浮游动物多样性及其在挪威牡蛎养殖中传播双壳类寄生虫Marteilia pararefringens过程中的潜在作用

《Journal of Invertebrate Pathology》：Zooplankton diversity and their potential role in transmission of the bivalve parasite Marteilia pararefringens in Norwegian oyster polls

　　Mats B?gwald | Elizaveta Ershova-Menze | Monica Bente Martinussen | Tone Falkenhaug | Stein Mortensen
挪威卑尔根海洋研究所

**摘要**
Marteilia pararefringens是一种可能对贻贝（Mytilus spp.）造成致命危害的寄生虫，世界动物卫生组织（WOAH）已将其列为需要关注的对象，因为它对野生和养殖贻贝种群都有负面影响。由于该寄生虫的生命周期尚不清楚，这阻碍了对其的有效管理。Marteilia pararefringens于2016年首次在挪威被发现，主要出现在被称为“polls”的小型、半封闭的温暖河口区域，这些地方寄生虫数量通常很高。“polls”是一种独特的生态系统，但在动物浮游生物多样性研究方面相对较少。Marteilia pararefringens在这些区域的存在为研究其自然生命周期以及提供全面的动物浮游生物群落数据提供了独特的机会。在这项研究中，我们结合使用了传统立体显微镜技术和高通量DNA测序方法来解析动物浮游生物的群落结构。这种综合方法成功克服了与河口环境相关的隐秘分类单元和幼虫阶段鉴定难题，证实了这些区域具有独特的物种组成，但浮游生物多样性较低。随后，通过对27个地点的分类样本进行针对Marteilia pararefringens的PCR检测，发现了几种潜在的中间宿主。桡足类Paracartia grani和Acartia margalefi是最常检测出该寄生虫的物种。P. grani的普遍性和丰度与Marteilia pararefringens的存在密切相关。此外，还在Oithona nana的分类样本以及底栖十足类（Athanas nitescens和Carcinus maenas）和Musculus subpictus的浮游幼体中检测到了寄生虫DNA。这些发现为确定Marteilia pararefringens在其最北端的分布范围内的潜在中间宿主提供了首次证据，并将为进一步研究其复杂的生命周期奠定基础。

**1. 引言**
挪威崎岖海岸线内的峡湾中存在着独特的河口池塘系统，称为“polls”——这些池塘面积小于50公顷、水深小于20米，通过狭窄的水道与海水交换受限。有些地点完全与正常潮汐流动隔绝，仅在春季高潮或风暴潮时才会接收到新鲜海水（Gaarder和Bjerkan, 1934）。如果这些地点受到足够的风防护，并且有足够的淡水流入，就会在较浓的咸水层之上形成一层半咸水。这些因素加上太阳能加热效应，会产生温室效应，使水温远高于周边峡湾水域，夏季水温甚至可超过30°C（Friele, 1899）。

polls中的生物多样性仅限于能够耐受高温和盐度波动的物种。尽管这些地点具有独特性，但对其的研究仍然不足：浅水深度和复杂的地形限制了使用大型船只进行传统网捕采样，而许多河口生物（如底栖动物的幼虫阶段或隐秘的桡足类群体）的鉴定也十分困难。在这种背景下，像DNA测序这样的新型分子工具非常有用，因为它们能够不受形态或发育阶段影响地进行准确的物种鉴定（Ershova等, 2023）。然而，这些技术依赖于可靠的参考序列（“DNA条形码”进行比对，而目前许多河口生物的参考序列仍然不完整。

polls目前在商业上价值有限，但在20世纪时，人们曾对其开发用于养殖平牡蛎（Ostrea edulis）（Gaarder和Bjerkan, 1934, Strand, 1993）和动物浮游生物（N?ss, 1996, van der Meeren等, 2014）。早期的研究主要集中在人为改造的地点：大多数polls配备了混凝土闸门以控制温度和盐度，从而最大化产量，但这不可避免地影响了池塘内的物种组成（例如Solund市的Tungodden地区发生的改变（Wolleb?k和Helland-Hansen, 1907））。这些研究主要提供了关于物种组成的有限数据，通常仅涉及易于鉴定的主导动物浮游生物种类（如Centropages hamatus），或对较难识别的分类单元进行低分辨率鉴定（N?ss, 1996, van der Meeren等, 2014）。研究重点主要放在影响生产能力和效率的因素上，包括环境特征、浮游植物暴发等（Wolleb?k和Helland-Hansen, 1907, Gaarder和Bjerkan, 1934, B?hle, 1984, B?hle和?sterspoller p? Skagerrakkysten, 1986, Klaveness和Johansen, 1990, Mortensen, 1993, Strand, 1993, van der Meeren等, 2014）。因此，生态系统结构、生物多样性和季节动态仍不甚明了，尤其是在未受水产养殖影响的自然polls中。

近年来，人们对polls重新产生了兴趣，一方面是为了发展海洋桡足类养殖（van der Meeren等, 2014），另一方面是因为发现了这种可能致命且需全球报告的寄生虫Marteilia pararefringens（Kerr等, 2018）（属于Marteilia refringens M型（WOAH, 2025））。自20世纪70年代以来，这种寄生虫在欧洲就已为人所知（Comps等, 1975, Comps等, 1982），2016年首次在挪威西海岸的一个废弃平牡蛎养殖池塘Agapollen中被发现（Mortensen等, 2018b）。这一发现出乎意料，因为自1995年起每年对平牡蛎和贻贝的监测从未检测到该疾病。此后研究表明，Marteilia pararefringens可以在polls系统中繁殖（B?gwald等, 2022），并在挪威其他六个地点也被确认存在（B?gwald和Mortensen, 2024）。目前尚不清楚Marteilia pararefringens是挪威本土存在的寄生虫，还是由人类活动引入并传播的。

