《Journal of Molecular Biology》：Conformational Analysis and Structural Characterization of Furin Inhibitors and Their Enzyme Complexes: Structural Insights into the Role of Cis/Trans Isomerization of the P2′–P3′ Peptide Bond
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研究人员利用核磁共振（NMR）光谱学对两种新型、高效的弗林蛋白酶（Furin）抑制剂的三维结构进行了表征。这两种化合物均属于鲍曼-伯克抑制剂（BBI）家族的环肽。在单环二硫键桥联抑制剂的分析中，揭示了在Ile8-Pro9（P3'-P4'）肽键构型上存在差异的两
研究人员利用核磁共振（NMR）光谱学对两种新型、高效的弗林蛋白酶（Furin）抑制剂的三维结构进行了表征。这两种化合物均属于鲍曼-伯克抑制剂（BBI）家族的环肽。在单环二硫键桥联抑制剂的分析中，揭示了在Ile8-Pro9（P3'-P4'）肽键构型上存在差异的两种构象体（主要的顺式（cis）和次要的反式（trans））。此位置的顺/反异构是BBI家族的一个公认特征。相比之下，第二个具有额外头尾环化的二硫键桥联抑制剂，则仅采用顺式构象，表明头尾环化施加的结构限制可能有效抑制了顺/反异构。值得注意的是，分子动力学（MD）模拟将单环抑制剂的次要反式构象体列为与弗林蛋白酶结合最有利的构型，这对先前关于P3′位置顺式-脯氨酸（cis-Pro）构型对BBI活性至关重要的假设提出了挑战。弗林蛋白酶似乎对此位置的异构体构型选择性较低。这些发现为弗林蛋白酶抑制的结构决定因素提供了新的见解，并强调了环化策略在微调控抑制剂构象和活性方面的潜力。
一、 研究背景、问题与目的
弗林蛋白酶（Furin）是一种生理学上重要的丝氨酸蛋白酶，参与激活多种细胞内底物，如激素、受体和生长因子。其活性与多种炎症性疾病和癌症的发展相关，因此，通过选择性抑制来靶向弗林蛋白酶被认为是治疗感染性和非感染性疾病的一种有前景的策略。然而，开发高效疗法面临挑战，需要兼具高选择性、组织特异性、膜渗透性和蛋白水解稳定性的候选药物。
在抑制剂领域，鲍曼-伯克抑制剂（BBI）家族，特别是其最小成员向日葵胰蛋白酶抑制剂-1（SFTI-1），因其紧凑的β-发夹结构和高效的抑制活性，成为设计新抑制剂的理想模板。SFTI-1及其类似物的活性环中，P2′–P3′位置的Xaa-Pro肽键通常呈现顺式（cis）构型，这被认为是维持其生物活性构象的关键。此前研究（如Fittler等人的工作）表明，将该位置脯氨酸（Pro）突变为丙氨酸（Ala），强制形成反式（trans）构型，会导致对弗林蛋白酶的抑制活性急剧下降，进一步强化了顺式构型至关重要的观点。然而，研究人员在合成高效的弗林蛋白酶抑制剂（如单环抑制剂3）时，通过高效液相色谱（HPLC）观察到了可能对应不同构象体的信号峰，这暗示可能存在先前被忽视的构象异构现象。因此，为了厘清构象与活性的关系，本研究旨在通过核磁共振（NMR）和分子动力学（MD）模拟，深入表征两种新型高效弗林蛋白酶抑制剂（单环3和双环6）的三维溶液结构，并探究其与弗林蛋白酶的结合模式，从而在分子层面阐明其高效抑制活性的结构基础。本论文发表于《Journal of Molecular Biology》。
二、 主要关键技术方法
本研究主要采用了以下关键技术方法：1. 多肽固相合成：使用标准9-芴甲氧羰基（Fmoc）化学法在自动多肽合成仪上合成目标抑制剂肽段。2. 核磁共振（NMR）光谱分析：制备肽段样品，通过一系列二维同核（TOCSY, NOESY）和异核（1H-13C HSQC, 1H-15N HSQC）NMR实验，在自然丰度下完成原子共振峰归属，并收集结构约束（如核奥弗豪泽效应（NOE）距离约束、二面角约束），用于计算三维溶液结构。3. 分子动力学（MD）模拟：将NMR解析出的抑制剂结构用于与弗林蛋白酶（基于已发表的晶体结构构建模型）的对接和长时间的MD模拟，以评估结合稳定性、相互作用和结合自由能。4. 结构计算与验证：利用CNS程序包，通过模拟退火和能量最小化计算三维结构，并使用PROCHECK-NMR和MolProbity进行结构质量验证。
三、 研究结果
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肽段合成：成功合成了单环二硫键桥联抑制剂3和具有额外头尾环化的双环抑制剂6。
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基于NMR数据的抑制剂3和6三维溶液结构评估：NMR分析为抑制剂3两种构象体以及双环抑制剂6提供了可靠的三维结构。
