一个保守的3′UTR茎环结构介导UPF1/eIF4AIII对GABARAPL1 mRNA的调控

《Journal of Molecular Biology》：A conserved 3′UTR stem–loop directs UPF1/eIF4AIII-dependent regulation of GABARAPL1 mRNA

　　

RNA结合蛋白通过与含有顺式调控元件的mRNA非翻译区相互作用，调控mRNA的定位、稳定性和翻译效率。在这些反式调控因子中，RNA解旋酶UPF1是无义介导的mRNA降解等多种mRNA衰减途径的核心因子。当外显子连接复合体位于一个提前终止密码子下游时，会触发NMD。然而，在某些情况下，NMD可以通过涉及3′UTR的机制，以不依赖于EJC的方式被激活。本研究聚焦于GABARAPL1基因的3′UTR，因为先前研究表明该区域在NMD靶向中起关键作用，但其分子机制尚未阐明。研究人员发现，与SC35等典型NMD靶标不同，化学抑制eIF4AIII解旋酶活性并不影响GABARAPL1转录本水平，表明该转录本通过其3′UTR以不依赖于EJC的机制被调控。因此，研究人员探究了GABARAPL13′UTR内是否存在能以UPF1依赖的方式调控mRNA和蛋白水平的顺式调控元件。进一步地，他们鉴定了一个涉及GABARAPL1靶向的、保守的RNA区域（核苷酸364-421），并通过生化分析证明了UPF1和eIF4AIII直接结合于此区域，分析了其溶液中的二级结构，并绘制了蛋白结合位点。通过分子建模补充这些方法，研究表明这个茎环结构具有稳定的整体折叠，但也表现出局部的灵活性和动态行为特性。总之，研究结果支持UPF1和eIF4AIII作为GABARAPL1转录本特异性调控因子的作用，并揭示其3′UTR内一个新的RNA调控元件，为这些因子提供了一个完全出乎意料的结合位点。

研究背景与科学问题

信使RNA（mRNA）是遗传信息从DNA传递到细胞翻译机器的关键中间体。其稳定性的调控对于保证基因表达的保真度和快速适应环境信号至关重要。无义介导的mRNA降解是研究最深入的mRNA监控途径，可消除带有NMD诱发特征的转录本。mRNA的3′非翻译区在转录后基因调控中扮演核心角色，含有多种被RNA结合蛋白识别的顺式调控元件。RNA二级结构是决定mRNA命运的关键因素，能够影响调控元件的可及性和降解机器因子的招募。RNA解旋酶UPF1是NMD中的核心因子，它倾向于结合单链RNA，并在多种mRNA衰减途径中发挥作用。

尽管UPF1在经典EJC依赖的NMD中作用明确，但越来越多的证据表明存在不依赖于EJC的替代性NMD分支，其机制尚不完全清楚。GABA_A受体相关蛋白样蛋白1是自噬相关ATG8家族成员，在细胞内受体运输和自噬囊泡形成中起关键作用。先前研究表明，GABARAPL1的转录水平受UPF1和eIF4AIII调控，且这种调控依赖于其3′UTR，但其具体的分子机制和顺式调控元件尚未被阐明。本研究旨在探究GABARAPL1mRNA转录后调控的结构和分子决定因素，特别是其3′UTR在介导不依赖EJC的降解途径中的作用，以增进对mRNA通过3′UTR途径调控的理解。

研究方法概述

本研究主要使用了以下关键技术方法：研究人员利用人肺腺癌A549细胞系进行细胞培养、转染和处理。通过小干扰RNA（siRNA）敲低UPF1或eIF4AIII的表达，并使用eIF4AIII-IN-1化学抑制剂处理细胞。构建了一系列包含GABARAP或GABARAPL1不同3′UTR片段的绿色荧光蛋白报告基因质粒。通过实时定量聚合酶链式反应和蛋白质印迹法分别分析mRNA和蛋白水平。通过电泳迁移率变动分析，使用纯化的重组UPF1和eIF4AIII蛋白，检测它们与合成的GABARAPL13′UTR RNA片段的体外结合。利用RNA免疫沉淀技术验证UPF1与报告基因转录本在细胞内的结合。通过Mfold和Vfold等服务器对GABARAPL13′UTR进行RNA二级结构预测。对关键茎环结构（SL3）进行了全原子分子动力学模拟，以分析其结构稳定性和构象动力学。最后，使用核糖核酸酶T1和A/T1对Cy5标记的SL3 RNA进行酶解足迹分析，以确定UPF1和eIF4AIII的结合位点。

