来自Candolleomyces Aberdarensis的进化而来的非特异性过氧化物酶的结构特征与反应特性

《Advanced Synthesis & Catalysis》：Structural Features and Reaction Profile of an Evolved Unspecific Peroxygenase From Candolleomyces Aberdarensis

　　摘要

真菌非特异性过氧化物酶（UPOs）是一类多功能生物催化剂，能够将氧插入未活化的C-H键中。尽管它们在有机合成中具有重要意义，但只有少数UPOs在结构和生化方面得到了详细研究。在本研究中，我们对来自Candolleomyces aberdarensis的一种不寻常的、酸性的、长链UPO的结构和反应特性进行了探讨。该酶的晶体结构分辨率达到了1.8 ?，这有助于揭示出其与典型长链UPOs不同的几个催化决定因素。我们进行了与烷烃、脂肪酸以及norisoprenoids α-damascone和α-ionone的共结晶实验，并对酶促反应进行了分析。与烷烃和脂肪酸反应时，这种生物催化剂会在ω?1和ω?2位置进行氧化，生成二醇和酮；而与α-ionone和α-damascone反应时，则分别生成3-羟基-α-ionone和10-羟基-α-damascone。这种生物催化剂的底物选择性主要取决于其高度疏水的血红素通道，其中一些残基伸入通道内部，以及一个由Met残基组成的三脚架结构，该残基具有双重构象。分子动力学模拟表明，酶的催化作用主要由通道的门控机制、配体在通道内的特异性预组织以及通往活性位点的复杂扩散路径驱动。

1 引言

自从二十多年前发现含有血红素的非特异性过氧化物酶（UPO，EC 1.11.2.1）以来，它作为一种多功能生物催化剂在有机合成中的地位稳步提升。UPO能自然地将氧插入脂肪族和芳香族化合物的惰性C-H键中，其优势在于其简单性：它是细胞外可溶的，并且仅依赖过氧化氢作为最终的电子受体和主要的氧供体来执行最复杂的氧化反应[1-3]。除了标准的有机化学外，UPO还为实现更复杂的生物转化提供了基础，例如通过全新的化学途径，如最近合成的有机硅烷、反马尔科夫尼科夫氧化、环丙烷化或氮烯插入反应[4-8]。UPOs被分为两个系统发育群：I族（短链UPOs），由约26 kDa的单体组成，Histidine作为电荷稳定剂；II族（长链UPOs），由约44 kDa的单体组成，Arginine作为电荷稳定剂。长链和短链UPOs在结构特征上存在差异，血红素通道的几何结构决定了它们的底物选择性和产物选择性[1-3]。尽管人们对这些酶的兴趣日益增加，但迄今为止只有七种UPOs在结构和生化层面得到全面研究，其中只有两种属于长链UPOs[3, 9-12]。因此，长链UPOs的代表是典型的Cyclocybe (Agrocybe) aegerita UPO（AaeUPO）及其通过定向进化改造的PaDa-I突变体，这两种酶已成为该领域大量研究的对象[1-3, 13-15]。最近，来自非洲墨帽菌Candolleomyces (Psathyrella) aberdarensis的两种不寻常的酸性过氧化物酶PabUPO-I和PabUPO-II也经过了工程改造[16]。与PaDa-I类似，这两种长链UPO也被设计为能够容易被Saccharomyces cerevisiae和Pichia pastoris（Komagataella phaffii）分泌。最近对PabUPO-II的晶体学表征还结合了对底物选择性的分析[17]。为了补充这项工作，我们现在呈现了从PabUPO-I衍生出的Grogu变体的晶体学和底物分析结果，这种变体是通过将PaDa-I的信号肽连接到PabUPO-I上，并插入一个用于分泌的突变骨架（S61A-L79I-A252L）来改造的。Grogu突变体在S. cerevisiae中表达量很高（14 mg/L），并且在P. pastoris的连续培养生物反应器中表达量可达240 mg/L，无需对生产工艺进行优化。这种UPO不仅活性强且稳定性好，而且在广泛的pH范围（3–9）内都能保持过氧化物酶活性（pH 4–8时活性超过80%）。这一特性可能使其在未来的工业应用中（如酶级联反应）具有吸引力[16]。在本研究中，Grogu突变体被高分辨率结晶，与模型底物（烷烃、脂肪酸和norisoprenoids）形成了复合物，并通过气相色谱/质谱（GC/MS）分析了其对这些底物的选择性。分子动力学（MD）模拟进一步揭示了这种酶的催化机制。