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对抑制剂3的NMR分析证实，其在30°C HPLC图谱中观察到的部分重叠信号对应于两个不同的构象体。主要构象体（占有率~80%）在Ile8–Pro9（P3′–P4′）肽键处呈现顺式（cis）构型，而次要构象体（占有率~20%）在同一位置呈现反式（trans）构型。这两种构象体的整体结构均呈现典型的BBI结合环特征，但反式构象体在结合环的N端区域显示出更高的柔性。
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相比之下，双环抑制剂6在Ile8–Pro9键处仅采用顺式构型，其结构比抑制剂3的任何一种构象体都更为刚性，特别是其结合环的C端部分。
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分子动力学模拟评估抑制剂与弗林蛋白酶的相互作用：
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MD模拟表明，单环抑制剂3的次要反式（trans）构象体与弗林蛋白酶的结合最为稳定，其结合自由能计算值最低。其结合模式与之前基于顺式构型假设的模型不同，主要通过P4′和P5′残基与酶的S4和S5口袋形成关键相互作用。
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抑制剂3的主要顺式（cis）构象体与弗林蛋白酶的结合也较为稳定，但略逊于反式构象体。
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双环抑制剂6（仅顺式构型）与弗林蛋白酶的结合稳定性与抑制剂3的顺式构象体相似。
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作为阴性对照，天然SFTI-1和其单环类似物（已知的弱弗林蛋白酶抑制剂）在模拟中与弗林蛋白酶的结合稳定性显著较差。
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结论：
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抑制剂3溶液中存在顺式和反式构象体的发现，挑战了P2′–P3′位置必须为顺式构型才能有效抑制弗林蛋白酶的传统观点。弗林蛋白酶对该位置的异构体构型似乎选择性较低。
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额外的头尾环化（如抑制剂6）可以有效限制Ile8-Pro9肽键的顺/反异构，迫使分子采取单一构象，这可能有利于提高抑制剂的选择性。
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分子动力学模拟将次要的反式构象体排名为与弗林蛋白酶结合最有利的形式，这为设计新型抑制剂提供了新思路，即不局限于顺式脯氨酸构型。
四、 讨论与结论总结
本研究的讨论整合了上述结果，重点在于重新评估了BBI家族抑制剂中P2′–P3′（Xaa-Pro）肽键构型对活性的影响。研究表明，对于所研究的高效弗林蛋白酶抑制剂，其结合环中Ile8-Pro9（P3′-P4′）肽键的顺/反异构体状态并非活性的绝对决定因素。弗林蛋白酶能够容纳该位置的两种构型，这与先前针对其他蛋白酶（如胰蛋白酶）得出的结论有所不同。特别是，模拟结果显示反式构象体可能具有更高的结合亲和力，这揭示了构象选择性和诱导契合机制在抑制剂-酶相互作用中的复杂性。此外，通过化学修饰（如头尾环化）可以控制该肽键的构象自由度，从而可能优化抑制剂的药代动力学特性。
研究结论部分翻译如下：
对抑制剂3的NMR分析提供了充足的实验数据，用以确定其两种构象体以及双环抑制剂6的可靠三维结构。NMR结果表明，在30°C下，于二硫键桥联单环抑制剂3的HPLC图谱中观察到的两个部分重叠的信号对应于两个不同的构象体。次要构象体具有Ile8–Pro9肽键的反式（trans）构型，而主要构象体则采用顺式（cis）构型。这两种构象的总体结构都呈现典型的BBI结合环特征。双环类似物6仅在Ile8–Pro9键处采用顺式构型。分子动力学模拟显示，抑制剂3的次要反式构象体是弗林蛋白酶最有利的结合剂。这表明，与此前假设相反，P3′位置的反式脯氨酸（trans-Pro）构型可能与弗林蛋白酶有效结合。因此，弗林蛋白酶对此位置异构体构型的耐受性可能比之前认为的要高。额外的头尾环化有效地限制了Ile8-Pro9键的顺/反异构，这为通过构象约束微调控抑制剂活性提供了可能性。