研究结果

UPF1和eIF4AIII调控GABARAPL1转录本水平但不依赖eIF4AIII的解旋酶活性

研究证实，在A549细胞中敲低UPF1或eIF4AIII会导致包含GABARAPL13′UTR的GFP报告基因转录本水平显著升高，而对包含GABARAP3′UTR的转录本无影响。使用eIF4AIII特异性抑制剂eIF4AIII-IN-1处理细胞，可增加典型NMD靶标SC35的转录水平，但GABARAPL1的转录本水平不受影响，表明eIF4AIII的ATP酶/解旋酶活性并非调控GABARAPL1mRNA所必需。此外，对GABARAPL13′UTR区域的剪接分析未检测到剪接事件。这些结果表明，GABARAPL1mRNA的调控是一种不依赖于外显子连接复合体的机制。

GABARAPL1 3′UTR近端调控元件介导其mRNA靶向

通过生物信息学分析发现，GABARAPL13′UTR含有多个UPF1和eIF4AIII的结合位点，而其同源基因GABARAP的3′UTR中则很少。为了定位关键的顺式调控区域，研究人员将GABARAPL13′UTR分割成三段（A、B、C）并构建报告基因。结果显示，包含前900个核苷酸（A和B段）的报告基因，其mRNA和蛋白表达水平与全长3′UTR一样受到显著抑制，而主要包含最后370个核苷酸的C段则无此抑制效应。这提示GABARAPL13′UTR的调控功能位于其前三分之二区域。

鉴定GABARAPL1转录本3′UTR内的结构元件

对GABARAPL13′UTR的二级结构预测识别出六个高度保守的茎环结构。为验证其功能，研究人员构建了分别缺失这六个茎环的报告基因质粒。结果显示，缺失前五个茎环中的任何一个，都能导致报告基因mRNA和蛋白水平显著上升。其中，茎环3在多个预测模型中反复出现，并与UPF1和eIF4AIII的结合位点重叠。电泳迁移率变动分析进一步证实，纯化的UPF1蛋白能与所有六个RNA片段结合，但与SL3的结合更强；而eIF4AIII则特异性结合SL3片段。这表明SL3是UPF1和eIF4AIII体外结合的关键区域。

eIF4AIII和UPF1识别RNA茎环内的共同位点

研究人员对SL3 RNA片段（核苷酸364-421）进行了深入的结构表征。分子动力学模拟表明，SL3在整体上保持一个稳定的茎环构象，但其顶部的UAUUUUU环区和茎部基底区域表现出局部灵活性。酶解足迹分析揭示了关键发现：UPF1和eIF4AIII并非结合在最初假设的茎环顶端，而是共同结合在SL3茎部基底的单链区域，并且两者的结合是相互排斥的。RNA免疫沉淀实验证明，在细胞中，删除SL3区域会严重损害UPF1与GABARAPL13′UTR报告基因转录本的结合，而删除作为对照的SL6区域则影响较小。这直接证明了SL3茎环结构对于UPF1在体内的招募至关重要。

讨论与结论

本研究表明，GABARAPL1mRNA的降解通过一条不依赖于EJC的途径进行，其3′UTR内的一个保守茎环结构（SL3）是关键的顺式调控模块。该结构具有稳定的整体折叠和局部的动态特性，为UPF1和eIF4AIII提供了一个意想不到的结合位点。这两种解旋酶竞争性地结合SL3茎部的同一单链区域，其结合是相互排斥的。SL3与其他4个茎环结构共同构成一个调控网络，协调了解旋酶的招募和转录本的降解。这项研究揭示了RNA二级结构在介导不依赖EJC的mRNA衰减中的重要作用，扩展了当前对NMD（无义介导的mRNA降解）和UPF1功能的理解，为理解ATG8家族成员间差异表达的转录后调控机制提供了新视角。论文最终结论为：研究结果支持UPF1和eIF4AIII作为GABARAPL1转录本特异性调控因子的作用，并揭示其3′UTR内一个新的RNA调控元件，为这些因子提供了一个完全出乎意料的结合位点。