蜥蜴心脏在遭受冷冻损伤后的再生

《Experimental Physiology》：Regeneration of the lizard heart after cryoinjury

　　**摘要**
蜥蜴以其惊人的组织与器官损伤修复能力而闻名，但关于爬行动物心肌再生的研究却相对较少。在本研究中，我们通过观察豹纹守宫（Eublepharis macularius）的心脏再生过程，填补了传统的变温动物（斑马鱼）和恒温动物（新生小鼠）模型在心肌再生研究中的知识空白。我们在成年蜥蜴的心脏顶端制造了冷冻损伤，并利用光学映射、微计算机断层扫描（microCT）、组织学和免疫组织化学方法，对随后4周内的心肌再生过程进行了评估。光学映射结果显示，在冷冻损伤后的愈合期间，心室外壁存在电活动；而在最初的2周内，受损区域则完全没有电活动。整个心室表面的信号传导功能在冷冻损伤后21天内完全恢复。从形态学上看，第一周心肌细胞活力减弱，第二周心肌组织开始修复，第三周再生过程继续进行，第四周心肌再生完成，心脏功能也得到恢复。总之，豹纹守宫的研究可能为了解不同脊椎动物谱系中心肌修复的共性提供新的见解，有助于揭示心脏再生过程中非缺血性再生机制与缺血性修复机制之间的差异。

**研究的核心问题是什么？** 如蜥蜴这样的羊膜动物在心脏受到冷冻损伤后能否进行自我修复？**主要发现及其意义是什么？** 豹纹守宫这一模型生物能够在4周内修复心肌损伤，并恢复心室的结构和功能。组织学分析表明新心肌组织形成，且其中含有更多具有分裂能力的细胞核。这一发现对于理解哺乳动物心脏修复机制具有重要意义。

**1. 引言**
了解动物修复受损心脏的能力对于改进人类因冠状动脉血流不足导致的心力衰竭治疗具有重要的临床转化价值（Akhmedov & Marín-García, 2013; Laflamme & Murry, 2011; Miyagawa et al., 2002; Urbanek et al., 2005）。除了经典的啮齿类动物模型外，鱼类和两栖动物（尤其是斑马鱼和蝾螈）的心脏再生能力也受到了广泛关注（Bise et al., 2020; Cano-Martínez et al., 2010; de Preux Charles et al., 2016; Marro et al., 2016; Voss et al., 2009）。这些研究揭示了普遍存在的重要细胞内信号传导途径，同时也指出鱼类和两栖动物的再生能力部分源于其较低的新陈代谢速率（Ausoni & Sartore, 2009; Dittrich et al., 2020; Price et al., 2019）。此外，鱼类和两栖动物较低的血压可能使它们对心脏损伤具有更高的耐受力（Jewhurst & McLaughlin, 2016）。因此，研究爬行动物作为心脏再生模型的可能性具有价值，因为它们的血压明显高于哺乳动物（Jensen & Christoffels, 2020）。蜥蜴的典型收缩压范围为40至60毫米汞柱，但这一数值在不同物种间存在较大差异（Schulte et al., 2015）。尽管如此，常用于心脏再生研究的蝾螈收缩压仅为20–30毫米汞柱（Meyer et al., 2022）。从系统发育和代谢角度来看，爬行动物与哺乳动物（包括人类）更为接近（Cherlin, 2024; Modesto & Anderson, 2004），因此有助于发现心肌梗塞或心脏损伤后共同的修复特征和因素。在鳞状爬行动物中已观察到多种再生现象，包括尾巴和四肢的再生（Alibardi, 2009; Jacyniak et al., 2017）、大脑的再生（Austin et al., 2023; López-García et al., 1992）以及心脏的再生（Jacyniak & Vickaryous, 2018）。然而，对于通过实验性心肌坏死诱导的心肌再生机制了解还非常有限。爬行动物的心肌由内部的海绵状层和外部致密层组成（Gregorovicova, 2024; Jensen & Christoffels, 2020），并通过冠状动脉获得良好的氧气供应（Hagensen et al., 2008; Ostadal et al., 1999）。豹纹守宫是一种优秀的爬行动物模型，其整个生命周期内都展现出强大的修复潜力（Hoekstra et al., 2020; Hutchins et al., 2016; Tollis et al., 2015）。它在系统发育上与哺乳动物更为接近（Hedges, 2009），且易于在实验室中饲养。本研究填补了传统变温动物（斑马鱼、蝾螈）（Cano-Martínez et al., 2010; González-Rosa et al., 2017; Jopling et al., 2010）和恒温动物（新生小鼠、大鼠）（Lam & Sadek, 2018; Wang et al., 2020）心肌修复模型之间的知识空白。这种方法有助于揭示所有脊椎动物共有的修复机制特征（Cutie & Huang, 2021; Ja?wińska & Sallin, 2016; Vivien et al., 2016）。

