FGF23与免疫细胞特征在蛛网膜下腔出血中的因果关联：来自多组学和基因共定位的证据

《Brain and Behavior》：FGF23 and Immune Cell Signatures Causally Linked to Subarachnoid Hemorrhage: Evidence From Multi-Omics and Genetic Colocalization

　　摘要

背景
炎症和免疫反应在蛛网膜下腔出血（SAH）后对脑损伤有重要影响，这是一种严重的神经系统疾病。本研究采用了孟德尔随机化、共定位和多组学分析来探讨炎症蛋白、免疫细胞与SAH之间的潜在因果关系，旨在阐明其发病机制。

方法
本研究利用了来自全基因组关联研究（GWAS）的公开数据，包括蛋白质QTL（pQTL）和RNA测序数据。首先使用双向双样本孟德尔随机化（MR）分析来评估炎症蛋白、免疫细胞与SAH之间的因果关系。然后采用了一种综合的多组学方法，包括转录组分析、共定位和中介效应MR分析，以识别特定的炎症蛋白、免疫细胞和潜在的药物靶点。

结果
通过MR分析确定了五种炎症蛋白（CD6、FGF23、TGFB-1、LIFR和TGF-α）与SAH之间的因果关系。此外，在22种类型的免疫细胞中也发现了与SAH的因果关系。后续的多组学分析显示，FGF23是一个枢纽炎症蛋白，其表达水平与CD4 Treg细胞的数量密切相关。元分析和复制研究将FGF23确定为SAH的风险因素，其共定位得分为0.74。

结论
本研究成功识别了与SAH相关的炎症蛋白和免疫细胞，并揭示了SAH复杂的遗传因果关系和药物靶点。

1 引言
蛛网膜下腔出血（SAH）主要是由颅内动脉瘤的自发破裂引起的，导致发病率、死亡率和医疗负担显著增加（Hoh等人，2023年）。这种病症主要影响50岁左右的成年人，并对患者的生活质量和公共卫生有深远影响（Claassen和Park，2022年）。颅内动脉瘤破裂会导致血液进入蛛网膜下腔，触发一系列炎症和免疫反应。这些病理过程与患者观察到的不良预后密切相关（Wu等人，2021年；Solár等人，2022年）。研究表明，通过调节小胶质细胞的极化和炎症反应可以减轻SAH后的脑损伤（Shao等人，2023年；Li等人，2018年）。在蛛网膜下腔出血后，调节性T细胞（Tregs）被激活，通过抑制T细胞增殖和影响抗炎因子的产生来调节免疫反应（Sakaguchi等人，2010年）。此外，受损神经元和坏死细胞释放的炎症分子进入细胞外环境可能会加剧SAH后的继发性损伤（Sun等人，2014年）。充分了解与SAH及其结果相关的免疫-炎症机制对于改进患者治疗策略至关重要。近年来，孟德尔随机化（MR）受到了广泛关注。该方法利用基因变异作为工具变量来推断暴露与结果之间的因果关系，最小化混杂因素和反向因果关系。因此，MR比传统的观察性研究更能提高因果推断的可靠性。随着GWAS数据的不断更新，已有研究从基因表达和蛋白质表达水平探讨了免疫-炎症与颅内动脉瘤（IAs）之间的遗传关联。鉴于缺乏全面的多组学分析来研究免疫和炎症反应靶点在SAH中的作用，本研究整合了多组学和双样本MR分析，以识别与SAH相关的炎症蛋白和免疫细胞，探讨它们的关联，并确定潜在的药物靶点，为个性化SAH治疗提供新的见解和策略。

2 方法
2.1 研究设计和数据来源
本研究使用了公开可获得的GWAS汇总统计数据和RNA测序数据，因此不需要额外的伦理批准。研究流程见图1。样本信息如下：来自Zhao等人的91种炎症蛋白，样本数量从11,778到14,744个（Zhao等人，2023年）；来自Valeria Orru等人的731种免疫细胞，样本数量从1,244到3,659个（Orrù等人，2020年）。额外的pQTL数据主要来自GWAS目录，包括GCST90012022、GCST90179299和GCST90241167，样本数量从2843到21,758个。SAH数据来自Sakaue等人（2021年），包括1,693例欧洲血统病例和471,562例欧洲血统对照组。复制研究包括812例英国血统病例和399,017例英国血统对照组。本研究使用了GEO数据库中的转录组测序数据集GSE36791和GSE73378。数据集GSE36791包含43个SAH患者的全血样本和18个健康对照组的样本，而数据集GSE73378包含103个患者样本和107个对照组的外周血样本。所有数据集的完整目录见表S1。