2 结果与讨论

2.1 Grogu突变体的结构特征

Grogu变体是在5L连续培养生物反应器中由P. pastoris产生的，并被纯化为均一状态（Reinheitszahl值 [Rz] A418/A280 = 2）。重组酶的分子量为43,000 Da，其中糖基化贡献了14%。尝试结晶去糖基化形式的酶（即经过Endo H酶反应后的形式）未能成功，因此后续实验均使用糖基化酶进行。高质量的Grogu变体大块晶体在含有6–16%聚乙二醇（PEG）8000、0.1 M 4-(2-磺酸乙基)morpholin-4-ium（MES）和0.15 M氯化锌的溶液中生长，获得了最大分辨率为1.8 ?的衍射数据。这些晶体属于P65空间群，每个不对称单元包含两个分子（详见材料与方法部分及补充表S1中的实验细节和结构确定步骤）。电子密度图使得从Leu1到Leu334的整个多肽链可以进行建模。该模型还包括一个血红素基团、一个结构上的Mg2+离子以及在Asn16、Asn145和Asn165处的三个糖链（N-糖基化位点）。糖链包含N-乙酰-D-葡糖胺（NAG）、β-D-甘露糖（BMA）和α-D-甘露糖（MAN）单元。此外，结晶缓冲液中的一些MES分子和 Cryoprotectant中的甘油分子也结合在分子表面的不同位置。根据PDBePISA服务器的数据，不对称单元由两条独立的多肽链组成[18]，因此功能性酶是单体，这与长链UPO的特性一致。这两条链基本相同（链间的均方根偏差为0.2068 ?），主要区别在于每条链上的糖链组成。不含配体的Grogu与其他已结晶的长链UPOs（AaeUPO和PabUPO-II）具有相似的折叠排列[9, 10, 17]。Grogu、PabUPO-II和AaeUPO的序列同源性约为65%，整体结构由10个α-螺旋和两个通过长环连接的β-链组成，见图1。 prosthetic血红素基团被这些环包围，并连接到Cys40上，Cys40是构成PCP结构（Pro39-Cys40-Pro41）的近端/轴向配体[19]。血红素基团的第六个配位位点被一个水分子占据，作为远端配体。长链UPOs的另一个共同特征是在C末端结构域中存在分子内二硫键，在Grogu中位于Cys285和Cys325之间。与PabUPO-II和AaeUPO一样[17]，Grogu还具有一个结构上的镁离子（Mg2+，在图1中表示为绿色球体），而H2O2裂解所需的酸碱对由Arg193和Glu200组成，前者作为酶的电荷稳定剂[2]。图1展示了Grogu突变体的整体折叠结构：血红素基团（浅紫色）、糖链（绿色）以及甘油和MES分子（米色）以棒状表示。镁阳离子（Mg2+）用浅绿色球体表示，晶格中捕获的几个锌阳离子（Zn2+）用紫色球体表示。

