《Journal of Equine Veterinary Science》：Molecular detection of pathogenic Leptospira spp. in mares with reproductive disorders enrolled in embryo transfer programs
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古斯塔沃·德·奥利维拉·阿尔维斯·平托（Gustavo de Oliveira Alves Pinto）|埃杜阿尔达·法里亚·雷蒙多（Eduarda Faria Raymundo）|加布里埃拉·贡萨尔维斯·达·席尔瓦（Gabriela Gon?alves da Silva）|安德
古斯塔沃·德·奥利维拉·阿尔维斯·平托（Gustavo de Oliveira Alves Pinto）|埃杜阿尔达·法里亚·雷蒙多（Eduarda Faria Raymundo）|加布里埃拉·贡萨尔维斯·达·席尔瓦（Gabriela Gon?alves da Silva）|安德烈·德·索萨·桑托斯（André de Souza Santos）|德博拉·席尔维里奥·科雷亚（Dhebora Silvério Correia）|加布里埃拉·雷伊斯·泽维尔（Gabriela Reis Xavier）|埃里卡·费尔南达·托雷斯·萨米科-费尔南德斯（Erika Fernanda Torres Samico-Fernandes）|古斯塔沃·费雷尔·卡内罗（Gustavo Ferrer Carneiro）|玛丽亚·伊莎贝尔·诺盖拉·迪·阿泽维多（Maria Isabel Nogueira Di Azevedo）|里纳尔多·阿佩里西多·莫塔（Rinaldo Aparecido Mota）
巴西伯南布哥联邦农村大学传染病实验室（Laboratory of Infectious Diseases, LDIC），累西腓（Recife）
摘要
背景
马生殖道钩端螺旋体病（Equine genital leptospirosis, EGL）与母马的繁殖障碍有关。然而，该病在胚胎移植（Embryo Transfer, ET）项目中的发生情况仍知之甚少。
目的/目标
鉴于关于参与胚胎移植项目的母马中钩端螺旋体（Leptospira）种类分布的数据稀缺，本研究旨在调查巴西13家专门从事胚胎移植的种马场的具有繁殖障碍历史母马中钩端螺旋体属（Leptospira）的血清学和分子学感染情况。
方法
从70匹未接种疫苗的母马中收集血清和子宫内膜细胞刷样本（Serum and endometrial cytobrush samples, ECS）。血清学分析采用显微镜凝集试验（Microscopic Agglutination Test, MAT），分子检测则通过针对lipL32基因的PCR进行。阳性样本进行了测序。
结果
在MAT检测中，68.6%（48/70；95%置信区间：56.9–78.2%）的母马表现出≥1:100的滴度反应。PCR在45.7%（32/70；95%置信区间：34.5–57.4%）的ECS样本中检测到致病性钩端螺旋体DNA，其中92.3%（12/13）的农场至少有一匹母马呈阳性。对一个样本的测序显示其与Leptospira interrogans的核苷酸同源性≥99%。功能分类与PCR阳性结果显著相关，接受胚胎移植的母马比供体母马的检出率更高（比值比=3.15；95%置信区间：1.05–9.43；p=0.040）。
结论
这些发现表明，患有繁殖障碍的母马的生殖道存在高血清学暴露和分子学感染证据，强调了在参与胚胎移植项目的繁殖群体中进行分子学研究的重要性。
引言
引言
马生殖道钩端螺旋体病（EGL）被认为是钩端螺旋体病的生殖系统表现形式，主要与母马生殖道中Leptospira interrogans的存在相关。感染通常呈亚临床过程，没有典型的临床症状，主要表现为繁殖障碍，包括胚胎死亡、流产、胎盘炎或产下弱仔[[1], [2], [3]]。钩端螺旋体属（Leptospira）在马群中的存在可能会影响繁殖效率，导致生产力损失，特别是在依赖高繁殖性能的系统中[4,5]。在胚胎移植（ET）项目中，影响供体和受体母马生殖道的亚临床感染可能会干扰妊娠的建立和维持，这进一步强调了这些系统中卫生监测的重要性[6]。世界动物卫生组织（World Organisation for Animal Health, WOAH）推荐使用显微镜凝集试验（MAT）进行钩端螺旋体病的血清学诊断，并将其视为金标准。然而，在EGL病例中，由于感染通常是慢性和亚临床的，从生殖道获得的样本进行分子分析可能具有更高的敏感性[2]。