Marteiliosis可导致多种经济重要的双壳类动物大量死亡，因此人们一直在努力防止这些寄生虫的扩散（Carrasco等, 2015综述）。有效的管理计划需要了解这些寄生虫的生命周期，以便识别风险、调整养殖方式并减少其影响。尽管自1968年首次描述该寄生虫以来已有数十年的研究（Comps, 1970, Grizel等, 1974），但至今仍未完整描述任何Marteilia属物种的完整生命周期。然而，基于法国和西班牙的研究（Audemard等, 2001, Audemard等, 2002, Carrasco等, 2007a, Carrasco等, 2007b, Carrasco等, 2008a, Carrasco等, 2008b, Boyer等, 2013, Arzul等, 2014），动物浮游生物被认为可能是其中间宿主候选者。

生命周期研究面临三个主要挑战：（1）Marteilia常出现在物种丰富的河口环境中，这大大增加了需要筛查的物种数量（Myrand等, 2000, Audemard等, 2001），从而增加了研究成本；（2）以往的所有生命周期研究都在M. refringens和M. pararefringens这两种密切相关的、先前被归为同种的寄生虫共存的地区进行，这给正确识别中间宿主和确诊带来了困难（Figueras和Robledo, 1993, Berthe等, 2000, Le Roux等, 2001, Longshaw等, 2001, López-Flores等, 2004, Novoa等, 2005, Balseiro等, 2007）；（3）欧洲平牡蛎生产的崩溃（Goulletquer和Heral, 1997）以及某些地区贻贝中寄生虫流行率低或无法检测到的情况（D. Bass, 个人通信），使得实地研究这些寄生虫变得困难。

在挪威，这些问题并不存在：（1）polls是封闭或半封闭的系统，生物多样性较低，因此需要筛查的物种数量有限，类似于法国使用claires池塘研究M. refringens的动态（Audemard等, 2001）；（2）只有M. pararefringens存在（Hellberg和Mortensen, 2000, Hellberg等, 2010, B?gwald和Mortensen, 2024, Mortensen等, 2025）；（3）寄生虫在polls中数量众多，导致频繁且严重的感染。由于到2034年挪威贻贝产量需提升数倍（NFD, 2024），因此有必要管理M. pararefringens以减少其对生产的负面影响。因此，在受影响和未受影响的地点研究可能的动物浮游生物中间宿主（B?gwald和Mortensen, 2024）是阐明寄生虫生命周期并设计有效管理策略的重要第一步。

**2. 方法**
**2.1 地点**
从挪威南部和西部沿海的27个地点采集了动物浮游生物样本，这些地点根据B?gwald和Mortensen（2024）的研究结果，已知存在或不存在Marteilia pararefringens（图1）。地点的选择基于对历史平牡蛎养殖活动的文献回顾（表1）（Gaarder和Bjerkan, 1934, B?hle和?sterspoller p? Skagerrakkysten, 1986, Mortensen等, 2017a）。根据养殖活动类型将地点分为两类：幼虫在西部沿海的几个小型温暖池塘（温度高达30°C）中培育，而成熟的受体则被转移到较大、较冷的池塘或其他养殖地点以达到可捕捞大小。

**表1. 样本地点及其Marteilia pararefringens存在/不存在情况**
| 地点 | 代码 | 经度（DD） | 纬度（DD） | Marteilia感染状态 | 最大深度（m） | 面积（km2） | 淡水指数（1-3） | 海洋指数（1-3） | 采样日期 | PCR检测结果（批量浮游生物） |
|-------------|-------------|---------|-----------|------------|-----------|-----------|-----------------|-----------------|-------------|
| Agapollen | 59.84 | 5.27 | 正面 | 养殖/培育池塘 | 50.02 | 21 | 11/05/21 |阴性 |
| Bra | 59.89 | 5.11 | 负面 | 养殖/受体池塘 | 7.50 | 11 | 07/07/22 |阴性 |
| Drev?yna | 61.21 | 4.81 | 负面 | 养殖/受体池塘 | 50.02 | 11 | 25/07/22 |阴性 |
| Esp | 59.92 | 5.60 | 正面 | 养殖/培育池塘 | 50.03 | 11 | 25/07/18 |阴性 |
| Evjo | 60.76 | 5.11 | 负面 | 自然/类似受体池塘 | 40.03 | 12 | 28/06/21 |阴性 |
| Fle | 61.32 | 5.35 | 正面 | 自然/阈值峡湾 | 25 | 32 | 30/07/20 |阴性 |
| Hardbakke | 61.05 | 4.80 | 负面 | 养殖/受体池塘 | 40.02 | 11 | 26/07/22 |阴性 |
| Hos?y | 60.69 | 5.38 | 负面 | 养殖/培育池塘 | 50.01 | 12 | 22/06/21 |阴性 |
| Humlev?g | 61.05 | 4.90 | N/A | 养殖/培育池塘 | 50.02 | 12 | 24/07/22 |阴性 |
| Inner?y | 60.15 | 5.41 | 负面 | 养殖/培育池塘 | 17 | 11 | 19/07/18 |阴性 |
| Keile | 61.13 | 5.02 | 负面 | 养殖/受体池塘 | 80.06 | 12 | 25/07/22 |阴性 |
| Kvernepoll | 60.97 | 5.19 | 正面 | 养殖/培育池塘 | 70.02 | 11 | 29/06/21 |阴性 |
| Langeneskilen | 58.08 | 7.87 | 负面 | 养殖/受体池塘 | 10 | 18 | 11/11/22 |阴性 |
| Lysekloster | 60.22 | 5.39 | 负面 | 自然/类似受体池塘 | 50.05 | 22 | 27/07/21 |阴性 |
| Nordavatnet | 58.98 | 6.00 | 负面 | 养殖/受体池塘 | 10 | 11 | 15/07/22 |阴性 |
| Nyhammer | 61.00 | 5.00 | 负面 | 养殖/受体池塘 | 80.03 | 13 | 29/06/21 |阴性 |
| Ostrevigtjern | 58.33 | 6.24 | 负面 | 养殖/培育池塘 | 50.03 | 11 | 14/07/22 |阴性 |
| Pollevik | 61.11 | 4.89 | 正面 | 养殖/培育池塘 | 70.02 | 11 | 29/06/22 |阴性 |
| Rona | 58.06 | 6.94 | 负面 | 自然/类似受体池塘 | 20.12 | 11 | 11/07/22 |阴性 |
| Ruakerkilen | 58.39 | 8.72 | 负面 | 养殖/培育池塘 | 20.09 | 11 | 09/09/22 |阴性 |
| Syljepoll | 59.82 | 5.15 | 正面 | 养殖/培育池塘 | 7.50 | 31 | 28/09/21 |阴性 |
| Tysv?rv?gen | 59.32 | 5.47 | 负面 | 自然/类似受体池塘 | 16 | 06/09/23 |阴性 |
| Ytre Humlev?g | 61.04 | 4.90 | 正面 | 养殖/受体池塘 | 50.10 | 12 | 24/07/23 |阴性 |