**2. 方法**
**2.1 伦理审批**
所有动物均从捷克共和国的认证 exotic 动物销售商处购买，饲养和运输过程均符合捷克共和国第246/1992号动物保护法规的规定。所有实验均在机构伦理委员会批准（批准编号8615/2019-MZE-17214，许可证编号CZ 02470）下进行。研究者理解本期刊的伦理准则，其工作符合期刊的动物伦理检查清单。

**2.2 动物**
28只成年雌性豹纹守宫（Eublepharis macularius，体重30–60克，年龄超过9个月）被分别饲养在查尔斯大学第一医学院解剖学研究所和奥胡斯大学动物生理学系的玻璃饲养箱中（尺寸20 × 40 × 20厘米），环境温度为28°C，湿度为50–70%，光照周期为12:12小时。每天对动物进行监测，避免它们相互接触以减少压力。同性动物确保统计样本的代表性。实验开始前，动物至少适应环境1个月。每周喂食一次蟋蟀，并补充钙和维生素，同时 providing 自由饮水的条件。根据实验设计，将动物随机分为五组：对照组和四个不同愈合间隔组（冷冻损伤后7天、14天、21天和28天）。对照组动物在适应环境1个月后进行安乐死。其他愈合间隔组的动物则适应环境至少1个月后进行手术，术后3天开始进食。除了7天愈合间隔组外，其他组的动物每周喂食一次。在特定愈合间隔结束后，使用异氟烷（10毫克/毫升）和阿法克森（alfaxan，10毫克/毫升）麻醉动物，并按照捷克共和国动物保护法规（批准编号8615/2019-MZE-17214，许可证编号CZ 02470）过量注射戊巴比妥（400毫克/毫升）处死动物。

**2.3 冷冻损伤的手术过程**
冷冻损伤在全身麻醉（异氟烷吸入）下按照标准流程进行（Sladky & Mans, 2012）。麻醉后的蜥蜴被放置在加热垫上（28°C），通过4–5%的异氟烷进行5–15分钟的通气，随后浓度降至1–2.5%。整个手术过程约持续30分钟。在麻醉过程中，通过肌肉注射0.2毫克/千克的美洛昔康（Meloxicam: Metacam inject. a.u.v., BASF Ingelheim am Rhein, Germany）进行镇痛。麻醉时间不超过60分钟。通过用镊子按压蜥蜴的尾巴和前肢来检查麻醉深度。打开左侧第五肋间区域的胸部以接触心包。使用CryoPen? M（H&O Equipments Ath, Belgium）冷冻工具和直径1–3毫米的微注射器，在心室顶端瞬时喷射氮氧化物（N2O）造成损伤（0.5秒）。心肌迅速冻结后，使用不可吸收的缝合线（Marpolen blau 6/0 2× DRT 12 Catgut GmbH, Markneukirchen, Germany）进行缝合。选择心室顶端是因为该区域对心脏收缩的方向（从顶端到底部）至关重要，这一特征在所有脊椎动物中均存在（Jensen et al., 2012）。此外，心室顶端易于定位，且冷冻损伤的变异性较低。当动物自主呼吸恢复时，停止使用异氟烷并拔除气管插管。随后再观察动物2小时，确保其完全从麻醉中恢复。由于麻醉可能会干扰实验结果，动物在麻醉后1周内不再给予额外镇痛。手术前1周最后一次喂食，术后3天开始进食。所有动物在实验后均表现出正常的捕猎行为。选择7天愈合间隔是因为此时蜥蜴体内麻醉剂已基本清除，可防止它们术后呕吐食物。作为对照组，选取了5只未经处理的蜥蜴。具体的愈合间隔为7天（n=6）、14天（n=6）、21天（n=6）和28天（n=5）（见表1）。心脏采样首先通过光学映射进行，随后进行形态学处理。在冷冻损伤前后以及对愈合间隔结束时均对动物称重，以获取有关特定愈合期间体重变化的信息。对照组动物在实验前1周和采样当天均被称重。