在巴西进行的分子研究表明，在繁殖性能不佳的母马生殖道样本中发现了致病性Leptospira interrogans，这加强了EGL作为一种具有临床意义的疾病的认识[7]。尽管这种感染对动物生产有潜在影响，但针对参与胚胎移植项目的母马生殖道中钩端螺旋体属检测的研究仍然很少，导致关于该病原体发生和作用的知识存在重要空白。因此，本研究旨在对巴西东北部伯南布哥州参与胚胎移植项目的具有繁殖障碍历史的母马进行血清学和分子学调查。
章节摘录
采样
本研究获得了伯南布哥联邦农村大学（UFRPE）动物使用伦理委员会的批准（批准号8729270624），采样时间在4月至9月之间，共包括来自伯南布哥13家马胚胎移植农场的70匹未怀孕母马。农场的选择基于便利性和农场主参与意愿。采样时未对发情周期阶段进行标准化。
显微镜凝集试验根据WOAH的建议[11]，使用显微镜凝集试验（MAT）对钩端螺旋体属（Leptospira）进行血清学检测。血清样本以1:100的稀释度与32个血清型进行反应：Australis、Bratislava、Autumnalis、Butembo、Castellonis、Celledoni、Bataviae、Canicola、Djasiman、Guaricurus、Cynopteri、Grippotyphosa、Hebdomadis、Copenhageni、Icterohaemorrhagiae、Javanica、Louisiana、Mini、Panamá、RGA、Pomona、Pyrogenes、Hardjobovis、Hardjoprajitno、Wolffi、Whitcombi、Shermani。
统计分析进行了描述性统计分析，以计算结果的绝对和相对频率。为确定与母马生殖道中抗钩端螺旋体抗体和钩端螺旋体DNA存在相关的因素，使用年龄、功能分类和繁殖障碍类型作为解释变量进行了单变量分析。根据列联表中的预期频率，采用了皮尔逊卡方检验或费舍尔精确检验。
结果共评估了70匹参与胚胎移植项目的母马，其中22匹（31.4%）为供体，48匹（68.6%）为受体。按年龄划分，12.9%（9/70）被视为年轻母马，64.3%（45/70）为成年母马，22.9%（16/70）为老年母马。在繁殖障碍方面，34.3%（24/70）的母马发生过流产，61.4%（43/70）有胚胎死亡史，4.3%（3/70）产下早产仔马。个体动物数据见补充材料表S1。
本研究表明，在参与胚胎移植项目的具有繁殖障碍的母马中，观察到高血清反应性和钩端螺旋体DNA的检测。68.6%的血清反应性动物以及45.7%的母马中检测到钩端螺旋体DNA，表明这些母马的生殖道存在感染分子证据。此外，所有采样农场都开展胚胎移植项目，且92.3%的农场至少有一匹PCR阳性母马，这一点尤为重要。
因此，本研究结果表明，在参与胚胎移植项目的母马的繁殖障碍鉴别诊断中应考虑EGL。在ECS中高频率检测到lipL32基因，突显了对生殖道进行针对性卫生监测作为传统血清学筛查的补充策略的重要性。此外，本研究提供了钩端螺旋体存在的分子学证据。
CRediT作者贡献声明古斯塔沃·德·奥利维拉·阿尔维斯·平托（Gustavo de Oliveira Alves Pinto）：撰写——审稿与编辑，撰写——原始草案，方法学设计。埃杜阿尔达·法里亚·雷蒙多（Eduarda Faria Raymundo）：撰写——审稿与编辑，方法学设计。加布里埃拉·贡萨尔维斯·达·席尔瓦（Gabriela Gon?alves da Silva）：撰写——审稿与编辑，方法学设计。安德烈·德·索萨·桑托斯（André de Souza Santos）：撰写——审稿与编辑，方法学设计。德博拉·席尔维里奥·科雷亚（Dhebora Silvério Correia）：撰写——审稿与编辑，方法学设计。加布里埃拉·雷伊斯·泽维尔（Gabriela Reis Xavier）：方法学设计。埃里卡·费尔南达·托雷斯·萨米科-费尔南德斯（Erika Fernanda Torres Samico-Fernandes）：撰写——审稿与编辑，可视化设计。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢作者感谢分子生物学实验室（LabMol/Nubiotec–UFRPE）和多用户基因组学和蛋白质组学平台（CB/UFPE）提供设施和技术支持。G.O.A.P.、D.S.C.和G.R.X.是巴西高级人员培训协调委员会（Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES）的成员，E.F.R.是巴西伯南布哥州科学技术支持基金会（Funda??o de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco, FACEPE）的成员。
本研究得到了国家科学研究所的支持