此外，还选择了几个具有类似养殖池塘特征的天然地点（B?gwald和Mortensen, 2024），但当前或历史上没有水产养殖活动（基于地图调查）：主要考虑了地质特征（如小面积、浅水深度、淡水入口、水道大小）以及与平牡蛎养殖区的邻近性。额外的Tysv?rv?gen地点是基于之前的Marteilia报道选定的（Aarab等, 2011），尽管自那时起尚未在该地点再次检测到Marteilia（B?gwald和Mortensen, 2024）。尽管采样时未进行物理测量，但记录了地点的特征，包括地点类型（受体池塘、培育池塘或阈值峡湾）、总面积、水道深度、最大深度、流入峡湾的水道数量及其长度、溪流数量以及闸门的存在情况（表1）。根据这些信息，根据估计的淡水流入量（更多溪流或大型河流意味着更高的淡水指数）和潮汐活动及与周围峡湾的水交换情况（深水道、更多水道、靠近开阔海域等），主观地为每个地点分配了淡水指数（1-3）和海洋指数（1-3）。**采样协议**
采样工作于2018年至2023年间夏季至秋季进行，此时已知M. pararefringens会进入孢子形成期（Mortensen et al., 2018a, Mortensen et al., 2018b, B?gwald et al., 2022）。共从27个站点收集了40份浮游动物样本。其中有4个站点在超过一年的时间内进行了多次采样（见表1），包括2021年4月至11月在Agapollen站点进行的每两周一次的采样，以研究浮游动物及其寄生虫的季节性变化。

浮游动物是通过使用WP2型浮游生物网（0.25平方米、180微米网孔）进行水平拖网采集的。潜水员在渠道入口中段、大约2米深度处垂直于渠道方向进行拖网作业。由于样本采集自广泛的纬度区域，且之前没有关于各站点浮游生物高峰期分布的研究，因此一直持续拖网直到获得足够的样本量（至少2毫升）以满足后续分析需求。然而，有时水体中的浮游动物数量不足以达到这一最低要求。由于未测量过滤后的水样体积，因此通过样本来推断物种的存在及其相对丰度。如果样本中含有较大碎片（如植物残渣或藻类），则先用1微米网孔过滤，然后将残渣收集到另一个180微米网孔的容器中，并用100%乙醇固定。在丢弃碎片之前，先用1微米网孔检查较大的浮游动物。样本在-20℃下保存直至进一步处理。

**2.3 样品处理**
处理流程如图2所示。每个样本被均分为两份等份：先将原样本中的所有浮游生物用绝对乙醇稀释至50毫升，重新悬浮后立即将25毫升悬浮液转移到新的50毫升Eppendorf试管中。其中一份用于DNA宏条形码分析、M. pararefringens的PCR检测以及浮游动物物种的鉴定和计数，另一份则保存备用。以下所有描述均指的是第一份样本。

**2.4 PCR与DNA测序**
**2.4.1 DNA提取与Marteilia检测**
首先从每个样本中单独提取DNA，并对分类后的亚样本进行进一步处理。样本在热循环仪中于56℃下干燥1-3小时以去除残留乙醇，随后使用Qiagen公司的QIAamp DNA mini试剂盒按照制造商提供的方案进行DNA提取。使用Nanodrop仪器检测DNA纯度。PCR扩增 menggunakan Le Roux等人（2001年）设计的Marteilia特异性内转录间隔区1（ITS-1）引物Pr4/Pr5。扩增反应体系为25微升，包含1× PCR缓冲液、1× Q溶液、每种引物0.5微摩尔、每种dNTP 0.2毫摩尔、0.625乌核糖核苷酸聚合酶HotStarTaq 0.625单位和50纳米DNA模板。扩增过程在Applied Biosystems GeneAmp 9700热循环仪上进行，具体程序为：95℃预热15分钟；接着是35个循环，每个循环分别为94℃ 1分钟、60℃ 1分钟、72℃ 1分钟；最后72℃保持10分钟，之后在4℃下保存。阳性样本在1%琼脂糖凝胶上显示明显的条带。

为了鉴定浮游动物样本中的Marteilia物种，采用了多重实时PCR技术（根据欧盟参考实验室协议EURL，2023年），区分Marteilia refringens和Marteilia pararefringens。PCR反应体系为20微升，包含1× TaqPath qPCR Master Mix（A15297）、0.1微摩尔TaqMar F、0.3微摩尔TaqMar R、0.25微摩尔TaqProb O VIC-QSY、0.25微摩尔TaqProb M FAM-QSY和100纳米DNA模板。扩增在Applied Biosystems Quantstudio5 qPCR仪器上进行，具体程序为：首先在50℃下预热2分钟；然后95℃变性20秒；接着是40个循环，每个循环分别为95℃ 30秒和60℃ 1分钟。