**2.4 光学映射**
在28°C条件下，使用不含乳酸的Ringer溶液进行体外光学映射（Jensen et al., 2012; Kvasilova et al., 2020）。将心脏从胸腔取出并去除心包。随后将电压敏感染料di-4-ANNEPS（Biota, 商品编号61010 Biotium Inc, Fremont, CA, USA）以60微升/毫升的浓度（1.25毫克/毫升溶于二甲基亚砜）加入1毫升Ringer溶液中，冰敷10分钟。染色完成后，用冰冷的Ringer溶液冲洗心脏，并将其固定在硅胶衬里的培养皿中，使用ULTIMA L相机和THT显微镜（均由Brain Vision, Tokyo, Japan提供）进行成像。光学映射过程中，通过加热器将培养皿温度升至28°C。心脏未经逆向灌流，而是使用含氧量高的培养液，因此不会发生缺氧。该系统配备了LEX3 LED光源（Brain Vision），提供高强度和稳定的照明（Olejnickova & Sedmera, 2020）。信号传导活动从心脏的腹侧和背侧两侧同时记录，时间分辨率为4、8和16毫秒。生成心室外壁的电激活图谱，并使用BV_Ana软件（SciMedia, Brain Vision）分析心室外壁的电激活时间、心率以及房室传导延迟（AVd）。选择AVd作为分析指标，是因为它能够反映心脏收缩的协调性，而鳞状爬行动物没有典型的His–Purkinje传导系统（Gregorovicova et al., 2018）。AV间隔受自主神经调节的影响显著，我们在变温动物中也证明了其作为测量参数的有效性（Olejnickova et al., 2021）。光学映射后，心脏在4%的福尔马林溶液中固定24小时（4°C），然后用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗两次，最后储存在70%的乙醇中（4°C）或直接用Dent固定剂（20%二甲基亚砜溶于甲醇）中固定24小时（4°C）。根据实验需要，将心脏随机分为两组，一组进行微计算机断层扫描（microCT，n=10），另一组进行组织学检查（n=10，见表1）。

**2.5 微计算机断层扫描（microCT）**
使用SkyScan 1272（Bruker micro-CT, Kontich, Belgium）对9只动物的心脏进行微计算机断层扫描。扫描前，根据Metscher（2009）的方法用磷酸钨酸对样本进行X射线造影。扫描参数的设置是根据样本的大小和对比组织的X射线密度来决定的。像素大小在10到20微米之间，源电压为60-90千伏，源电流为111-166毫安，旋转步长为0.4，使用的滤光片为Al 1毫米或Al 0.5毫米+Cu 0.038毫米，旋转角度为180度。投影图像使用NRecon软件（Bruker）进行重建。横截面图像用于2D和3D可视化（DataViewer，CTVox；Bruker）。