2.2 Grogu突变体的结构特征

Grogu变体是在5L连续培养生物反应器中由P. pastoris产生并纯化为均一状态（Reinheitszahl值 [Rz] A418/A280 = 2）。重组酶的分子量为43,000 Da，其中糖基化贡献了14%。尝试结晶去糖基化形式的酶（即经过Endo H酶反应后的形式）未能成功，因此后续实验均使用糖基化酶进行。高质量的Grogu变体大块晶体在含有6–16%聚乙二醇（PEG）8000、0.1 M 4-(2-磺酸乙基)morpholin-4-ium（MES）pH 6.5和0.15 M氯化锌的溶液中生长，获得了最大分辨率为1.8 ?的衍射数据。这些晶体属于P65空间群，每个不对称单元包含两个分子（详见材料与方法部分及补充表S1中的实验细节和结构确定步骤）。电子密度图使得从Leu1到Leu334的整个多肽链可以进行建模。该模型还包括一个血红素基团、一个结构上的Mg2+离子以及在Asn16、Asn145和Asn165处的三个糖链（N-糖基化位点）。糖链包括N-乙酰-D-葡糖胺（NAG）、β-D-甘露糖（BMA）和α-D-甘露糖（MAN）单元。此外，结晶缓冲液中的一些MES分子和cryoprotectant中的甘油分子也结合在分子表面的不同位置。根据PDBePISA服务器的数据，不对称单元由两条独立的多肽链组成[18]，因此功能性酶是单体，这与长链UPO的特性一致。这两条链基本相同（链间的均方根偏差为0.2068 ?），主要区别在于每条链上的糖链组成。不含配体的Grogu与其他已结晶的长链UPOs（AaeUPO和PabUPO-II）的折叠排列相似[9, 10, 17]。Grogu、PabUPO-II和AaeUPO的序列同源性约为65%，整体结构由10个α-螺旋和两个通过长环连接的β-链组成，见图1。Prosthetic血红素基团被这些环包围，并连接到Cys40上，Cys40是构成PCP结构（Pro39-Cys40-Pro41）的近端/轴向配体[19]。血红素基团的第六个配位位点被一个水分子占据，作为远端配体。长链UPOs的另一个共同特征是C末端结构域中的分子内二硫键，在Grogu中位于Cys285和Cys325之间。如图1所示，Grogu还具有一个结构上的镁离子（Mg2+），表示为绿色球体，而H2O2裂解所需的酸碱对由Arg193和Glu200组成，前者作为酶的电荷稳定剂[2]。图1还展示了Grogu的血红素通道：(A) Grogu的主要结构特征以绿色棒状表示，并与AaeUPO和PabUPO-II进行了比较，后者的残基分别用蓝色和橙色棒状表示。彩色标签对应于每种酶。(B) Grogu（绿色）和PabUPO-II（米色）表面之间的结构差异。(C) 定义Grogu血红素通道的残基以绿色棒状表示，水分子以红色球体表示。(D) 显示带有配体结合的Grogu血红素通道。血红素基团用紫色棒状表示，轴向配体Cys40和相关的苯丙氨酸（Phe80、195、282、289）用绿色棒状表示。血红素通道在分子内部形成一个深隧道，与其他长链UPO的通道有显著差异。首先，Grogu突变体通道入口处的苯丙氨酸残基（Phe80和Phe195）定义了通道的上部区域，与AaeUPO中的Phe76和Phe191相似[2A]。与AaeUPO相比的一个关键区别是，这些芳香族残基在Grogu中处于独特的构象中，因此AaeUPO中认为对底物向活性位点转运至关重要的灵活性在Grogu中并未体现[9, 10]。相反，PabUPO-II中两个脂肪族氨基酸（Val92和Ile207）位于相同位置。在将底物定位到血红素附近的芳香族三联体方面，PabUPO-II（Phe85、Phe137和Phe215）和AaeUPO（Phe69、Phe121和Phe199）几乎相同[17]，而在Grogu突变体中，其中一个苯丙氨酸被甲硫氨酸（Met73）取代，与Coprinopsis cinerea中的长链UPO类似[20]，形成了另一个三联体（Met73、Phe125和Phe203）。Met73在某些复合物中呈现双重构象，这可能参与了催化过程中的底物动态转运[2A,C]。分子动力学（MD）轨迹分析显示，Met73的双重构象与血红素通道的几何结构有很强的相关性[3]。主成分分析（PCA）表明，Met73的构象A和B在投影的构象空间中占据不同区域，对应于通道开放程度的不同[3A]。从这些构象基团中提取的代表结构显示，通道形状的变化与通道腔体的逐渐扩大和开放有关，这支持了Met73作为动态门控机制调节底物转运的作用[3B,C]。