2.2 差异表达基因的识别
“limma”包检测了SAH组和对照组之间显著差异表达的基因（DEGs），显著性阈值设为p < 0.05和对数倍数变化（logFC）> 0.1。“ggplot2”包用于生成DEGs的火山图。

2.3 工具变量的选择
免疫细胞和炎症蛋白相关的SNPs通过显著性阈值p < 5 × 10^-8和p < 5 × 10^-6进行筛选。由于筛选到的SNPs数量较少，我们在后续分析中将显著性水平设为p < 1 × 10^-5。为了最小化连锁不平衡效应，我们将参数配置为10,000 kb，r2 = 0.001。选择F统计量超过10的SNPs作为工具变量（IVs）进行进一步分析。

2.4 免疫浸润分析
使用单样本基因集富集分析（ssGSEA）评估数据集GSE36791和GSE73378中的免疫细胞表达水平，并进行了相关性检验，以研究基因表达与免疫细胞含量之间的联系。相关性检验的p值低于0.05表明炎症蛋白表达与免疫细胞含量之间存在关系。

2.5 GSEA和药物靶点富集分析
本研究使用GSEA方法确定与特定基因相关的生物功能或信号通路在基因表达排名极端处是否显示出显著富集，表明上调或下调的趋势。我们从药物-基因相互作用数据库（DGIdb，https://dgidb.genome.wustl.edu/）获取基因和药物的数据，并使用“enrichplot”包来识别与FGF23相关的药物。统计显著性被设定为p值小于0.05。

2.6 元分析和贝叶斯共定位分析
我们进行了元分析，以进一步确认炎症蛋白水平与SAH之间的因果关系，利用了来自不同研究的暴露数据。复制研究验证了炎症蛋白与SAH之间的因果关系。随后，我们进行了共定位分析，以探索可能与炎症蛋白和SAH相关的SNPs。先前的研究表明，应使用以下标准来筛选这些蛋白：（1）H0：免疫-炎症或SAH之间不存在因果变异；（2）H1：单一因果变异仅影响基因表达；（3）H2：单一因果变异仅影响SAH风险；（4）H3：两个不同的因果变异分别影响两种特征；（5）H4：共享的因果变异同时影响两种特征（Giambartolomei等人，2014年）。对于仅与两种特征相关的因果变量（FGF23和SAH），参数设置为P1 = 1 × 10^-4，P2 = 1 × 10^-4，P12 = 1 × 10^-5。当H4（PPH4）超过0.70时，假设存在共定位。

2.7 统计分析
我们对IVW方法的结果进行了FDR校正（FDR < 0.05），p值低于0.05。此外，为了评估因果方向的一致性，我们进行了MR-Steiger测试和反向MR分析。为了进一步探索炎症蛋白与SAH之间的潜在生物学通路，我们进行了两步孟德尔随机化中介分析。第一步，使用炎症蛋白的遗传工具变量来估计它们对免疫细胞特征的因果效应。第二步，将免疫细胞特征作为暴露因素来评估它们对SAH的因果效应。中介比例按系数乘积框架计算间接效应与总效应的比率。由于该分析基于汇总数据，因此中介结果作为点估计报告，并被视为探索性的。进行了统计分析，如异质性和多重性测试，以确定结果的稳定性和可靠性。最初使用Cochran's Q统计量来评估IVW方法中基因变异的异质性。在检测到异质性的情况下，我们转而使用随机效应模型进行后续分析。接下来，我们通过MR-Egger回归（Burgess和Thompson，2017年）评估水平多重性。MR-PRESSO方法用于检测和消除可能表现出水平多重性的异常单核苷酸多态性（SNPs）。MR-PRESSO的总体测试结果显示，水平多重性的存在具有统计学意义（Verbanck等人，2018年）。分析使用了R软件（v4.3.2）和“TwoSampleMR”（v0.5.6）、“meta”（v7.0）、“coloc”（v5.2.3）以及“ggplot2”（v3.5.1）等包。