2.6 组织学和免疫组织化学

在光学成像之后，首先使用安装在Olympus SZX12解剖显微镜上的Olympus DP71相机进行宏观摄影记录，然后进行石蜡包埋处理。样品在正面以8微米的层厚连续切片，以便进行进一步的组织学和免疫组织化学分析。通过组织学染色评估了心肌小梁结构的形态变化、疤痕形成、修复的组织以及纤维组织的程度。具体来说，使用Alcian blue与hematoxylin和eosin染色进行全貌描述，使用Picrosirius Red（PSR）标准胶原染色来表征纤维化。为了研究心肌分化变化，按照先前使用的方案（Olejnickova等人，2021年）进行了心肌标记物（肌球蛋白重链；MF20，DSHB Iowa，IA，美国，分类号AB2147781104；Helsby等人，2014年）的免疫组织化学染色。为了检测心肌细胞的增殖，使用了增殖细胞核抗原（PCNA），并在透射光或荧光光下进行检测。PCNA（Dako M0879，Santa Clara，CA，美国）以1:100的稀释度处理过夜，然后用山羊抗鼠IgG抗体Cy5（JIRL West Grove，PA，美国，115-175-146）以1:200的稀释度处理90分钟，接着使用小麦胚芽凝集素（WGA；Thermo Fisher Scientific，W11261，Waltham，MA，美国）以1:50的稀释度处理60分钟，最后使用4’，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI；BioVision B1098，abcam，剑桥，英国；稀释度1:1000）进行荧光染色观察。切片在装有Olympus DP80 CCD相机的Olympus BX51显微镜下在透射光下进行分析，并使用共聚焦显微镜（Olympus BX61与FluoView系统和Leica Stellaris 5）进行荧光染色分析。使用ImageJ软件（NIH，Bethesda，MD，美国）对组织学和免疫组织化学染色结果进行分析，重点关注整个左心室损伤区域（7、14、21、28天）中明场下的纤维化面积百分比以及偏振光下的情况（Sedmera等人，2024年）。同样的方法也被用于心肌细胞数量的分析：使用40倍物镜在可见光下观察横截面面积，并使用ImageJ软件进行分析。冷冻损伤区域的边界是根据PSR染色和Alcian blue与hematoxylin和eosin染色来定义的。

2.7 统计分析

光学成像的统计分析遵循Hothorn等人（2008年）提出的具有鲁棒异方差性的线性模型，使用R语言中的multcomp软件包，统计显著性水平P < 0.05。图表使用GraphPad Prism版本8.0.2（GraphPad Software Inc.，San Diego，CA，美国）计算。单因素ANOVA用于PSR分析，统计显著性水平P < 0.05。重量变化在Prism版本8.0.2中以冰冻损伤前后的百分比差异形式进行分析，并使用Student's t-test进行检验。数值以平均值±标准差的形式报告。

3 结果

光学成像期间的基线心率约为每分钟40±9次（bpm）（图1a），对应的AVd为250±51毫秒。对照组心脏的心率为40±6 bpm，AVd较长（平均=362±52毫秒）（图1b）。在愈合期间，最快的房室传导发生在14天时（P = 0.0009）。在28天的愈合过程中，冷冻损伤对心率（P = 0.851）或心室心外膜激活时间（P = 0.891）没有显著影响。对照组（n = 5）和特定恢复区间内的AVd存在差异（P = 0.002）。冷冻损伤在损伤后14天导致体重显著下降（P = 0.048），下降了1.5克，占初始质量的2.6%（图1c）。

图1：冷冻损伤后Eublepharis macularius变化的纵向特征。（a）愈合期间的体外心率。（b）房室延迟。（c）体重变化。冷冻损伤在28天的愈合过程中对心率（a）没有显著影响。最快的房室传导发生在14天时（b）。冷冻损伤在损伤后14天导致体重显著下降1.5克（占初始质量的2.6%；c）。正值表示体重增加（%），负值表示体重减少（%）。数值以平均值±标准差的形式表示。此外，光学成像时间进程显示在28天的愈合期间心室内的信号传播存在差异。信号从心脏底部向顶端扩散，在7天和14天时，冷冻损伤区域的顶端没有光学信号（黑色区域，图2a）。然而，在损伤后21天和28天，整个心室表面的信号传播功能得到了恢复。与此功能恢复一致，微CT检查显示在21天和28天内冷冻损伤组织发生了再生（图2b）。