**2.4.2 宏条形码分析**
所有DNA样本的浓度均调整为20-40纳米克/微升（对于浓度高于40纳米克/微升的样本）。使用Wangensteen等人（2018年）设计的96个独立标记的Leray-XT引物扩增每个样本中COI基因的313碱基对片段。每个20微升的PCR反应体系包含10微升AmpliTaq Gold聚合酶、0.16微升牛血清白蛋白、每种正向和反向引物各1微摩尔、1微摩尔标准化DNA和6.84微升去离子水。PCR流程包括95℃下预热10分钟、35个循环，每个循环分别为94℃ 1分钟、45℃ 1分钟、72℃ 1分钟，最后72℃下延伸5分钟。每个PCR反应体系中包含一个阴性对照。扩增产物在琼脂糖凝胶上检测以确保阴性对照无污染，然后将相同反应体系中的所有扩增子合并到一个试管中。合并后的样本使用Qiagen Minelute Purification试剂盒按照制造商说明进行纯化和浓缩，最终每个文库的洗脱体积为45微升。使用AMPure XP beads进行大小筛选，再通过NEXTflex PCR-free DNA测序试剂盒将文库连接到illumina适配子上。共制备了4个文库：2个包含大量样本（总计148个样本），另外2个包含分类后的样本（154个样本）。文库使用qPCR进行定量，随后在2×250 V3 Illumina Miseq仪器上进行测序。大量样本文库占流式细胞仪流量的75%，其余25%分配给分类后的样本文库。

生物信息学分析使用MJOLNIR版本1.2（https://github.com/adriantich/MJOLNIR3/tree/main）完成，该工具集整合了ObiTools v. 1.2.13（Boyer et al., 2016）、Vsearch v. 2.22（Rognes et al., 2016）、SWARM v. 3.0.0（Mahé et al., 2021）以及R包LULU（Fr?slev et al., 2017）。序列数据首先通过ObiTools进行双端比对、去重和质量控制。使用Vsearch去除嵌合序列，接着使用SWARM（d=13）将剩余序列聚类为MOTUs。最后使用BOLDigger（Buchner and Leese, 2020）软件通过Barcode of Life v.5数据库（公共+私有数据）进行假基因识别，设定98%的相似性阈值进行物种分类；低于85%相似性的序列被归类为未鉴定类群。对于多个物种匹配的情况，根据Ershova-Menze等人（2025）所述的手动流程进行处理。为避免假阳性结果，最终数据集中仅保留对至少20个样本有贡献的MOTUs。同一样本的三个提取重复样的序列被合并处理。

**3 结果**
成功从西海岸的Dalsfjorden到南海岸的Arendal共27个站点采集了浮游动物样本。除了罕见的成年Aurelia aurita、Gasterosteus aculeatus和Palaemon adspersus外，使用1微米网孔过滤时未检出其他生物。

**3.1 浮游动物多样性**
形态学分析共鉴定出65个独特的浮游动物分类单元。其中最多的是桡足类（27个分类单元）和混合浮游动物（24个分类单元）。整体多样性较低，每个样本的物种丰富度（S）介于2至26之间（平均11），Shannon多样性（H’）介于0.01至2.4之间（平均1.25）。对大量样本进行宏条形码分析（详细测序结果见补充材料1），共检测出182个独特的浮游动物分类单元（其中70个属于全浮游动物，112个属于混合浮游动物，见补充材料2）。其中143个分类单元达到物种水平。桡足类最为多样化（35个分类单元），其次是腹足类和刺胞动物（各22个分类单元）。S值范围为30至107个物种（平均67），而H’值较低，介于0.13至2.65之间（平均1.25）。大多数样本中99%的序列读段属于10个或更少的优势物种（Nordavatn样本中最多25个物种）。两个数据集的H’值高度相关（r=0.86，见图3）。

图3. （a）不同采样点的显微镜观察结果与宏条形码分析所得Shannon多样性指数（H’）的比较。实线蓝色表示线性回归拟合；实线黑色代表1:1关系。红色符号代表来自Agapollen的季节性样本；(b)直方图显示了占样本序列读取量99%的主要物种数量。对排序样本的测序鉴定出每个样本中有1到7种/分类类别的物种，其中Harpacticoida、Bivalvia和Gastropoda的多样性最高。许多分类单元的级别高于物种级别；一些群体，如Ostracoda和Chaetognatha，甚至无法通过宏条形码技术鉴定到门级（补充材料3）。在相对丰度方面，形态分析和宏条形码技术在主要分类单元的贡献方面显示出非常相似的模式，并且所有主要群体的百分比丰度与序列读取量之间存在高度且统计上显著的相关性（图5，表2）。在30个样本中，有19个样本主要由Acartiidae组成，这些样本中显微镜下鉴定的浮游动物中Acartiidae的比例高达99%（图4和5a）。通过形态学鉴定出三种Acartia物种：A. clausi（15个地点）、A. discaudata（3个地点）和A. longiremis（4个地点）。大多数样本无法鉴定到具体物种（图5b）。根据测序结果，Acartia margalefi普遍存在，在某些地点占总序列读取量的99%。A. clausi（6个地点）、A. hudsonica（8个地点）、A. longiremis（6个地点）和A. tonsa（1个地点）也通过测序被检测到。然而，A. discaudata未通过基因方法检测到。在6个地点，有一个被归类为Acartia的组未能通过任何方法鉴定到具体物种。

表2. 浮游动物样本中序列读取量的平方根转换值与主要分类单元丰度的平方根转换值之间的回归分析结果
组 R2 截距（B0） 斜率（B1） p值
Acartia spp. 0.62 0.10 0.72 <0.0001
Paracartia grani 0.89 0.07 1.28 <0.0001
其他桡足类 0.52 0.02 0.64 <0.0001
枝角类 0.94 0.02 0.98 <0.0001
刺胞动物 0.36 0.21 1.43 <0.0001
中层浮游动物 0.37 0.11 10.47 <0.0001

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图4. （a）采样地点的相对序列读取量计数；（b）主要分类群的丰度。对于多次采样的地点，显示的是最近采集的样本。