3 结果
3.1 炎症蛋白与SAH之间的因果关系
在正向MR分析中，经过校正后确定了五种炎症蛋白是SAH的因果因子（图2）。包括CD6、FGF23、TGFB-1、LIFR和TGF-α。IVW分析表明CD6水平与SAH风险呈负相关（OR = 0.68，95% CI：0.50–0.94，FDR < 0.05）。FGF23水平与SAH风险呈正相关（OR = 1.29，95% CI：1.08–1.55，FDR < 0.05）。TGFB-1水平与SAH风险呈负相关（OR = 0.84，95% CI：0.70–0.99，FDR < 0.05）。LIFR水平升高与SAH风险显著相关（OR = 1.24，95% CI：1.04–1.48，FDR < 0.05）。TGF-α水平与SAH风险呈负相关（OR = 0.76，95% CI：0.63–0.91，FDR < 0.05）。这些发现表明，CD6、TGFB-1和TGF-α的水平较低与SAH风险降低相关，而FGF23和LIFR的水平较高与SAH风险增加相关。使用F统计量评估了所有遗传工具变量的强度。为了清晰起见，提供了代表性炎症蛋白暴露的工具强度可视化，而免疫细胞工具变量则通过标准阈值进行数值评估和筛选（表S1）。敏感性分析显示LIFR水平相关的SNPs存在异质性（Q = 50.17，p = 0.008）。因此，应用了乘法随机效应IVW模型，而不是固定效应IVW估计器（表S2）。反向MR和Steiger测试结果未发现反向因果关系（表S3）。

3.2 免疫细胞与SAH之间的因果关联
正向MR分析显示，经过校正后有22种免疫细胞与SAH具有因果关系（图3）。研究调查了各种免疫细胞标记物，包括B细胞上的IgD-CD24?、树突状细胞上的CD11c+ CD62L?、调节性T细胞上的CD4、CD8br调节性T细胞上的CD28+ CD45RA?、以及IgD+ CD24+ B细胞和IgD+ CD38?未转换记忆B细胞上的CD19。它还研究了记忆B细胞上的CD19、CD24+ CD27+ B细胞和IgD? CD38? B细胞上的CD27、HLA DR+ CD8br T细胞和CD28+ CD45RA+ CD8br调节性T细胞上的CD3、树突状细胞上的CD45、NK细胞上的CD127、CD28+ CD45RA? CD8br调节性T细胞上的CD127、CD8br TBNK细胞上的FSC-A、CD14? CD16+单核细胞和单核细胞上的CD64、粒细胞树突状细胞上的CCR2、CD33br HLA DR+ CD14dim髓系细胞上的CD45和CD11b、HLA DR上的HLA DR+髓系细胞以及CD88? CD8br调节性T细胞上的CD8。其中，10种免疫细胞与SAH正相关，12种免疫细胞与SAH负相关（FDR < 0.05）。敏感性分析未发现22种免疫细胞结果中的显著异质性。MR-Egger p值表明CD11b对CD33br HLA DR+ CD14dim髓系细胞的影响显著（p值低于0.05），但MR-PRESSO大于0.05（表S4）。表S5提供了包括效应大小和F统计量的每个SNP的总结。使用IVW对免疫细胞进行反向MR分析，发现CD14? CD16+单核细胞上的CD64表达与SAH有显著关联（FDR < 0.05）（表S6）。施泰格（Steiger）的研究结果并未显示出补充剂与这些因素之间存在反向关联（表S6）。图3（在图形查看器中打开） PowerPoint