Grogu通道的构象状态：(A) 基于MD轨迹的PCA计算出的核密度估计。投影分别显示了构象A下的Met73（左）、合并后的Met73 A和B（中）以及构象B下的Met73（右）。在结合的数据集中，突出了对应于状态A、B和C的三个主要基团，代表不同的通道构象。(B) 代表通道形状和中心线（红色）相对于Grogu结构的示意图。(C) 从PCA峰值提取的对应于状态A、B和C的代表通道几何结构。MD = 分子动力学；PCA = 主成分分析。Grogu的活性位点还受到Val81的影响，Val81突入通道中间，可能会阻碍大分子底物的进入[2B]。此外，Glu200参与形成酸碱对，并似乎部分覆盖了血红素基团，从而阻碍了底物接近血红素[2C]。总体而言，通道具有高度疏水性，只含有少量极性残基（如Thr196和Thr245）。值得注意的是，通道富含苯丙氨酸残基（Phe80、Phe195、Phe282、Phe289和Phe316）。其中，Phe80、Phe195和Phe289定义了一个在血红素远处起关键作用的口袋[2C,D]。如AaeUPO、PabUPO-II和Grogu变体的结构对齐所示（补充图S1），只有Phe279在PabUPO-II序列中得到保留（对应于Phe292），其血红素通道中仅多一个苯丙氨酸残基（Phe336）[21]。这种对齐还表明，定义血红素通道的残基主要位于规则的二级结构区域内，即α3、α6和α9螺旋[补充图S1]。在Grogu中，定义血红素通道侧向扩展的苯丙氨酸残基Phe80（α3螺旋）、Phe195（α6螺旋）和Phe289（α9螺旋）均位于这些螺旋内。尽管这些苯丙氨酸在AaeUPO序列中得到保留，但其血红素通道中并未形成类似的口袋，主要是由于两个关键差异：首先，AaeUPO中α6螺旋中的Phe188（对应于Grogu变体中的Pro192）在空间上阻塞了口袋的形成[4]。其次，Grogu中α9螺旋中的Phe282位置在AaeUPO中被Pro277取代。这些微妙的差异共同作用，形成了独特的整体通道几何结构，因此解释了这些过氧化物酶在配体结合模式上观察到的显著差异。图4

比较了Grogu变体（绿色）和AaeUPO（PDB代码：2YOR）（灰色）。位于α3、α6和α9螺旋中的相关残基用棍状表示，以及每种过氧化物酶的血红素基团。

2.2 共结晶和酶学研究

Grogu晶体在浸泡和共结晶实验中与模型底物十四烷、月桂酸和诺里索普烯类（α-达马斯酮和α-离子酮）进行了研究，但只有共结晶策略产生了图2D和图5中显示的复合物（有关这些复合物的完整晶体学细节，请参见材料和方法部分及补充表S1）。血红素通道中的电子密度反映了所有复合物中的配体结合情况，尽管这些配体远离血红素，因此处于看似非催化的位置。血红素通道的上层区域有几个水分子，还有两个直接与铁血红素配位的水分子，这与UPOs反应机理中描述的化合物I相似。所有这些配体似乎都被稳定在通道中由芳香残基形成的疏水腔内，在图2D和图5中可以看到通道的扩大。

