TRPM8依赖的L-薄荷醇保护作用减轻小鼠心室肌细胞脂质过载诱导的钙失调和线粒体功能障碍

《Journal of Molecular and Cellular Cardiology》：TRPM8-dependent protective effects of L-menthol attenuates lipid overload-induced calcium dysregulation and mitochondrial dysfunction in mouse ventricular myocytes

　　

肥胖是慢性疾病的主要危险因素，包括糖尿病和心血管疾病（CVD），后者仍是全球主要的死亡原因。尽管L-薄荷醇已被报道具有心脏保护作用，但其机制尚不清楚。因此，研究人员检测了瞬时受体电位褪黑素8（TRPM8）在脂质过载诱导的心脏功能障碍中的作用，并测试了L-薄荷醇是否通过TRPM8发挥作用。在高脂饮食（HFD）12周后，小鼠心室肌细胞中TRPM8蛋白表达显著降低。在体内，L-薄荷醇减轻了雄性小鼠的心脏损伤，这些保护作用在TRPM8敲低后基本消失，表明其机制依赖于TRPM8。机制研究表明，L-薄荷醇通过TRPM8/GRP75/VDAC1相关通路维持线粒体Ca2+稳态，从而限制脂质过载期间的线粒体功能障碍和凋亡。此外，脂质过载降低了TRPM8在C707调节位点的S-棕榈酰化，减少了TRPM8蛋白稳定性。zDHHC13的下调可能导致这种S-棕榈酰化的缺失，而L-薄荷醇有助于维持TRPM8的S-棕榈酰化和蛋白表达。总之，这些结果支持L-薄荷醇通过依赖TRPM8的机制对脂质过载诱导的心脏损伤产生保护作用，并表明TRPM8相关信号传导可能代表一个潜在的治疗靶点。

该研究论文题为《TRPM8-dependent protective effects of L-menthol attenuates lipid overload-induced calcium dysregulation and mitochondrial dysfunction in mouse ventricular myocytes》，由Xiang Sun、Qirui Ding、Yuyan Zhou等学者合作完成，探讨了L-薄荷醇在脂质过载诱导的心肌损伤中的保护机制，相关成果发表于《Journal of Molecular and Cellular Cardiology》。

研究背景与意义

肥胖作为糖尿病和心血管疾病（CVD）的主要危险因素，已成为全球健康的重大威胁。在寒冷地区，居民常因维持体温能量需求高而偏好高脂高热量饮食，长期摄入易导致肥胖和胰岛素抵抗，进而通过高血压、动脉粥样硬化及心肌细胞代谢失调等多重机制促进心脏功能障碍。过量脂质在心脏蓄积可诱发心肌肥厚、收缩与舒张功能障碍及线粒体损伤，其病理机制涉及脂毒性、炎症、氧化应激、凋亡及自噬相关损伤，但具体分子机制仍未完全阐明，有效治疗策略亟待探索。瞬时受体电位褪黑素8（TRPM8）作为一种非选择性Ca²⁺通透性通道，除参与冷感觉外，还表达于棕色脂肪组织和血管系统等非直接暴露于外界环境的组织中，提示其可能参与肥胖预防、葡萄糖稳态及心血管调节。L-薄荷醇作为TRPM8激动剂，虽被报道可促进棕色脂肪产热并改善血管功能，但其在心肌细胞中的作用，尤其是在脂质过载诱导的心脏功能障碍中的角色尚不明确。心脏作为高耗能器官，线粒体脂肪酸氧化提供了超过三分之二的功能所需ATP，线粒体钙信号对代谢调节至关重要，而脂质过载导致的代谢紊乱会破坏钙稳态，引发线粒体功能障碍和心肌细胞死亡。因此，阐明脂质过载如何影响线粒体钙稳态及诱导心肌细胞凋亡具有重要科学意义。

关键技术方法

研究人员采用成年雄性C57BL/6小鼠构建高脂饮食（HFD）模型，通过灌胃给予L-薄荷醇干预；分离新生小鼠心室肌细胞（NMVCs）进行体外实验，利用siRNA技术沉默TRPM8或GRP75基因表达。通过超声心动图评估心脏功能，全细胞膜片钳记录TRPM8电流密度，Western blotting检测蛋白表达，免疫共沉淀（Co-IP）结合质谱分析鉴定TRPM8相互作用蛋白，分子对接与粗粒度分子动力学模拟探究蛋白相互作用及膜环境效应，荧光探针检测胞质与线粒体Ca²⁺浓度、线粒体膜电位及活性氧（ROS）水平，Seahorse XF细胞线粒体/糖酵解压力测试评估呼吸功能，透射电子显微镜观察线粒体超微结构，并通过酰基生物素交换（ABE）试验检测TRPM8的S-棕榈酰化修饰。