图2：冷冻损伤恢复的时间进程。（a）成年雌性Eublepharis macularius心脏的光学成像。一系列腹侧视图，冷冻损伤发生在顶端区域（白色椭圆）。在冷冻损伤后7天和28天的心脏在相同的放大倍数下进行成像，但由于动物及其心脏较小，因此图像也相应较小。映射区域为1×1厘米。橙色星号表示第一次激活的心外膜区域；橙色箭头显示信号在心室外膜表面的传播方向。激活图以等时线轮廓表示，每种颜色带对应4毫秒的时间间隔；白色点表示冷冻损伤顶端区域组织中的信号缺失。在28天的愈合期间，信号在心室内的传播过程有所不同。信号从心脏底部向顶端扩散，在7天和14天时，冷冻损伤区域的顶端没有光学信号。在损伤后21天和28天，整个心室表面的信号传播功能得到了恢复。（b）成年Eublepharis macularius心脏在愈合期间的微CT图像。微CT检查显示在21天和28天内冷冻损伤组织发生了再生，与光学成像和组织学结果一致。黄色椭圆表示顶端区域；白色点（多边形和椭圆）表示冷冻损伤区域。AVV表示房室瓣；LA表示左心房；OFT表示流出道；RA表示右心房；V表示心室。健康豹纹守宫的心肌主要是小梁状的，但也有一层明显的致密层（图3）。在愈合期间，与健康的完整对照组相比，观察到心室左端冷冻损伤组织的变化。使用Alcian blue与hematoxylin和eosin（AB/H+E）的全面染色显示不同阶段疤痕和纤维组织形成的巨大差异（图3a,b）。具体来说，在7天时观察到心外膜的分离和膨胀，以及心外膜激活的迹象（例如，心外膜增厚，皮下空间增加，细胞外基质增加）。在14天时，致密层和小梁的坏死和降解更为明显。内部（小梁）心肌与位于心外膜下的外部心肌层之间的空间充满了血液。疤痕的直径比7天时更大，但也观察到了新血管和心肌的形成。在21天时，伤口关闭，与14天相比伤口区域缩小。在28天时，疤痕在4周的愈合后几乎被吸收，但致密壁层有所增厚。小梁和致密层得到了再生，这也从PSR染色中显现出来，表明多余胶原被吸收（图3c）。

图3：Eublepharis macularius愈合期间的组织学和免疫组织化学变化示意图。（a,b）蓝色：Alcian blue，纤维组织；粉色：eosin，肌肉；紫色/棕色：hematoxylin，细胞核。使用Alcian blue与hematoxylin和eosin的全面染色显示不同阶段疤痕和纤维组织形成的巨大差异。在7天时观察到心外膜的分离和膨胀，以及心外膜的激活。在14天时，坏死和致密层及小梁的降解更为明显。在21天时，伤口比14天时更小，疤痕更加致密，有大量的新心肌组织和血管。在28天时，疤痕在4周的愈合周期后几乎被吸收，但致密壁层有所增厚。（a）中的黄色椭圆表示冷冻损伤的目标区域；（a）中的黄色虚线椭圆表示冷冻损伤区域。（c）红色：Picrosirius Red，胶原纤维（疤痕组织）；黄色：肌肉。在所有恢复期间都检测到纤维组织（红色），但在28天时观察到小梁和致密层的恢复，类似于对照组。冷冻损伤区域的面积约为心脏总面积的5%，其中14天时的损伤范围最大（约为总面积的8%）。在21天时，冷冻损伤区域充满了纤维组织，但少于7天和14天时。在28天时，损伤范围仅占总心脏表面的2%。PCNA在S期细胞的细胞核中表达，用作细胞增殖标志物（Sedmera & Thompson，2011），在荧光光和透射光下进行检测。在愈合期间，PCNA在冷冻损伤区域被清晰地检测到（图4a,b）。在7天和21天时观察到最活跃的增殖细胞数量最多（图5）。在14天时观察到组织降解，此时冷冻损伤后的坏死处于最高阶段，但也开始了新组织的形成。因此，这个阶段的增殖细胞数量较少。在28天时，冷冻损伤部位几乎没有增殖细胞，组织与对照组几乎无法区分。总的来说，增殖细胞数量在7天和21天时最多。在14天时，增殖心肌细胞的数量最少。在28天时，增殖细胞的数量几乎降至对照组水平。