Grogu与底物形成的晶体结构：(A) 十四烷 (C14)，(B) 月桂酸 (LAU)，(C) α-离子酮 (INI)，(D) α-达马斯酮 (DMC)。定义血红素通道的残基用绿色棍状表示，极性键用虚线表示。参与底物识别的水分子用红色球体表示，配体处的2F0–Fc电子密度在0.8–1.0 σ范围内进行了等高线处理。十四烷和月桂酸的复合物表明它们处于预催化状态，这种状态可能通过通道入口处的Ile248、Phe279和Phe282的疏水相互作用得到稳定。此外，烷基链的另一端夹在Phe80、Phe195和Phe289之间。通过GC/MS分析了Grogu的区域选择性，使用的是烷烃（十四烷和十二烷）和脂肪酸（肉豆蔻酸和月桂酸），在所有情况下都观察到ω?1和ω?2位的亚端羟基化。使用十四烷（C14）和十二烷（C12）时，Grogu的表现与PabUPO-II和AaeUPO [17, 20] 相似，能够完全转化为二醇和酮，后者是过氧化反应的结果，见图6A,B和补充表S2。对于脂肪酸，仅检测到ω?1和ω?2位的亚端醇，没有进一步的过氧化产物，因为转化率较低，见图6C,D和补充表S2。除了脂肪酸的亚端氧化外，PabUPO-II之前还显示出在二酸上的α-和β-羟基化，这是一个特别有趣的潜在碳链缩短反应[17]。然而，Grogu对十二烷二酸和十四烷二酸没有活性（数据未显示）。图6

对Grogu与(A) 十四烷 (C14)、(B) 十二烷 (C12)、(C) 肉豆蔻酸 (Myr) 和 (D) 月桂酸 (Lau) 反应的GC/MS分析。反应中包含0.3 mM的烷烃或0.1 mM的脂肪酸作为底物，50 mM的磷酸钾缓冲液（pH 6.0），2.5 mM的H2O2，1 μM的纯酶，以及20%（v/v）的丙酮，最终反应体积为2.5 mL。反应在37°C下孵育1小时（对于烷烃）或在30°C下孵育2小时（对于脂肪酸），同时以210 rpm的速度摇动。标有(*)的峰对应于每种反应对应的对照实验中也存在的微量成分。GC/MS = 气相色谱/质谱。

诺里索普烯类，如α-离子酮和α-达马斯酮，在晶体中捕获于活性位点通道的入口处，通过与通道中的芳香残基的疏水相互作用而稳定，见图5C,D。对于α-离子酮，在隧道中发现有两个分子，其环朝向血红素，其羰基与上层区域的水分子形成极性键，见图5C。GC/MS分析显示，酶在C3位置攻击α-离子酮的环，生成3-羟基-α-离子酮（3-OH-α-I），这与PabUPO-II和AaeUPO的报道一致，见图7A，补充表S2[17, 22]。就α-达马斯酮而言，晶体学复合物显示配体与α-离子酮的方向相反，即平行于血红素，并且其酮烯基朝向通道的扩大部分，见图5D。当评估Grogu与α-达马斯酮的酶促反应时，仅观察到烯丙基碳的攻击，具体是在C10位置，生成10-羟基-α-达马斯酮（10-OH-α-D），见图7B，补充表S2。Grogu还进行了逐步氧化，产生了相应的羧基化产物（10-COOH-α-D），这与AaeUPO和PabUPO-II的情况相同[17, 22]。与PabUPO-II不同，我们没有检测到3-羟基-α-达马斯酮的形成，这是由于没有攻击环的C3位置。这表明Grogu的区域选择性仅集中在烯丙基烷链上。图7