研究结果

1. 1.
   脂质过载与TRPM8表达降低
   研究人员发现HFD喂养12周的小鼠体重显著增加，心脏重量与胫骨长度比值升高，血清胰岛素、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）及低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平升高，Oil Red O染色证实心脏和肝脏出现明显脂质过载。Western blot结果显示，HFD组小鼠心脏及棕榈酸（PA）处理的NMVCs、AC16人心肌细胞、H9C2大鼠心肌母细胞中TRPM8蛋白表达均显著降低，表明脂质过载与心肌细胞TRPM8表达下调密切相关。
2. 2.
   L-薄荷醇对TRPM8表达及电流密度的影响
   亚细胞分离与免疫荧光显示TRPM8主要富集于肌浆网（SR），并与SR标记物SERCA2a共定位。HFD喂养及PA处理导致心肌细胞TRPM8蛋白表达降低，而L-薄荷醇干预可显著逆转这一趋势。全细胞膜片钳记录显示，PA处理降低HEK293T细胞中TRPM8的电流密度，L-薄荷醇则能恢复该电流，提示L-薄荷醇可缓解脂质过载对TRPM8表达及功能的抑制。
3. 3.
   L-薄荷醇改善心脏功能的TRPM8依赖性
   超声心动图显示，HFD喂养小鼠射血分数（EF）、短轴缩短率（FS）降低，左心室舒张末期内径（LVIDd）及收缩末期内径（LVIDs）增大，心肌组织出现结构紊乱、纤维化及细胞肥大，同时伴随钙瞬变幅度降低、衰减时间延长、ROS生成增加、抗氧化酶SOD活性降低、MDA水平升高及NOX2/NOX4表达上调，TUNEL阳性细胞及促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3表达增加，抗凋亡蛋白Bcl-2减少。L-薄荷醇干预可显著改善上述指标，但在心脏特异性TRPM8敲低（AAV9-shTRPM8）小鼠中，L-薄荷醇的保护作用基本消失，证实其功能依赖于TRPM8。
4. 4.
   TRPM8与GRP75-VDAC1复合物及ER-线粒体通讯
   通过Co-IP联合质谱分析及GO、KEGG富集分析，研究人员发现TRPM8相互作用蛋白主要富集于蛋白结合、ATP依赖的分子伴侣活性等功能，且三羧酸循环（TCA）是最显著富集的通路。分子对接预测TRPM8与葡萄糖调节蛋白75（GRP75）存在潜在相互作用界面，免疫荧光与Co-IP进一步证实TRPM8与GRP75、电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）存在关联并形成复合物，而PA处理削弱了这种结合，提示TRPM8可能通过GRP75-VDAC1轴参与内质网（ER）-线粒体通讯。
5. 5.
   L-薄荷醇改善线粒体功能的TRPM8依赖性
   研究人员通过Fluo-4和Rhod-2荧光成像分别检测胞质Ca²⁺（[Ca²⁺]_c）和线粒体Ca²⁺（[Ca²⁺]_m），发现PA处理显著增加两者水平，L-薄荷醇则以TRPM8依赖方式减轻该升高。JC-1染色显示PA降低线粒体膜电位，减少ATP含量及氧消耗率（OCR），增加自噬体和自溶酶体形成及线粒体自噬相关蛋白（p62、LC3、PINK1、Parkin、BNIP3、NIX）表达，透射电镜观察到线粒体肿胀、嵴断裂及自噬体增多，而L-薄荷醇可逆转这些变化，且TRPM8敲低后上述保护作用消失。GRP75敲低同样消除了L-薄荷醇对线粒体钙稳态、膜电位、ATP生成、呼吸功能及自噬/线粒体自噬的改善作用，表明GRP75是TRPM8下游的关键介导分子。
6. 6.
   L-薄荷醇维持TRPM8 S-棕榈酰化及蛋白稳定性
   利用CSS-Palm v2.0算法预测TRPM8存在C587和C707两个潜在S-棕榈酰化位点。ABE试验显示，S-棕榈酰化抑制剂2-溴棕榈酸酯（2-BP）降低TRPM8 S-棕榈酰化水平及蛋白表达，C707突变而非C587突变显著削弱L-薄荷醇对TRPM8 S-棕榈酰化的维持作用。PA处理降低TRPM8 S-棕榈酰化及蛋白水平，L-薄荷醇可逆转该效应。分子动力学模拟显示TRPM8跨膜区与膜环境密切相关，胆固醇优先聚集于C707区域附近，分子对接支持L-薄荷醇与TRPM8 C707区域的相互作用模型。进一步研究发现，脂质过载下调zDHHC家族成员zDHHC13的mRNA及蛋白表达，zDHHC13过表达增加TRPM8 S-棕榈酰化及蛋白水平，且与C707位点相关，Co-IP证实zDHHC13与TRPM8存在相互作用；zDHHC13敲低则降低TRPM8 S-棕榈酰化及蛋白表达，并消除L-薄荷醇的保护作用，表明zDHHC13是调控TRPM8 S-棕榈酰化的关键酶。

结论与讨论

该研究阐明L-薄荷醇通过依赖TRPM8的机制保护心肌细胞抵抗脂质过载损伤。具体机制为：HFD诱导的脂质蓄积抑制zDHHC13表达，导致TRPM8在C707位点的S-棕榈酰化减弱，降低TRPM8蛋白稳定性及表达；L-薄荷醇可减轻脂质过载对TRPM8 S-棕榈酰化的抑制作用，增加TRPM8稳定性及表达，并促进TRPM8/GRP75/VDAC1复合物形成，从而维持线粒体钙稳态，改善线粒体功能，最终减轻小鼠心室肌细胞的自噬和凋亡。该研究揭示了脂质过载致心脏损伤的TRPM8中心调控机制，为心肌脂毒性的防治提供了新的潜在靶点。