介质仍有待确定。

四、 讨论与结论总结

讨论部分总结：

本研究揭示了GSH催化形成alb-heme-NO并作为其配体的新机制，挑战了Heme-NO跨膜直接激活sGC的传统直觉，并通过离体、在体功能学及化学证据，强有力地支持了Heme-NO作为一种细胞外亚硝基扩张剂，通过动员血管平滑肌细胞内NANOS来介导血管舒张的模型。研究发现Heme-NO与血浆蛋白结合，无法渗透细胞膜，这与其高效的血管舒张活性形成鲜明对比，从而凸显了NANOS模型的重要性。研究还挑战了HbNO作为红细胞输出NO生物活性关键中间体的观点，因为其舒张活性在室温储存后会丧失，且难以从RBCs高效输出。然而，NANOS的确切化学本质、物理组织形式，以及细胞外亚硝基扩张剂如何触发细胞内NANOS动员的具体分子机制，仍是未来研究的重要知识缺口。其中，Hsp90介导的细胞内Heme-NO（如与GAPDH结合者）向sGC的信号传递通路，可能与NANOS模型存在概念上的兼容性，为连接NANOS与sGC激活提供了潜在机制。

研究结论翻译：

研究人员发现，Heme-NO并非通过跨过质膜进行信号传递；相反，它通过动员血管平滑肌细胞内的一个一氧化氮储存库中的NO基团来扩张动脉。