对Grogu与(A) α-离子酮 (INI) 和 (B) α-达马斯酮 (DMC) 反应的GC/MS分析。反应中使用0.5 mM的底物，在50 mM的磷酸钾缓冲液（pH 6.0）中，2.5 mM的H2O2，0.5 μM的纯酶，最终反应体积为1 mL。反应在30°C下孵育30分钟，同时以210 rpm的速度摇动。GC/MS = 气相色谱/质谱。底物通道的访问计算为这些发现提供了框架。分子动力学模拟显示，底物进入催化腔需要通道远端区域的开放。对α-离子酮和α-达马斯酮的对接研究，在代表性的通道构象（状态A、B和C，见图3）上进行，表明通道开放是底物在活性位点腔内采取反应性几何结构所必需的，见补充图S2。这种底物访问调节与晶体学结构中观察到的预催化构象一致。在这种情况下，使用潜在反应性碳（分别对应于α-离子酮和α-达马斯酮的C3和C10）与氧铁基团Cpd I之间的距离作为评估状态依赖性活性位点可访问性的代理，而不是直接预测催化产生活性模式。此外，MM/GBSA结合自由能计算表明，在开放状态下有多种构象在能量上是可访问的，尽管这并不能完全解释实验观察到的区域选择性。总的来说，Grogu的区域选择性不仅来源于差异性结合，还来源于动态通道门控、配体在访问隧道内的特定预组织，以及向活性位点的复合体扩散路径的结合，这些因素共同增加了形成催化产生活性几何结构的概率。总之，这里描述的复合物中观察到底物的方向与实验确定的Grogu的选择性一致。尽管如此，所有底物仍与血红素保持一定距离，这与预催化构象一致。这一观察支持了先前提出的该酶家族中动态底物运输可能在实现最终催化 competent定位中起着关键作用的观点。

3 结论

这项工作提供了关于PabUPO-I Grogu突变体的结构信息和功能见解。这是迄今为止第三种结晶的长时间过氧化物酶，为进一步的基于结构的工程研究开辟了途径。底物高度动态地扩散到血红素位点主要是由疏水相互作用驱动的，多个苯丙氨酸围绕着催化位点的横向扩大部分。晶体学分析与GC/MS分析表明，Grogu可以在亚端位置羟基化线性烷烃和脂肪酸，并且还可以进行过氧化反应生成二醇和酮。对于诺里索普烯类α-离子酮和α-达马斯酮，这种生物催化剂表现出相当的区域选择性，分别针对环或烷基链进行氧化。通过将突出到隧道中的残基或参与催化三脚架的残基置于机器学习引导的定向进化或FuncLib原子设计中（正在进行中），未来可以调节这种生物催化剂的選擇性和特异性[23]。沿着这些思路，利用Grogu、PabUPO-II和AaeUPO作为亲本酶，生成在序列和功能上富集的嵌合体将扩展合成过氧化物酶的种类（正在进行中）[24]。