图4：Eublepharis macularius愈合期间的免疫组织化学变化示意图。（a, b）荧光光下的PCNA。紫色：PCNA阳性；绿色：细胞膜；蓝色：细胞核。在愈合期间，PCNA在冷冻损伤区域被清晰地检测到（a, b）。在7天和21天时观察到最活跃的增殖细胞数量最多（图5中有图表说明）。在14天时观察到组织降解，因此增殖细胞的数量低于前述阶段。在28天时，冷冻损伤部位几乎没有增殖细胞，组织与对照组无法区分。（c）红色：MF20，肌肉；绿色：WGA，纤维组织（疤痕）；蓝色：Hoechst/DAPI，细胞核。MF20染色清楚地显示了7天时肌肉和膜的降解，表明发生了坏死。在14天时观察到小梁的恢复以及从心外膜心肌中萌芽的新心肌细胞。在21天时，心外膜和心外膜仍处于激活状态。新的小梁和致密层组织显示出这两个心肌部分的良好分化。28天时疤痕区域的组织学外观显示其恢复到了类似健康动物的状态，唯一的区别是损伤后致密层的组织变厚以及疤痕残留物。在所有波长下具有明亮荧光的对象是含有细胞核的红细胞。图5：在图示查看器或PowerPoint中打开。

Eublepharis macularius冷冻损伤组织中的纤维化（a）和胶原蛋白（b）的含量。(a) 在14天时，疤痕中的纤维化组织最为广泛。与对照组相比，28天时的纤维化程度有所减少。(b) 7天时的胶原蛋白含量显著较低，而在14天时则高于对照组。 hearts，n = 10；每个心脏的切片数量为3个。使用Picrosirius Red进行染色。放大倍数×40。数值为平均值±标准差。红色：纤维化组织；绿色：肌肉；黄色：其他组织。为了研究心肌分化的变化，应用了心肌标志物肌球蛋白重链（MF20）的免疫组化染色（图4c）。MF20染色并用小麦胚芽凝集素（WGA）进行复染，后者可以标记外膜和内膜，显示出心肌小梁和致密层的再生过程。在7天时，明显观察到肌肉坏死和膜降解。在14天时，小梁的恢复以及新的心肌细胞从心外膜下的心肌中生长出来。心外膜和心肌之间的空间被血液填充。在21天时，心外膜和心外膜下层仍然活跃。心肌和心外膜之间的膨胀有所减轻。新的小梁和致密层的组织显示出这两个心肌区域的良好分化（图4c）。28天时，疤痕区域的组织学表现与对照组（健康动物）相似，但致密层的组织由于损伤而更厚。使用PSR检测冷冻损伤组织中的纤维化（图5），在各个阶段的差异显著（P = 0.015）。14天时，疤痕中的纤维化组织最为广泛（P = 0.0003；图5a）。损伤组织中的纤维化程度在14天时增加（比对照组高17倍），然后在愈合期间逐渐减少。28天时，纤维化程度减少到对照组的5.5倍（P = 0.0019；图5a）。7天时的胶原蛋白含量显著较低（P = 0.04），而在14天时则高于对照组（P = 0.015；图5b）。在心肌细胞数量方面，各阶段之间存在显著差异（P = 0.0018，数据未显示），其中对照组与7天时有最大的差异（P = 0.0074）。7天时的心肌细胞数量大约是对照组的一半。对照组与28天时的心肌细胞数量没有差异。冷冻损伤区域的面积大约占心脏总面积的5%，其中14天时受伤区域扩展最大（约占总表面积的8%）。