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图5. （a）基于宏条形码数据的聚类分析结果以及通过宏条形码（读取计数）和显微镜（丰度）估算的采样地点的相对分类组成。加粗的地点名称和符号轮廓表示之前在贻贝中记录到Marteilia pararefringens的地点；红色星号*表示通过PCR检测到M. pararefringens的浮游动物样本。簇上方的数字表示组合类型，下方符号/数字的大小反映了样本中的总浮游动物数量（注意这不代表丰度）；（b）通过宏条形码和显微镜估算的采样地点中Acartiidae（Acartia spp.和Paracartia grani）的相对物种组成，面板上方的符号大小反映了样本中的总Acartiidae数量。符号颜色反映了（a）中的群落组合。

桡足类Paracartia grani是第二常见的物种，在9个样本（8个地点）中通过显微镜检测到，并占总丰度的20%。宏条形码技术在另外9个地点也检测到了这种物种。其他桡足类（主要是Oithona nana、Pseudocalanus elongatus和Paracalanus parvus）的分布不均，在某些地点的贡献高达60%。一些地点还含有高比例的未知序列，其贡献在3个地点超过了25%（图4和5）。

多样性最高的是Tysv?rv?gen，最低的是Flekke，那里99.9%的丰度由双壳类Evadne nordmanni组成。另外两个站点（Haugav?gen和Keilepollen）也以双壳类Podon和Pleopsis的较高贡献为特征。除了Flekke外，所有地点都存在中层浮游动物，并且在中层浮游动物的数量和序列读取量方面都是主导群体。刺胞动物在宏条形码数据中很常见，在大多数地点都有发现，占序列读取量的最大比例达85%（图3，图4），而显微镜仅在11个样本中检测到这一群体，其中最高丰度贡献出现在Ruakerkilen（30%）。

3.2. Marteilia pararefringens的检测
根据确证性实时PCR和先前报道的数据（B?gwald和Mortensen，2024），只有在研究的地点才存在Marteilia pararefringens。该寄生虫在两个地点的批量浮游动物样本中被检测到：Agapollen（2021年）和Pollevik（2022年）。这种寄生虫在浮游动物样本中的存在情况随季节和年份而变化（见第3.3节）。在其他先前在贻贝中检测到M. pararefringens的地点（Trysfjorden/Knibepollen、Humlev?gpollen、Espevikpollen、Syljepollen和Flekke）的批量浮游动物样本中未检出该寄生虫。然而，在一些从受Marteilia影响的地点采集的阴性批量样本中分选的样本中检测到了M. pararefringens。在任何未发现受寄生虫感染的贻贝的地点的浮游动物样本中均未检测到M. pararefringens。在至少有一个批量样本中未检测到M. pararefringens的地点，也没有任何子样本呈阳性。

3.3. 浮游动物群落结构与Marteilia的存在及地点特征的相关性
多变量统计（聚类分析和nMDS排序）将地点分为四种不同的群落类型和几个异常值（图5，图6）。Marteilia受影响地点和未受影响地点之间的中心点没有显著差异（PERMANOVA：F = 1.19，R2 = 0.04，p = 0.26），表明没有单一的群落类型与寄生虫的存在强烈相关。最常见且最同质的群落类型（组合1）由16个样本组成，其特征是A. margalefi占优势且总体多样性较低，与较浅的水道和最大深度以及较低的海洋/淡水指数相关。该组中有6个样本属于Marteilia受影响的地点，尽管这些样本中没有一个通过PCR检测出寄生虫。

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图6. 基于平方根转换后的相对序列读取量数据的非度量多维缩放（nMDS）结果。符号的大小反映了宏条形码得到的香农多样性指数（H’）。黑色边框的符号表示之前在贻贝中检测到Marteilia pararefringens的地点；黄色星号*表示通过PCR检测到M. pararefringens的浮游动物样本。灰色箭头和物种名称表示对排序有显著影响的物种（p < 0.05）；蓝色箭头表示与排序显著相关的地点特征（p < 0.05）。符号颜色表示组合类型（如图5中所定义），符号大小反映了它们在排序中的大致中心位置。

组合2（5个样本）的特点是P. grani的相对丰度高（>25%的序列读取量）且多样性适中。除了一个样本外，其他样本都属于Marteilia受影响的地点，并且有2个样本通过PCR检测出寄生虫的存在。属于该组合的地点比属于其他组合类型的地点更有可能受到Marteilia感染（Fisher精确检验，OR = 0.12，95% CI：0.002–1.46，p = 0.06），但由于每个组合的样本数量较少，这一结果应谨慎解释。这种模式与受感染地点沿NMDS2轴的显著变化一致（Wilcoxon等级和检验，p = 0.025），该轴与P. grani的丰度最为相关。组合3（5个样本）是一个异质性群体，总体多样性较高且分类组成多样，其特征是Acartiidae的丰度较低，而刺胞动物和枝角类的贡献较高。在这些地点存在的Acartiidae中，主要物种是A. longiremis、A. clausi和A. discaudata。这一组通常与较深的水道和最大深度相关，表面积较大，海洋/淡水指数较高，并包括一个Marteilia受影响的地点，但没有PCR阳性的浮游动物样本。组合4的特点是Acartiidae的贡献较高，但这些Acartiidae不属于A. margalefi或P. grani，其中包括一个无法通过宏条形码或显微镜鉴定到具体物种的Acartia属物种。值得注意的是，重复采样的地点在不同年份并不总是属于相同的组合。未归属于上述任何组合的地点包括以双壳类为主的Flekke（受Marteilia影响）；以中层浮游动物为主的Nyhammerpollen；以及Lysekloster，在那里观察到非Acartiidae家族的海洋桡足类贡献最高。