4 实验部分

化学品：H2O2、N,O-双(三甲基硅基)-三氟乙酰胺（BSTFA）以及底物十四烷、十二烷、肉豆蔻酸、月桂酸、α-离子酮、α-达马斯酮均从Sigma-Aldrich（美国）购买。用于衍生化的吡啶来自Panreac AppliChem（ITW Reagents，美国）。所有化学品和培养基组分均为最高纯度（至少≥97%）。在Pichia pastoris中生产Grogu：Grogu变体被克隆，在 fed-batch生物反应器中生产，并按照先前的方法进行纯化[17]。Grogu及其复合物的结晶和结构测定：为了筛选结晶条件，使用Oryx8机器人（Douglas Instruments）在96孔结晶板（Hampton Research）上测试了几种商业结晶试剂盒。特别是Index、SaltRx和Crystal Screen I&II试剂盒（Hampton Research）以及JBS Classic、JBScreen JCSG++和PACT包（Jena Bioscience）。晶体通过滴蒸气扩散法在18°C下生长。3周后，在20 mM Tris-HCl pH 7.8的缓冲液中获得了Grogu糖基化形式的第一个晶体，浓度为17 mg/mL，然后在2 M硫酸铵、0.1 M Bis-Tris pH 6.5或0.1 M Tris-HCl pH 8.5中生长。这些晶体难以优化且衍射质量较差。之后，测试了新的筛选条件，在K2HPO4 pH 7的缓冲液中，浓度为18 mg/mL的晶体在不同的条件下生长：10%聚乙二醇（PEG）8000、0.1 M MES pH 6.5和0.2 M醋酸锌。这些晶体的最大衍射分辨率达到1.8 ?，但含有众所周知的过氧化物酶抑制剂醋酸锌[10]，它结合在活性位点上。因此，将醋酸锌替换为氯化锌。最佳条件在6–16% PEG 8000、0.1 M MES pH 6.5和0.15 M氯化锌以及蛋白质/缓冲液比例为1.5:1的条件下优化。为了数据收集，晶体先用25% v/v的甘油进行冷冻保护，然后浸入液氮中。衍射数据在ALBA同步加速器（Cerdanyola del Valles，西班牙）的XALOC光束线上收集。数据使用XDS[25]进行积分和缩放，然后使用CCP4包中的AIMLESS程序[26]进行合并。这些晶体属于P65空间群，每个不对称单元包含两个分子（mol/ASU），单元格内含有60%的溶剂。Grogu的结构使用MOLREP[27]和PabUPO-II的坐标（PDB代码：9HE6）通过分子替换法解决。我们精炼的模型成为其余数据集的模板。对于自动刚体精炼，使用了CCP4套件中的REFMAC[28]，并且在计算自由R因子时随机选择了5%的结构因子幅度。然后，使用Coot[29]进行手动精炼和配体的建模，在后续步骤中添加了糖类和水分子，结合更多的限制精炼轮次，得到了补充表S1中报告的最终统计结果。对于复合物结构，底物在99%（v/v）甲醇中溶解。将形成的Grogu晶体浸泡在沉淀剂溶液中，添加20–60 mM的配体1至21小时。由于大多数浸泡实验不成功，因此使用相应配体进行了共结晶，浓度从28至58 mM不等，孵育时间从30至60分钟不等。与之前一样，获得的晶体用25%（v/v）甘油进行冷冻保护，衍射数据在ALBA同步加速器上使用XDSGUI和AIMLESS程序处理。复合物的结构是使用未经取代形式的坐标通过傅里叶合成法解决的。对于十四烷、月桂酸、α-离子酮和α-达马斯酮的复合物，详细信息见补充表S1。通过PDB验证服务器（validate.wwpdb.org）对这些结构进行了验证，然后将坐标和相关结构因子存入PDB。结构图使用PyMOL准备。Grogu及其复合物的原子坐标和结构因子已存入蛋白质数据库（PDB），分配的ID分别为：9RFY（蛋白质）、9RFZ（十四烷）、9RG0（月桂酸）、9RG2（α-达马斯酮）和9RG1（α-离子酮）。酶促反应：实验条件基于之前报道的PabUPO-II实验，具体细节见本文相应的图例[17]。GC/MS分析：所有反应产物通过液-液萃取法回收，使用叔丁基醚（对于烷烃和脂肪酸）或乙酸乙酯（对于α-达马斯酮和α-离子酮）。之后，样品在氮气（N2）气氛下干燥，重新悬浮在100 μL的无水吡啶中，然后用100 μL的BSTFA进行衍生化处理，温度为70°C，时间为30分钟。GC/MS分析使用Shimadzu QP2020系统和SH-Rxi-5 MS熔融石英毛细管柱（30 m x 0.25 mm内径，0.25 μm膜厚）（Shimadzu Japan）进行。烘箱程序从50°C开始（保持1.5分钟），以每分钟30°C的速率升温至90°C（保持2分钟），然后再以每分钟8°C的速率升温至250°C（保持15分钟）。衍生化并过滤后的样品（1 μL）在250°C下以1:10的分流比注入，同时转移管保持300°C。产物鉴定依赖于质谱碎片分析、与Wiley和NIST数据库中的参考光谱进行比较，以及每个化合物的已发布质谱数据（见补充图S3）。

