通过增强SK通道恢复线粒体Ca2+和氧化还原稳态来挽救HFpEF心肌细胞的Ca2+循环

《Journal of Molecular and Cellular Cardiology》：Restoration of mitochondrial Ca2+ and redox homeostasis by enhancement of SK channels rescues Ca2+ cycling in HFpEF cardiomyocytes

　　

摘要：射血分数保留型心力衰竭（Heart failure with preserved ejection fraction, HFpEF）占所有心力衰竭病例的近一半。除舒张功能不全外，HFpEF患者有显著的猝死风险，提示恶性室性心律失常的潜在贡献。近期，小电导钙激活钾（small conductance Ca2+-activated K+, SK）通道已成为线粒体依赖性有害活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生的潜在调节因子。本研究旨在评估SK通道增强作为逆转肥胖ZSF1大鼠HFpEF模型心室肌细胞中促心律失常的细胞内Ca2+循环以及线粒体氧化还原和Ca2+稳态的新策略。研究人员在来自瘦型和肥胖型ZSF1大鼠的心室肌细胞中进行Ca2+和ROS的共聚焦成像。分别使用靶向线粒体基质的生物传感器mtRCamp1h和MLS-HyPer7测量线粒体基质Ca2+和ROS水平。通过腺病毒过表达大鼠SK2通道类型和药理学激活剂NS309及Riluzole增强SK通道活性。来自肥胖ZSF1大鼠的心室肌细胞，在周期性起搏和暴露于β-肾上腺素能激动剂异丙肾上腺素时，显示出促心律失常的舒张期肌质网（sarcoplasmic reticulum, SR）Ca2+释放增加、线粒体ROS产生升高以及显著的线粒体Ca2+超载。SK通道增强可防止线粒体Ca2+超载，减少ROS释放，并通过抑制舒张期SR Ca2+释放来改善胞质Ca2+循环。这些发现将SK通道激活确定为HFpEF中一种潜在的抗心律失常治疗策略，其通过限制线粒体Ca2+摄取、减少氧化应激和稳定细胞内Ca2+动力学发挥作用。

研究背景与问题

射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）是日益增长的公共卫生挑战，占所有心衰病例近半，但其有效治疗方案有限。与射血分数降低型心衰（HFrEF）不同，针对HFrEF的多数疗法在改善HFpEF患者预后方面失败，凸显了对新策略的需求。HFpEF患者除舒张功能障碍外，还面临显著的猝死风险，提示恶性室性心律失常的可能作用。近期研究表明，小电导钙激活钾（SK）通道，特别是位于心肌细胞内质网膜和线粒体内膜（inner mitochondrial membrane, IMM）的SK通道，是调节线粒体依赖性有害活性氧（ROS）产生的潜在靶点。在HFrEF、肥厚和糖尿病心肌病模型中，常观察到线粒体钙（mito-[Ca²⁺]）减少，而作为人类HFpEF模型的肥胖ZSF1大鼠却表现出心室肌细胞中线粒体基质[Ca²⁺]的显著增加。这种线粒体钙超载在HFpEF发病机制中的作用尚不清楚。线粒体不仅是ATP的主要生产者，也是ROS的主要来源，ROS可破坏细胞内Ca²⁺处理，而线粒体中失调的Ca²⁺稳态又与ROS增加相关。研究人员之前发现，线粒体钙水平过低或过高都会升高ROS，导致兰尼碱受体（ryanodine receptor, RyR2）过度氧化，增强舒张期肌质网（SR）Ca²⁺渗漏，促进收缩功能障碍和心律失常。因此，恢复线粒体钙平衡可能改善ATP合成和兴奋-收缩耦联。然而，由于钙与ROS之间的非线性关系，靶向线粒体钙积累的最佳策略尚未建立。基于此背景，本研究旨在探究SK通道增强能否作为一种新策略，逆转HFpEF心肌细胞中促心律失常的细胞内Ca²⁺循环以及线粒体氧化还原和Ca²⁺稳态异常。该研究论文发表于《Journal of Molecular and Cellular Cardiology》。