森林图估计了免疫细胞与蛛网膜下腔出血（SAH）风险之间的关联。IVW表示逆方差加权；OR表示比值比；CI表示置信区间；FDR表示假发现率。

3.3 差异基因和枢纽炎症蛋白的鉴定
在这项研究中，我们使用了GSE36791数据集进行差异表达基因（DEGs）分析。分析表明，较低的p值能够提高基因排名和差异表达的可信度。经过筛选，我们发现了2537个上调的DEGs和3441个下调的DEGs（表S7）。火山图突出了上调和下调的DEGs（图4A）。此外，通过维恩图分析，对MR分析获得的炎症蛋白和差异基因进行了交集分析（图4B），并识别出关键的炎症蛋白FGF23和TGF-α。图4（在图形查看器中打开） PowerPoint

枢纽炎症蛋白的鉴定和功能表征。(A) 差异基因的火山图。(B) 差异基因与炎症蛋白的交集的维恩图，MR结果。GSEA富集分析和免疫细胞浸润。(C) FGF23高表达组中前5个活跃的生物学功能。(D) FGF23低表达组中前5个活跃的生物学功能。(E) GSE36791数据集中FGF23与多种免疫细胞之间的相关性散点图。(F) GSE73378数据集中FGF23与多种免疫细胞之间的相关性散点图。

3.4 枢纽炎症蛋白的中介分析
为了探讨炎症蛋白与SAH之间的相互作用，我们采用了两步方法来评估关键炎症蛋白的中介效应。炎症蛋白与免疫细胞之间存在显著相关性对于中介作用是必要的。在我们的分析中，没有发现TGF-α与任何免疫细胞有显著关联。这表明FGF23与CD4调节性T细胞（CD4 Treg细胞）之间存在因果关系，估计中介效应为10.8%（表S8）。这一发现为理解FGF23在SAH病理过程中的作用提供了新的视角。

3.5 GSEA和药物富集分析
通过基因集富集分析（GSEA）研究了FGF23对SAH的潜在影响。根据富集分数，FGF23主要富集在氮代谢、糖胺聚糖生物合成-角蛋白硫酸盐和集合管酸分泌中（图4C）。甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢，以及黏蛋白型O-糖链生物合成和其他生物学过程也与FGF23相关。下调表达主要与哮喘、核糖体和其他生物学过程相关（图4D）。有30种药物与FGF23相关，包括β-甘油磷酸酸、西那卡塞特（Cinacalcet）和阿尔法骨化三醇（alfacalcidol）（p < 0.05）（表S9）。

3.6 免疫细胞浸润的评估
中介和富集分析表明，FGF23在免疫-炎症过程中起着关键作用。我们使用ssGSEA算法来检查免疫细胞特征以及FGF23与SAH中免疫细胞浸润之间的关联。对GSE36791数据集的分析显示，FGF23的表达与多种免疫细胞之间存在显著相关性（图4E），其中CD4 Treg细胞的相关性为?0.54（p < 0.001）（表S10）。在GSE73378数据集中也发现了显著关联（相关性为?0.20，p = 0.004）（图4F；表S11）。

3.7 整合炎症蛋白与SAH的多组学证据
为了确定我们结论的可靠性，我们进行了荟萃分析，纳入了来自MR和重复MR分析的结果。IVW和Egger荟萃分析，在重复MR分析的支持下，表明可能存在因果关系（ORIVW = 1.08，95% CI 1.03–1.14；OREgger = 1.16，95% CI 1.04–1.29）（图5A，B）。在复制研究中，我们也确认FGF23增加了SAH的风险（OR = 1.61，95% CI: 1.14–2.27）（表S12）。在pQTL数据集中未发现FGF23的全基因组显著顺式QTLs；因此，共定位信号（PPH4 = 0.74）是由反式作用变异驱动的（表S12）。为了可视化这一共享的遗传信号，我们生成了一个GWAS–pQTL散点图，展示了共享SNP之间的关联强度一致性（图S2）。图5（在图形查看器中打开） PowerPoint