3.3.1. 年际变异性和季节性
在四个重复采样的Marteilia受影响地点，浮游动物群落结构存在显著变异性，导致所有地点都被分配到不同的群落类型（图5，图6），除了Espevikpollen。在Pollevik和Agapollen，其中一个采样年份（2021年的Agapollen和2022年的Pollevik）观察到P. grani的高丰度，这与批量浮游动物样本中检测到Marteilia的结果一致。在其他年份，观察到了不同的群落类型（组合1），P. grani未被检测到或仅以低数量存在，且批量浮游动物样本通过PCR检测为阴性。同样，2023年在Syljepollen中P. grani相对丰富，但在2021年无论是通过形态学还是宏条形码均未被检测到，而该地点的群落主要由水母（Bougainvillia muscus、Lizzia blondina和Stauridiosarsia gemmifera）主导。然而，与前两个地点不同，在这些地点的任何批量样本、分选样本或后处理样本中均未检测到Marteilia。在Marteilia未在贻贝中检测到的地点，没有子样本呈阳性。

3.3.2. 按类别排序的样本中Marteilia的存在
在Agapollen（2021年）和Pollevik（2022年和2023年）的分选样本中检测到了M. pararefringens。在两个地点的批量浮游动物样本中均检测到成年雄性和雌性A. margalefi和P. grani（表3，补充表3）。2021年6月22日在Agapollen还发现了Musculus subpictus的软体动物幼体；然而，该样本中也含有35%属于A. margalefi和P. grani的序列读取量。2022年在Pollevik还检测到了十足类幼体（Athanas nitescens和Carcinus maenas）和Oithona nana。2023年在Pollevik的分选多毛类动物（Platynereis dumerilii、Syllidia armata和Tubificoides benedii）中检测到了微弱的PCR信号，但确证性实时PCR和PCR RFLP未能再次检测到该寄生虫。这两个分类群（p = 0.44）或每批样本中的个体数量（p = 0.92）都不是PCR阳性的显著预测因素。对所有分选样本进行的Wilcoxon等级和检验未发现PCR阳性样本和阴性样本之间在批次大小上有显著差异（W = 533，p = 0.48），表明M. pararefringens的检测不是批次大小的伪影。

表3. 通过PCR检测出Marteilia pararefringens的物种列表。N表示分选个体的数量。M – 成年雄性；F – 成年雌性；juv. – 柄足类幼体；larv. – 幼虫。鉴定结果列出了通过DNA宏条形码鉴定的物种，这些物种贡献了至少1%的读取量，括号中显示了序列读取量的百分比。