4. 讨论

我们的研究表明，豹纹守宫（Eublepharis macularius）的心脏在冷冻损伤后几周内可以再生。这些发现与关于该物种大脑和尾巴具有巨大愈合潜力的报道相符（Austin等人，2023；Jacyniak等人，2017）。此外，产后豹纹守宫的心脏中心肌细胞持续增殖（Jacyniak & Vickaryous，2018），这对于爬行动物受伤后的心脏愈合非常重要。心肌再生已经得到了深入研究（Kikuchi & Poss，2012；Laflamme & Murry，2011），一些鱼类和两栖动物的大再生能力为研究其潜在的细胞和分子机制提供了有趣的动物模型（Jewhurst & McLaughlin，2016）。然而，这些物种的血压相对较低，这可能赋予它们对心血管功能受损的异常高耐受性和恢复期的额外保护（González-Rosa等人，2017）。因此，我们考虑研究血压较高且心室结构更紧凑的爬行动物是否也具有再生能力。因此，爬行动物不仅是因其与哺乳动物的进化亲缘关系（Hedges，2009）而重要，还因为它们具有发达的小梁和致密层（Gregorovicova等人，2022）、较高的血压（Galli等人，2006）以及代谢率（Kikuchi & Poss，2012）。因此，它们的心脏更接近哺乳动物的心脏。因此，我们选择了豹纹守宫（Eublepharis macularius；Agarwal等人，2022）作为研究对象，因为它具有强大的再生能力和易于护理的特点。豹纹守宫心脏在冷冻损伤后的再生过程始于心外膜膨胀和心肌活力的丧失。位于心外膜下的外层心肌参与了小梁和致密心肌的恢复，这与蝾螈的研究结果相似（Piatkowski等人，2013）。经过4周的愈合期后，新的心肌完全具有活力和功能性（图2），几乎看不到疤痕。关键问题是纤维化是如何形成的（Furtado等人，2016）。爬行动物的心脏纤维化发展、疤痕形成和吸收过程尚未得到充分描述。纤维化是由氧化应激或炎症等过程引起的，这些也会在心脏损伤后发生（Castillo-Casas等人，2023a，2023b；Tsutsui等人，2011）。因此，这项研究还关注疤痕发展和吸收的时间方面。此外，在心外膜层中观察到的纤维组织存在是正常的健康状态，不仅在胚胎中如此（Quijada等人，2020），也在出生后的脊椎动物心脏中发现（Uscategui Calderon等人，2023）。更重要的是，纤维组织在受伤区域向心室肌肉中的穿壁扩展（Quijada等人，2019），正如我们在受伤心脏中观察到的那样。爬行动物心脏愈合的下一步是疤痕重塑，此时细胞外基质被降解，并由具有适当血管供应的心肌组织替代。这些观察结果与免疫反应的成功协调一致，与心脏组织中的再生过程共同作用（Lafuse等人，2020）。这应该是未来的研究方向。豹纹守宫在4周后显示出与对照组相似的心肌组织结构和架构。此外，蜥蜴在整个愈合期间几乎不形成纤维化疤痕。这些发现与斑马鱼的发现一致，斑马鱼的疤痕组织在60天后消失（Bise等人，2020），但似乎守宫的愈合速度更快。这可能归因于它们较高的代谢率和体温，表明蜥蜴可以作为能够无纤维化疤痕愈合的成年羊膜类脊椎动物的例子（Lam & Sadek，2018；Wang等人，2020）。此外，我们预测在4周的再生期后，纤维化会恢复到对照组的水平。众所周知，哺乳动物的成年心脏肌肉愈合后会留下永久性的纤维疤痕（Weinberger & Riley，2024）。在这里，成年豹纹守宫的雌性能够修复其冷冻损伤的心室。此外，还有证据表明豹纹守宫的心肌细胞即使在成年后也会增殖（Jacyniak等人，2025）。在我们的工作中，还观察到冷冻损伤区域附近的心肌细胞具有高增殖活性。我们表明，爬行动物心肌细胞的内在增殖能力是损伤后心肌组织恢复的基础。在冷冻损伤的豹纹守宫中，房室传导时间（AVd）比对照组短。短AVd是鸟类和哺乳动物的典型特征，但不是爬行动物的特征（Anderson等人，2018），后者的心率通常较低。这样的观察可能导致对压力反应的不同（Olejnickova等人，2021）或心律失常（Chi等人，2008）。AVd定义为心房和心室激活之间的时间（Dreifus等人，1971）。因此，较短的AVd使得心房和心室之间的信号传递更快，因此可能与压力反应和增强的交感神经张力及正性变力作用有关（Olejnickova等人，2021）。代谢及其速率是心脏再生中的其他重要因素（Gut等人，2017；Kikuchi等人，2012；Tzahor & Poss，2017）。然而，关于爬行动物中这些过程的了解还很少。此外，雄性和雌性在心脏再生过程中的激素-代谢影响可能存在差异（Khaire等人，2021；Li等人，2025）。通过爬行动物模型揭示心肌愈合机制对于进化发育学具有重要意义。此外，这也是一个基本的进化问题，有助于了解组织在损伤后恢复功能的一般能力（Castillo-Casas等人，2023a；Huang等人，2024）。实际上，爬行动物是一个桥梁物种，可以更好地理解心脏再生过程，并可能将知识应用于哺乳动物，因为它们与斑马鱼或两栖动物有更密切的亲缘关系（Hedges，2009）。这样的研究有助于更精确地揭示阻碍哺乳动物受损心肌再生的心脏阻滞机制。总之，豹纹守宫在4周内可以修复心肌损伤，恢复心室结构和功能，我们的组织学分析表明形成了新的心肌，PCNA染色显示更多的细胞周期核。豹纹守宫提供了一个无替代纤维化的羊膜类模型，有助于理解心脏再生过程，并可能为理解不同脊椎动物谱系中的心肌愈合提供重要新见解。