4 讨论
本研究应用了双向双样本MR分析，系统地评估了循环炎症蛋白、免疫细胞和SAH之间可能的因果关系。我们的研究发现，5种炎症蛋白和22种免疫细胞与SAH表现出因果关联。具体来说，CD6、TGFB-1和TGF-α被认为是保护因素，而FGF23和LIFR则被认为是风险因素。在22种免疫细胞中，10种被归类为风险因素，12种为保护因素。此外，反向MR和施泰格（Steiger）分析未能证明炎症蛋白有显著的因果作用。MR Egger和MR-PRESSO分析未发现多效性，支持我们的主要发现。在免疫细胞表型的研究中，MR-Egger回归显示CD11b对CD33br HLA DR+ CD14dim髓样细胞存在方向性水平多效性的证据，这通过显著的截距得到反映。然而，科克伦Q检验未发现各工具之间的显著异质性，MR-PRESSO全局检验也未检测到任何异常SNP，表明观察到的多效性不太可能由少数极端变异驱动。由于MR-Egger对轻微的、系统性的方向性多效性敏感，即使在没有异质性的情况下也是如此，因此应谨慎解释这一关联，并需要进一步验证。此外，反向MR分析发现SAH与CD14-CD16+单核细胞上的CD64表达可能存在关联。SAH发生后，会触发多种免疫-炎症过程，这与炎症细胞因子的产生和免疫调节分子的释放有关。我们的研究发现了几种与SAH相关的炎症蛋白和免疫细胞。这项研究为理解SAH涉及的分子过程提供了新的见解，并可能为未来的治疗指明潜在靶点。FGF23是一种在磷酸盐代谢中起关键作用的激素，也可能影响铁代谢、红细胞生成、炎症、胰岛素抵抗、蛋白尿和左心室肥大（Kanbay等人，2017；Czaya和Faul，2019）。除了其在磷酸盐代谢中的经典作用外，FGF23还被证明可以直接影响血管和炎症途径。FGF23水平升高可通过降低一氧化氮的生物利用度、增加氧化应激和促进血管通透性来损害内皮功能，这些过程与脑动脉瘤的形成和破裂密切相关（Faul等人，2011）。此外，磷酸盐代谢紊乱会导致血管僵硬和微血管损伤，可能增加SAH的易感性。实验研究进一步表明，FGF23可以在内皮细胞和免疫细胞中激活促炎信号通路，为FGF23与SAH之间的观察到的因果关联提供了生物学依据（Batko等人，2019）。研究表明，血管内治疗后的颅内动脉瘤成功愈合取决于早期血栓组织的成熟和新内膜的形成，这些过程主要由成纤维细胞介导。在大型颅内动脉瘤模型中， coil治疗导致FGF23水平显著升高，峰值出现在第7天（Grüter等人，2023）。一项病例对照研究显示，SAH病例中的FGF23水平高于对照组。在一般人群中，FGF23水平的增加与SAH风险的增加有关，无论其他风险因素如何（S?derholm和Engstr?m，2015）。除了其生物学和流行病学相关性外，FGF23还代表了一个潜在的可药物靶点。为了探索这一可能性，我们评估了从DGIdb中识别出的30种FGF23相关候选药物。其中，西那卡塞特（cinacalcet）作为一种临床确定的钙调剂，在人体研究中一致显示出可以降低循环中的FGF23水平，表明了一条合理的药理学途径来调节FGF23信号（Li等人，2023）。然而，通过西那卡塞特或其他相关物质修改FGF23是否会影响SAH的结果仍然未知，需要在机制模型和受控的临床前研究中进行系统研究。在识别出的显著免疫表型中，T细胞和B细胞表型占主导地位，约占59%。相比之下，单核细胞和髓系细胞表型约占14%，树突状细胞约占9%，自然杀伤（NK）细胞占约4%。这种分布模式突出了免疫细胞在SAH病理生理过程中的关键作用。大量证据表明，动脉瘤SAH后免疫系统的短暂损伤是随后感染的一个重要风险因素（Zhou等人，2017）。一项先前的临床研究发现了继发性SAH风险与免疫介导的疾病之间的关联（Ramagopalan等人，2013）。SAH术后观察到免疫细胞亚群的下降，包括CD3+、CD4+、CD8+ T细胞和NK细胞，这与不良预后相关（Jin等人，2022）。我们的MR分析表明，Treg细胞占T细胞群体的71%，突显了它们在SAH进展中的关键作用。此外，我们的两步孟德尔随机分析显示，CD4调节性T细胞介导了FGF23对SAH的约10.8%的遗传预测效应，表明Tregs是将FGF23信号与SAH易感性联系起来的关键免疫途径。Tregs通过抑制效应T细胞的促炎反应来调节免疫系统（Arce-Sillas等人，2016）。最近的研究表明，Tregs在SAH后迅速浸润大脑，通过分泌白细胞介素-10（IL-10）提供神经保护，抑制神经炎症并减少神经元凋亡（Zhou等人，2023）。另一项研究表明，IL-2治疗可能通过增加Treg细胞的数量来减轻SAH引起的神经炎症（Dong等人，2021）。关于动脉瘤SAH患者的外周血的研究显示，免疫细胞亚群被激活，包括单核细胞和中性粒细胞（Moraes等人，2015）。这些发现强调了先天免疫在SAH中的作用。SAH前髓系细胞的耗竭可能会降低SAH后的血管痉挛发生率和严重程度（Provencio等人，2011）。他的观察与我们的MR结果一致，表明髓系细胞是SAH的一个风险因素。基于之前的研究将免疫细胞与SAH联系起来（Yan和Li，2024），我们的研究采用了双向双样本MR方法全面评估了这些蛋白质和细胞对SAH的影响。此外，我们还进行了重复研究和重要炎症蛋白的共定位分析，提高了我们结果的可靠性。尽管这项研究提供了重要的见解，但仍应承认一些局限性。尽管我们应用了严格的工具选择阈值（p < 1×10^-5）并进行FDR校正，但大量的蛋白质和免疫表型比较不可避免地增加了假阳性发现的可能性。由于免疫细胞特征之间的相关性，这一问题进一步被放大，可能导致依赖性的统计测试。为了降低这些风险，我们实施了多层验证框架，包括重复MR、共定位和多组学收敛，以优先考虑最稳健的关联。此外，中介分析使用的是汇总级别的遗传数据，这限制了我们使用基于重采样的方法（如自助法置信区间）来估计间接效应的能力。因此，报告的中介比例应被视为探索性估计，而不是精确的定量效应。此外，大多数数据集来自欧洲血统的人群，这可能限制了其普遍性，无法完全排除GWAS数据集之间的部分样本重叠。未来需要在不同人群和个体水平的数据中进行研究，以验证和扩展我们的发现。