4.1 分子动力学模拟

系统设置：系统的初始坐标取自Grogu的晶体结构。使用半经验程序PropKa v. 3.0.3 [30] 在pH值等于7时确定可滴定残基的质子化状态。质子化分析后，Asp89被确定为质子化状态，His22、His54、His86和His255被确定为在N-ε位置质子化，其余的His残基被确定为在N-δ位置质子化。AMBER参数用于氧铁基化合物I（Cpd I），而参与Fe配位的Cys40的数据取自Cheatham及其同事的研究[31]。蛋白质和水分子参数分别使用AMBER ff14 SB [32]和TIP3P [33]力场进行描述。根据质子化状态，向系统中添加了缺失的氢原子。每个系统都溶解在82 × 76 × 78 ?3的正交水盒子中（蛋白质表面周围有10 ?的缓冲区）。为了中和总的负电荷，向系统中添加了Na+离子。系统准备工作使用AmberTools25包中的tLEAP工具完成[34, 35]。分子动力学模拟：模拟使用OpenMM v.8.2.0作为引擎进行[36]。非键相互作用使用Ewald粒子网格方法计算，短程相互作用的截止距离为10 ?。所有模拟都在NPT（正规化温度-压强）条件下进行。温度使用Langevin恒温器维持在303.15 K，压力使用Montercalo压强计控制为1 atm。积分步长为2 fs。首先进行初始能量最小化以放松起始几何结构，然后逐渐升温，每皮秒升高1 K，直到达到最终温度303.15 K。之后进行0.5 ns的平衡运行。最后进行500 ns的NPT生产运行。为了提高采样效率，收集了四个副本，总时长为1.5 μs。分子动力学轨迹分析：通过追踪从Cpd I Fe4+到通道出口的中心线来表征轨迹的几何结构，该出口由沿着通道排列的最远端残基的Cα原子定义的质心确定。中心线是在预定义的体素化网格上构建的，并重建为沿z轴单调增加的路径，连接Cpd I Fe4+和出口质心。沿着中心线的局部通道半径计算为到任何蛋白质重原子的最短距离。沿轨迹评估了形状描述符，包括迂曲度、瓶颈半径、通道体积和Jaccard距离。此外，还绘制了Met73在整个轨迹中的构象，并根据其与晶体结构中观察到的A和B构象的相似性进行分类。这种分类使用了相对于晶体参考结构的RMSD和χ二面角。最后，根据Met73的构象状态A和B对轨迹进行了分组，并对每个分组进行了通道描述符的主成分分析（PCA）。提取了对应于PCA投影最大值的代表性中心线和蛋白质结构帧，用于结构检查和后续的对接研究。所有分析均在Python v3.12中使用MDTraj v1.11.0、SciPy v1.15.2和NumPy v2.2.6完成。

α-damascone和α-ionone的对接研究：配体构象是使用RDKit v2024.03.6 [37]从它们的SMILES字符串生成的，并进行了几何优化。对接计算使用AutoDock Vina v1.2.7 [38]对每个配体针对从通道形状中提取的三个状态进行。Cpd I的Gasteiger电荷（用于AutoDock）是使用RDKit计算的。搜索空间由一个以Cpd I的氧铁基为中心的20 × 20 × 20 ?3立方体盒子定义。对接参数设置为16的彻底性、10 kcal·mol?1的能量范围、姿态之间的最小RMSD为1.0 ?，以及最多20个姿态。最后在OpenMM中进行了一个放松步骤。结合能使用AmberTools中实现的MM/GBSA方法计算。

补充信息：更多补充信息可在在线的“补充信息”部分找到。

致谢：本工作得到了西班牙项目PID2022-142074OB-I00-RAINBOW、PID2022-136367OB-C33和PID2019-106166RB-I00-OXYWAVE的支持，这些项目由MCIN/AEI/10.13039/501100011033/FEDER资助。Patricia Gomez de Santos感谢西班牙科学与创新部为她提供的Torres Quevedo合同，该合同是作为MCIN/AEI/10.13039/501100011033在NextGenerationEU/PRTR项目下的PTQ2020-011037项目的一部分。我们感谢ALBA（巴塞罗那，西班牙）的同步辐射源在BL13-XALOC光束线方面的帮助。

利益冲突：作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明：研究数据不对外共享。