关键技术方法

研究人员主要采用了以下关键技术：1. 动物模型：使用肥胖ZSF1大鼠作为HFpEF模型，并通过超声心动图确认其HFpEF表型（左心室质量增加、舒张功能障碍、射血分数保留）。同时使用了瘦型ZSF1大鼠和Sprague Dawley大鼠作为对照。2. 细胞分离与处理：急性分离大鼠心室肌细胞，并进行短期培养。通过腺病毒感染技术在肌细胞中过表达或敲低特定蛋白（如SK2、线粒体钙生物传感器mtRCamp1h、线粒体ROS生物传感器MLS-HyPer7、显性负性线粒体钙单向转运体（dominant negative MCU, dnMCU））。3. 荧光成像技术：使用共聚焦显微镜进行胞质Ca²⁺瞬变成像（Fluo-4 AM）、线粒体基质Ca²⁺成像（mtRCamp1h）和线粒体ROS成像（MLS-HyPer7）。通过快速应用咖啡因评估SR Ca²⁺含量。4. 电生理学与生物化学分析：使用膜片钳技术记录动作电位时程。通过蛋白质印迹法（Western blot）和免疫共沉淀分析心脏组织中钙处理蛋白（如NCX1、SERCA2a、磷酸受磷蛋白（phospholamban, PLB）、RyR2）、线粒体蛋白（MCU、MICU1）及SK2的表达与翻译后修饰（磷酸化、氧化）。使用抗DNP抗体通过氧化蛋白印迹评估RyR2氧化状态。5. 药理学干预：使用SK通道增强剂（NS309、Riluzole）、MCU抑制剂（Ru360）、线粒体靶向ROS清除剂（MitoTEMPO）、线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore, mPTP）抑制剂（环孢素A, cyclosporine A）以及SK通道阻断剂（蜂毒明肽, apamin）进行功能验证。6. 统计学分析：使用分层检验、Student's t检验、Mann-Whitney检验、Kruskal-Wallis检验等进行数据分析。

研究结果

3.1. ZSF1肥胖大鼠心室心肌细胞中异常的细胞内Ca²⁺处理

在基础状态下，肥胖与瘦型ZSF1心肌细胞的Ca²⁺瞬变幅度、舒张末Ca²⁺水平和衰减速率无显著差异，但肥胖细胞Ca²⁺瞬变半宽显著更长。咖啡因诱导的Ca²⁺瞬变衰减在肥胖细胞中更慢，提示钠钙交换体（Na⁺/Ca²⁺exchanger, NCX1）功能降低。在β-肾上腺素能激动剂异丙肾上腺素（isoproterenol, ISO）刺激下，肥胖心肌细胞出现自发性肌质网Ca²⁺释放，表现为全细胞范围的Ca²⁺波，导致收缩期Ca²⁺瞬变幅度降低、舒张末Ca²⁺信号增加，且Ca²⁺波潜伏期缩短、频率增加。蛋白质印迹分析显示，肥胖心脏中NCX1表达降低，而SERCA2a、PLB和RyR2表达无变化；PLB在PKA位点Ser-16的磷酸化降低，RyR2在两个关键磷酸化位点（PKA-Ser-2808和CaMKII-Ser-2814）的磷酸化无变化，但免疫共沉淀的RyR2显示过度氧化。结论：在HFpEF中，细胞内Ca²⁺稳态异常主要由NCX1表达和功能降低以及氧化的RyR2通道过度活跃导致。

3.2. ZSF1肥胖大鼠心室心肌细胞中线粒体氧化还原和Ca²⁺稳态的改变

使用线粒体靶向H₂O₂生物传感器MLS-HyPer7发现，肥胖心肌细胞中线粒体ROS产生增加。使用线粒体基质Ca²⁺传感器mtRCamp1h发现，在ISO刺激和起搏下，肥胖细胞线粒体基质[Ca²⁺]在静息和峰值时均显著高于瘦型细胞。蛋白质印迹分析显示，肥胖大鼠和人类舒张功能障碍患者心脏中线粒体钙摄入调节蛋白1（mitochondrial calcium uptake 1, MICU1）表达降低，导致MICU1/MCU比值显著降低。使用MCU抑制剂Ru360或线粒体靶向ROS清除剂MitoTEMPO可减少肥胖细胞中自发性Ca²⁺波的发生。在肥胖细胞中过表达显性负性MCU（dnMCU）可降低线粒体Ca²⁺摄取，并随之减少线粒体ROS产生。结论：HFpEF中线粒体钙超载和ROS产生增加，与MICU1/MCU比值降低有关，这导致了异常的SR Ca²⁺释放。

3.3. SK通道调节线粒体Ca²⁺含量

在分离的线粒体膜片（mitoplast）中，SK通道增强剂NS309可诱导外向整流电流。在对照心肌细胞中，过表达大鼠SK2（rSK2）通道可降低ISO刺激和起搏下的线粒体Ca²⁺积累，而敲低SK2则增加其积累。结论：线粒体SK（mito-SK）通道的活性可调节线粒体基质Ca²⁺的积累。

3.4. 药理学增强SK通道减少线粒体Ca²⁺和ROS

用SK通道增强剂NS309或Riluzole预处理肥胖ZSF1心肌细胞，可显著减轻ISO刺激和起搏下引起的线粒体Ca²⁺超载，并将线粒体ROS水平降至与瘦型细胞相似。NS309的作用不伴随线粒体膜电位去极化。使用mPTP抑制剂环孢素A可减弱SK2过表达或NS309处理对线粒体Ca²⁺积累的抑制作用。结论：SK通道增强剂通过激活环孢素A敏感的线粒体Ca²⁺外排途径来减少线粒体钙积累和ROS产生。