5 结论
本研究表明，炎症蛋白和免疫细胞在SAH中存在因果联系。多组学分析，包括转录组、共定位和中介MR，确定FGF23是SAH的潜在治疗靶点。这些结果强调了免疫和炎症在SAH发病机制中的重要作用，增强了我们对其炎症和免疫机制的理解，并揭示了其中复杂的遗传因果关系。需要进一步的研究来验证和扩展这些发现。

作者贡献
施星杰（Xingjie Shi）：概念化。张成（Cheng Zhang）：概念化。杨涛（Tao Yang）：验证。孙志明（Zhiming Sun）：数据整理、软件处理。王超（Chao Wang）：撰写——初稿。周陆成（Lucheng Zhou）：调查。侯世强（Shiqiang Hou）：可视化、撰写——审阅和编辑。林宁（Ning Lin）：资金获取、监督。张兰兰（Lanlan Zhang）：撰写——审阅和编辑。

致谢
我们感谢为这项研究提供数据的研究人员。本研究生成并分析的原始数据包含在已发表的文章中，或列在参考文献中的数据仓库中。补充材料随手稿在线发布。资助信息

本研究得到了滁州市卫生健康委员会科研项目（项目编号：CZWJ2024A001）、安徽省教育厅科研基金（项目编号：2024AH040093）以及滁州市科技创新计划（项目编号：2024YF007）的资助。利益冲突

作者声明不存在利益冲突。数据获取声明

支持本研究结果的数据可向相应作者提出合理请求后获取。同行评审

为保证透明度，与本文相关的同行评审文件可在此处查阅：https://doi.org/10.1002/brb3.71485。第二轮评审

编辑决定函
2026/04/27

第一轮评审

编辑决定函
2025/12/01

编辑决定函附件1
2025/12/01

编辑决定函附件2
2025/12/01

评审员2的报告
2025/11/10

评审员2报告附件1
2025/11/10

评审员1的报告
2025/10/14

评审员1报告附件1
2025/10/14