日期 代码 分类单元排序 DNA鉴定结果
08/06/2021 Agapollen Aga-21-3 Acartia spp. M 50 Acartia margalefi (99)
22/06/2021 Agapollen Aga-21-4 Acartia spp. F52Acartia margalefi (87); Paracartia grani (10); Aurelia aurita (2)Acartia spp. M36Acartia margalefi (97); Aurelia aurita (2)双壳类幼虫21Musculus subpictus (59); Acartia margalefi (30); Paracartia grani (6); Aurelia aurita (4)Paracartia grani F2Paracartia grani (88); Aurelia aurita (8); Acartia margalefi (3)Paracartia grani M25Paracartia grani (85); Acartia margalefi (7); Aurelia aurita (6)2021年7月7日Aga-21-5Paracartia grani M63Paracartia grani (99)2021年7月20日Aga-21-6Paracartia grani F35Paracartia grani (98)Paracartia grani M97Paracartia grani (98)Paracartia grani juv.19Paracartia grani (99)2021年8月17日Aga-21-8Acartia spp. F70Acartia margalefi (100)Paracartia grani F16Paracartia grani (99)2021年9月28日Aga-21-9Paracartia grani F19Paracartia grani (97); Acartia margalefi (2)Paracartia grani M82Paracartia grani (93); Aurelia aurita (4); Acartia margalefi (3)Pollevik2022年7月24日Pol-22Acartia spp. F100Acartia margalefi (84); Paracalanus parvus (11); Paracartia grani (5)Acartia spp. M40Acartia margalefi (78); Paracartia grani (22)十足类幼虫7Athanas nitescens (54); Carcinus maenas (42); Stauridiosarsia gemmifera (3)Oithona sp.92Oithona nana (89); 环节动物目 (10)Paracartia grani F53Paracartia grani (99)Paracartia grani M43Paracartia grani (98); Acartia margalefi (1)Paracartia grani juv.30Paracartia grani (99)2023年7月24日Pol-23多毛类幼虫6Platynereis dumerilii (51); Syllidia armata (35); Tubificoides benedii (13)4. 讨论本研究首次全面调查了挪威南部和西部沿海水域中浮游动物物种的多样性，以及浮游动物在双壳类寄生虫Marteilia pararefringens传播中的作用。通过结合传统显微镜技术和DNA宏条形码技术，我们能够描述这些独特河口栖息地中的浮游动物多样性、群落结构和季节动态。4.1. 浮游动物多样性和群落结构浮游动物物种多样性明显低于相邻的峡湾系统（Ershova等，2024年），群落通常由少数几种数量众多的种类主导。只有少数几种浮游动物物种与相邻的沿海水域共有（Nielsen和Andersen，2002年；Ershova等，2024年），而大多数常见的沿海物种在调研水域中要么不存在，要么数量非常稀少。物种组成和整体多样性受到调研水域物理特征的强烈影响：水域越小、越孤立、越浅，多样性就越低。在我们的样本点中普遍存在的优势物种Acartia margalefi在欧洲多个沿海地区都有记录。然而，在挪威，它之前仅在西挪威Austevoll的一个人工咸水池塘Svartatj?nn中被发现（Belmonte和Mazzochi，1997年）。该池塘原本是淡水池塘，后来引入海水用于作为海洋鱼类幼鱼的饲料生产者（Naas等，1991年）。这种桡足类几乎可以肯定是通过相邻峡湾系统的泵口进入池塘的，尽管这种桡足类在挪威的任何峡湾系统中都未被记录过。Acartia margalefi的大部分生命周期以休眠卵的形式存在，因此会周期性地从水柱中消失（Belmonte和Mazzochi，1997年），但我们的发现表明，在夏季，这种桡足类在挪威南部和西部的调研水域中非常常见。除了优势物种Acartia margalefi外，我们还在其他几个研究地点检测到了同一属的六种其他不同“物种”，这些地点主要位于海水交换更频繁的大型调研水域。入侵物种Acartia tonsa仅在其中一个样本点被发现，但据记录它存在于挪威的一些河口位置（Moseid等，2021年；Falkenhaug等，2023年），但由于其能够竞争并维持在河口环境中的高丰度，其实际分布可能更广（Holste和Peck，2006年）。然而，准确鉴定Acartia物种可能很困难，因为大多数样本无法通过立体显微镜充分区分。Acartia的分类学较为复杂，存在许多隐存谱系和并系群（Figueroa等，1849年），这种情况在河口浮游动物群体中并不罕见（Dodson等，2010年）。Acartia“物种”分布的不均匀可能是由于不同地点之间的物理和生态差异（Roberts等，2009年；Schultz和McCormick，2012年；King等，2014年），使这些物种能够占据不同的生态位（Bilton等，2002年），或者是因为调研水域本身的隔离性，使其局部群落与更广泛的区域分布模式脱节。未来的研究应旨在解决这种细致的变异性，并确定这些隐存群体的分布模式。第二常见的桡足类物种是Paracartia grani，它在西部沿海以前的扁平牡蛎养殖场中尤为常见。除了这次首次描述外（包括在相邻的Sel?ypollen中观察到的少数个体（Sars，1904年），这种桡足类在挪威水域中很少被报道，其他记录仅在Svartatj?nn（van der Meeren等，2008年）和Agapollen（B?gwald等，2022年）中发现。与A. margalefi可能来自相邻峡湾系统不同，P. grani在Svartatj?nn的出现可能是由于从Espevikpollen转移到Svartatj?nn的设备“污染”所致（T. van der Meeren，个人通信）。这种桡足类在欧洲的传播与双壳类养殖有关（Boyer等，2012年），但其在非养殖水域（如Fleckke、Haugav?gen、Rona）中的存在也表明，这种嗜热桡足类可能是挪威的本地物种，可能是历史较温暖时期的遗留物（Sars，1904年推测）。除了Acartiidae成员外，某些调研水域中的其他优势浮游动物还包括枝角类、水螅水母和多样性较高的浮游动物（底栖动物的浮游幼体）。对于后者，由于采样深度较浅，可能会因捕获到成年底栖生物的碎片而通过宏条形码技术高估多样性；然而，通过显微镜观察到的大量该类群以及从分类学分类样本中鉴定出的多样性证实了它们在调研水域中的重要性。这些幼体代表的是常驻于这些水域的底栖物种，还是从相邻峡湾系统漂流而来的访客，仍有待确定。4.2. Marteilia pararefringens的中间宿主候选者法国牡蛎养殖场（claires）已被用来研究感染Ostrea edulis的Marteilia refringens病原体及其传播动态（Audemard等，2001年；Audemard等，2002年；Audemard等，2004年）。由于这些养殖场的物种多样性较低，因此可以比大型河口系统的扁平牡蛎养殖场更彻底地调查潜在宿主（Montadouin和Sauriau，2000年）。与南欧许多地区不同，在这些养殖场中只存在Marteilia pararefringens，而在M. refringens也存在的地区则两者共存。这一点通过感染贻贝的测序（B?gwald等，2022年；B?gwald和Mortensen，2024年）以及本研究的实时PCR分型得到了证实。养殖场较低的物种生物多样性，类似于claires，加上M. pararefringens的局部、孤立和独占存在，为研究某些独特的浮游动物是否仅在寄生虫存在的地点出现或相对更丰富提供了独特的机会，而不会受到M. refringens共存的影响。有趣的是，在所有受Marteilia影响的地点的浮游生物样本中均未检测到M. pararefringens（B?gwald和Mortensen，2024年），尽管在一些地点进行了多年的采样。初步的季节性调查显示，这种寄生虫在整个季节中都可以检测到（B?gwald等，2022年），但该地点的双周采样表明M. pararefringens的流行呈高峰分布，分别在6月至7月初和8月至9月底（图7）。在法国的Diana Lagoon也有类似发现（Arzul等，2014年）。如果这种情况普遍存在，那么其他受影响地点未检测到寄生虫可能是由于采样时间错过了寄生虫在浮游生物中出现的时间段。值得注意的是，这些高峰期与寄生虫感染贻贝Mytilus spp.并从中释放孢子的时期相吻合（B?gwald等，2022年；B?gwald等，2025年）。由于PCR检测只能识别寄生虫DNA的存在（Burreson，2008年），这两个高峰可能是寄生虫孢子或DNA随水体存在并通过浮游生物的摄食或过滤活动进入水柱的结果。需要进一步通过组织学和原位杂交 confirmatory analysis 来研究寄生虫在浮游生物组织中的实际存在情况。观察到的Marteilia存在差异也可能与某些浮游动物种类之间的物理和生态差异有关（Roberts等，2009年；Schultz和McCormick，2012年；King等，2014年），这些差异使这些物种能够占据不同的生态位（Bilton等，2002年），或者是因为调研水域本身的隔离性，导致局部群落与更广泛的区域分布模式脱节。未来研究应致力于解决这种细微的变异性，并确定隐存群体沿物理梯度的分布模式。在Espevikpollen两个采样年份中，通过两种方法都观察到了P. grani的丰度较低。这些发现反映了我们研究的局限性，因为我们不知道贻贝在每个地点是如何被感染的，这意味着收集到的浮游生物群落可能无法代表寄生虫实际感染贻贝的时间。来自Agapollen的研究使用未感染的、无疾病的贻贝表明，M. pararefringens可以在短短3-6周内感染并迅速发展（B?gwald等人，2022年，B?gwald等人，2025年），并且几乎每年都在该地点发生传播。然而，这种情况可能并不适用于所有地点，在某些地点，M. pararefringens的感染阶段可能是非周期性的，导致感染在贻贝中持续多年。此外，在三个从未记录到M. pararefringens的贻贝地点也检测到了P. grani（B?gwald和Mortensen，2024年）。尽管P. grani的流行率和丰度似乎与寄生虫有关，但Carrasco等人（2008b）的实验表明，来自贻贝的M. pararefringens（= M. maurini）孢子在未感染的P. grani中不会繁殖。未来的研究必须包括来自相关地点的所有可用分类单元，以避免潜在的确认偏倚。