3.5. 药理学增强SK通道抑制HFpEF心肌细胞中的致心律失常自发性Ca²⁺波

NS309和Riluzole处理可显著降低ISO刺激的肥胖心肌细胞中自发性Ca²⁺波的频率和舒张末Ca²⁺信号。Riluzole还能改善细胞缩短，增加Ca²⁺瞬变幅度，并缩短动作电位时程。Riluzole处理降低了RyR2的氧化水平。在存在膜不通透的SK通道阻断剂蜂毒明肽的情况下，Riluzole仍能有效抑制自发性Ca²⁺波，提示其抗心律失常作用主要由线粒体SK通道介导。膜片钳实验显示肥胖与瘦型细胞的SK电流无差异。结论：SK通道激活可稳定HFpEF中的细胞内Ca²⁺处理，其抗心律失常作用主要归因于线粒体SK通道的激活。

讨论与结论总结

研究人员在讨论中指出，HFpEF与HFrEF在心衰机制上存在差异。本研究发现，在ZSF1肥胖大鼠HFpEF模型中，心肌细胞在β-肾上腺素能刺激下出现异常的细胞内Ca²⁺处理，其特征是舒张期RyR2介导的SR Ca²⁺渗漏增加，这与RyR2过度氧化有关，而其磷酸化状态未改变。与HFrEF中NCX1表达和功能通常增加不同，HFpEF中NCX1表达和功能降低。更重要的是，研究揭示了HFpEF中线粒体功能的独特改变：线粒体钙超载和ROS产生增加。这不同于HFrEF中常见的线粒体钙减少。分子机制上，HFpEF大鼠和人类患者心脏中MICU1表达降低，导致MICU1/MCU比值下降，从而增强了MCU复合物的活性，促进了线粒体钙超载。这与HFrEF中报道的MICU1/MCU比值增加形成对比。

研究首次在HFpEF模型中测试了SK通道的功能和靶向价值。SK通道增强剂（NS309和Riluzole）能有效降低HFpEF心肌细胞中的线粒体钙超载和过度ROS产生，其机制涉及激活环孢素A敏感的线粒体钙外排途径（如mPTP的低电导状态开放）。线粒体SK通道的激活进而减少了RyR2氧化，抑制了致心律失常的舒张期SR Ca²⁺释放，并改善了胞质Ca²⁺循环。值得注意的是，尽管Riluzole也能影响肌膜SK通道和晚钠电流，但其在蜂毒明肽存在时仍能抑制Ca²⁺波，表明其核心益处源于线粒体SK通道的激活。这些发现揭示了HFpEF中线粒体钙调节的独特性，并确立了增强线粒体SK通道活性作为通过恢复线粒体Ca²⁺和氧化还原稳态来改善细胞内Ca²⁺处理的新治疗策略。

研究结论翻译

我们的研究结果表明，在HFpEF大鼠心脏中MICU1/MCU比值降低，这与线粒体Ca²⁺摄取增加有关。值得注意的是，虽然已有报道称MICU1在人类HFrEF中表达上调，但我们在ZSF1肥胖大鼠HFpEF模型中的数据则显示出相反的模式。这些观察结果表明，在这两种形式的心力衰竭中，线粒体Ca²⁺处理可能受到不同的调控。因此，旨在增强线粒体Ca²⁺摄取的策略可能对HFrEF有益，但可能会通过加剧线粒体Ca²⁺超载而对HFpEF产生不利影响。因此，无论是通过药理学方法还是通过改变MCU复合物的化学计量来抑制MCU介导的Ca²⁺流入线粒体，都可能代表一种有前景的治疗策略，以减轻HFpEF中的线粒体Ca²⁺超载。然而，MCU功能的复杂、亚基依赖性调节以及线粒体Ca²⁺与线粒体ROS产生之间的非线性关系，使得这种方法不那么直接。

或者，调节基质Ca²⁺的间接方法可能提供更优越的治疗潜力。我们的数据将线粒体内膜中电压非依赖性、钙门控的SK通道确定为调节线粒体钙水平的有希望的靶点。药理学SK通道增强剂，如NS309和Riluzole，增加了通道对Ca²⁺的敏感性，从而限制了HFpEF心肌细胞中线粒体Ca²⁺的积累并减少了ROS的产生。这稳定了细胞内Ca²⁺循环并抑制了促心律失常的舒张期SR Ca²⁺释放。这些发现支持SK通道激活作为一种新策略，以恢复线粒体功能和细胞内Ca²⁺稳态，可能缓解HFpEF中的应激不耐受和应激诱发的室性心律失常。