4.1 研究局限性

研究的局限性在于依赖于体外监测的心脏，这意味着它与自主神经系统和其他重要系统没有连接，不像在完整 organism 中的情况。此外，冷冻损伤与冠状动脉阻塞的损伤过程不同，后者是后续研究的下一步，并且需要在心脏损伤后4周继续观察。另一个研究局限性可能在于所使用的豹纹守宫的性别。我们仅使用了雌性，因为雄性和雌性在心脏再生过程中的激素-代谢影响可能存在差异。因此，我们仅对雌性进行实验，以减少可能影响心脏再生的激素-代谢变异性。

作者贡献：

Martina Gregorovicova：概念化；数据管理；正式分析；研究调查；手稿编辑；方法论；项目管理；监督；验证；可视化；撰写初稿。
Barbora Sankova：研究调查；验证。
Martin Bartos：方法论；验证；可视化。
Bjarke Jensen：手稿编辑。
Tobias Wang：手稿编辑。
David Sedmera：资金获取，手稿编辑。
所有作者都阅读并批准了本手稿的最终版本，并同意对工作的所有方面负责，确保与工作准确性或完整性相关的问题得到适当调查和解决。所有被指定为作者的人都符合作者资格，所有符合作者资格的人都被列在名单上。

致谢：

我们想感谢Heidi Meldgaard Jensen在实验动物方面提供的技术支持，以及Jarmila Svatunkova、Blanka Topinkova、Kristyna Neffeova、Eva Nekvindova、Alena Kvasilova、Hana Kolesova、Aneta Jerabkova和Lukas Lacina在实验室和共聚焦显微镜使用方面的协助。我们还要感谢Matej Nekvinda在统计方面的帮助。

利益冲突：

作者声明他们没有利益冲突。

数据可用性声明：

所有数据可作为支持信息提供给相应的作者。