4.2.1 方法学考虑和未来方向
我们结合使用宏条形码技术和显微镜技术，提供了比单独使用任一方法更全面的浮游动物群落组成图谱。宏条形码技术使我们能够区分隐秘物种、识别缺乏诊断形态特征的幼虫阶段，并捕捉到在保存过程中丢失或预筛选中被排除的胶质浮游生物的多样性。同时，传统显微镜技术验证了主要群体的相对贡献，并能够检测到由于引物不匹配（Albaina等人，2024年）和/或参考数据库覆盖不足（Bucklin等人，2021年）而难以通过基因方法捕获的分类单元，如卵形幼虫、介形虫和毛颚类动物。两种方法得出的多样性指标之间的强相关性以及相对丰度与相对序列读数之间的强相关性值得注意，这在一定程度上反映了采样生物的相对较窄的大小范围（0.2-1毫米），这减少了由于不同分类单元之间DNA含量差异造成的偏差。这些结果突显了宏条形码技术不仅在分类鉴定方面的潜力，还在定量群落分析方面的潜力。

然而，我们的研究也揭示了重要的方法学限制，包括采样和处理方法。首先，参考数据库中的空白和错误仍然是准确进行宏条形码分析的主要障碍。我们分类后的样本中的一些生物（如毛颚类动物、介形虫、被囊动物）甚至无法鉴定到目级别，这表明这些物种尚未被条形码化，或者与所选标记不兼容。在桡足类动物中，尽管BOLD中有该物种的参考序列，但Acartia discaudata未能通过宏条形码技术被检测到。然而，这些样本来自地中海地区，这提示该物种可能代表一个物种复合体（Figueroa等人，1849年），并强调了建立本地参考库的必要性。同样，已知的分类学不一致性，如A. hudsonica和A. tonsa之间的错误分配或Magallana gigas和Ostrea edulis之间的错误分配，给解释带来了不确定性，需要专家进行验证。因此，继续在分类学、条形码技术和建立可靠参考库方面的努力对于提高宏条形码技术的可靠性至关重要。

此外，我们的采样协议是非定量的，由于在如此浅的地点收集浮游生物的挑战性，未测量过滤水的体积。虽然这足以描述物种的存在和相对丰度，但它排除了跨地点或季节的绝对丰度比较或总体生产力估算。选定的网眼大小（180微米）以及对大于1毫米的生物进行预筛选，限制了分析范围，排除了许多较小和较大的生物形式。此外，没有同时测量物理或生物地球化学特征，如温度、盐度或叶绿素-a，这些数据本可以让我们更直接地将浮游动物群落的动态与环境变化联系起来。未来的研究应该设计来克服这些限制，以加深对河口生态系统的理解。

对分类后样本的PCR分析使我们能够识别Marteilia pararefringens生命周期中的潜在中间宿主。然而，由于PCR检测并不等于感染，因此需要对所有识别出的分类单元进行现场杂交检测，以验证感染情况并描述病理特征（例如形态、组织趋向性、宿主反应）。此外，关于M. pararefringens在晚秋浮游动物群落崩溃后的情况仍然未知。在这种背景下，在底栖生物（如十足类动物和多毛类动物）的浮游幼虫中检测到Marteilia尤其引人注目，值得进一步研究。将采样扩展到冬季并包括环境样本（如沉积物）可以帮助阐明这种寄生虫的完整生命周期。这些发现还有助于解释其他受Marteilia影响的地点中浮游生物中M. pararefringens明显缺失的现象。

5. 结论
本研究首次使用传统的体视显微镜和宏条形码技术综合描述了广泛地理范围内的河口浮游动物群落。尽管这些系统的总体生物多样性相对较低，但它们中存在一些在挪威相邻温带峡湾环境中不常见的独特分类单元。少数桡足类动物的持续主导地位，以及隐秘物种和以前报道不足的物种的存在，进一步突显了这些系统的生态独特性。随着与外部峡湾系统的连通性增加，浮游生物的生物多样性通常也会增加，这突显了物理交换过程在塑造群落组成中的重要性。因此，这项工作为了解这些高纬度栖息地中浮游动物的多样性提供了重要的基础贡献。此外，这项研究还强调了浮游生物种类在Marteilia pararefringens寄生虫生命周期中的作用。在河口系统中，Acartia margalefi和Paracartia grani是最常被PCR检测出寄生虫阳性的桡足类物种，在这些系统中已经确认了M. pararefringens对Mytilus spp.贻贝的感染。在所有受Marteilia影响的地点的浮游生物样本中均未检测到寄生虫，这表明其生命周期可能是非周期性的（即每年不一定出现），或者在相关地点的采样时间不匹配。在一个地点Pollevik，我们在几种底栖十足类和多毛类动物的浮游幼虫中检测到了M. pararefringens，而在另一个地点Agapollen，我们在Musculus subpictus的幼虫中检测到了该寄生虫。然而，需要进一步的研究来确认这些浮游动物宿主体内的活跃感染。未来的研究应继续利用宏条形码技术和体视显微镜筛选，将采样扩展到所有月份，包括浮游生态系统中的其他生境（如底栖生物/沉积物），以及组织样本，并结合环境数据（如温度、盐度）。

CRediT作者贡献声明
Mats B?gwald：起草、审稿和编辑、可视化、验证、软件、资源、项目管理、方法学、调查、正式分析、数据管理、概念化。
Elizaveta Ershova-Menze：起草、审稿和编辑、可视化、验证、软件、方法学、调查、正式分析、数据管理。
Monica Bente Martinussen：起草、审稿和编辑、方法学。
Tone Falkenhaug：起草、审稿和编辑、验证、资源、资金获取。
Stein Mortensen：起草、审稿和编辑、可视化、验证、监督、资源、项目管理、资金获取。